DB33/T 994-2015 西瓜品種枯萎病抗性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范.pdf

ICS 65 020 B 15 DB33 浙江省 地方標(biāo)準(zhǔn) DB33 T 994 2015 西瓜品種枯萎病抗性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范 Technical specification for evaluating resistance of watermelon against fusarium wilt disease 2015 09 25 發(fā)布 2015 10 25 實(shí)施 浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布 DB33 T 994 2015 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)按照 GB T 1 1 2009給出的規(guī)則編寫 本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省 農(nóng)業(yè)廳提出 本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省種植業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)研究所 浙江省農(nóng)藥檢定管理所 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人 王漢榮 楊桂玲 王連平 方麗 陸劍飛 孫彩霞 DB33 T 994 2015 1 西瓜品種枯萎病抗性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范 1 范圍 本 標(biāo)準(zhǔn) 規(guī)定了 西瓜品種枯萎 病抗 性評(píng)價(jià)技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義 鑒定方法 病情 調(diào)查與判定 本 標(biāo)準(zhǔn) 適用于 西瓜品種 枯萎病抗性鑒定和抗性評(píng) 定 2 術(shù)語(yǔ)和定義 下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本 文件 2 1 抗病性 disease resistance 植物所具有 的能夠克服或減輕病原物致病作用的可遺傳性狀 2 2 抗性評(píng)價(jià) resistance evaluation 根據(jù)采用的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)判別植物對(duì)特定病害反應(yīng)程度和抵抗水平的描述 2 3 致病性 pathogenicity 病原物所具有的破壞寄主和引起病變的能力 2 4 病情級(jí)別 disease rating 人為定量植物個(gè)體或群體發(fā)病程度的數(shù)值化描述 2 5 病原分離物 pathogen isolate 采用人工方法從植物發(fā)病部位分離獲得的 在特定環(huán)境條件下培養(yǎng)的病原物 2 6 接種體 inoculum 用于接種以引起病害的病原物或病原物 的一部分 DB33 T 994 2015 2 2 7 接種液 inoculum suspension 用于接種的 含有接種體的懸浮液 2 8 發(fā)病率 rate of infected 發(fā)病西瓜 植株數(shù) 占總西瓜 植株數(shù) 的百分率 2 9 病情指數(shù) disease index DI 通過(guò)對(duì)植物個(gè)體發(fā)病程度 病情級(jí)別 數(shù)值的計(jì)算獲得的群體發(fā)病程度的數(shù)值化描述形式 是描述 發(fā)病嚴(yán)重度的綜合指標(biāo) 3 鑒定方法 3 1 基本設(shè)備 恒溫箱 超凈工作臺(tái) 高壓滅菌鍋 冰箱 可 控溫的溫室 溫度保持在 20 28 塑料 盆 鋁 鍋 電爐 培養(yǎng)皿 試管 剪 刀 鑷 子 廣口瓶 酒精燈 濾紙 三角瓶 恒 溫 振蕩 箱培養(yǎng)等 3 2 培養(yǎng)基制作 3 2 1 PDA 培養(yǎng)基 配方為馬 鈴薯 200 g 葡萄糖 20 g 瓊脂 17 g 加蒸餾水至 1 000 ml 按培養(yǎng)基配方稱取去皮 馬 鈴 薯 200 g 切成小塊放入鍋中 加水 1 000 ml 在加熱器上加熱至沸騰 維持 30 min 用 2層紗布趁熱在 量杯上過(guò)濾 棄濾渣 取濾液補(bǔ)充水分到 1 000 ml 把濾液放入鍋中 加入葡萄糖 20 g 瓊脂 17 g 然 后放在石棉網(wǎng)上 小火加熱 并用玻 璃 棒不斷攪拌 待瓊脂完全溶解后 再補(bǔ)充水分至 1 000 ml 調(diào) pH 值至 6 8 7 0 將配制的培 養(yǎng)基分裝入試管或 500 ml三角瓶?jī)?nèi) 在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞或泡 沫塑料塞后 再在塞 子 外包一層牛皮紙 用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱 組別 配制日期 試管 的 分裝量為 其 高度的 1 5 滅菌后制成斜面 三角瓶 的 分裝量以不超過(guò)其容積的一半為宜 滅菌后 倒入滅菌培養(yǎng)皿 制成平板培養(yǎng)基 3 2 2 PL 液體培養(yǎng)基 配方為馬鈴薯 200 g 乳糖 20 g 加蒸餾水至 1 000 ml 按培養(yǎng)基配方稱取去皮 馬 鈴薯 200 g 切成 小塊放入鍋中 加水 1 000 ml 在加熱器上加熱至沸騰 維持 30 min 用 2層紗布趁熱在量杯上過(guò)濾 棄濾渣 取濾液補(bǔ)充水分到 1 000 ml 把濾液放入鍋中 加入 乳糖 20 g 用玻 璃 棒攪拌后放在石棉網(wǎng)上 小火加熱至沸騰 再補(bǔ)充水分至 1 000 ml 將配制的培養(yǎng)基分裝入 500 ml三角瓶?jī)?nèi) 在三角燒瓶口上塞 上棉塞或泡沫塑料塞后 再在塞 子 外包一層牛皮紙 用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱 組別 配制日期后 濕熱 滅菌 三角瓶 的 分裝量以不超過(guò)其容積的一半為宜 3 2 3 綠豆液體培養(yǎng)基 DB33 T 994 2015 3 配方為綠豆 40 g 氯化鈉 8 g 加蒸餾水至 1 000 ml 按培養(yǎng)基配方稱取 綠豆 40 g 放入鍋中 加 蒸餾 水 1 000 ml 在加熱器上加熱至沸騰 維持 30 min 用 2層紗布趁熱在量杯上過(guò)濾 棄濾渣 取濾 液補(bǔ)充水分到 1000 ml 把濾液放入鍋中 加入 氯化鈉 8 g 用玻 璃 棒攪拌后放在石棉網(wǎng)上 小火加熱至 沸騰 再補(bǔ)充水分至 1 000 ml 將配制的培養(yǎng)基分裝入 500 ml三角瓶?jī)?nèi) 在三角燒瓶口上塞上棉塞或泡 沫塑料塞后 再在塞 子 外包一層牛皮紙 用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱 組別 配制日期后 濕熱 滅菌 三角 瓶 的 分裝量以不超過(guò)其容積的一半為宜 3 3 病原物的準(zhǔn)備 3 3 1 病原物分離與保存 取西瓜發(fā)病植株莖部病變的維管束組織 用常規(guī)組織分離法分離枯萎病病原物 分離物經(jīng)形態(tài)學(xué)或 分子生物學(xué) 鑒定以及在瓜類 西瓜 甜瓜 黃瓜 南瓜 冬瓜 絲瓜 葫蘆等 上的致病性測(cè)定確認(rèn)為 尖鐮 孢菌西瓜 ?；?Fusarium oxysporum Sehl f sp niveum E F Smith Synder Hensen 后 參見(jiàn)附錄 A 采用單孢分離進(jìn)行純化 純化后 將西瓜枯萎病菌接種于 PDA平板培養(yǎng)基上 并在接種點(diǎn)周圍放置一定數(shù)量的滅菌濾紙片 在 25 培養(yǎng) 7 d后 取出濾紙片 經(jīng)真空干燥于 20 80 的低溫冰箱中保存 或?qū)⑽鞴峡菸【?種于 PDA斜面養(yǎng)基上 在 25 培養(yǎng) 7 d后 置 4 8 的冰箱中保存 3 3 2 鑒定用枯萎病菌株 選擇當(dāng)?shù)匚鞴袭a(chǎn)區(qū)分離的 西瓜枯萎病菌 株 該菌應(yīng)屬于 分布 較 廣 致病力較強(qiáng)的 當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)菌系 3 3 3 接種體繁殖 將保存的鑒定接種用西瓜枯萎病菌移植于 PDA平板培養(yǎng)基上 在 25 培養(yǎng) 7 d后 在無(wú)菌操作下 接 種于裝有 PL液體培養(yǎng)基或 綠豆液體培養(yǎng)基 的三角瓶中 液體培養(yǎng)基的體積以三角瓶容量的 30 35 為 宜 置于 25 恒 溫 振蕩 箱培養(yǎng) 中 160 r min 180 r min 振蕩 培養(yǎng) 5 d 7 d 培養(yǎng)液經(jīng)雙層紗布 過(guò)濾 濾液以 4000 r min 離心 10 min 倒除上 清液 加適量的無(wú)菌水稀釋 得到分生孢子懸浮液 供 接種用 3 4 接種液濃度 鑒定 生育期及接種方法 用無(wú)菌水稀釋上述供接種用的分生孢子懸浮液 鏡檢 將孢子懸浮液稀釋至 4 0 106個(gè) ml 配制 成接種液 采用苗期浸根接種鑒定 待穴盤中的西瓜苗長(zhǎng)至子葉展平至真葉露尖時(shí) 小心將苗起出 盡量避免 傷根 抖去珍珠巖或黃沙 置于接種液中浸根 5 min 每份待 鑒定 的西瓜品種 系 接種 30株 重復(fù) 3 次 接種后移栽于裝有滅菌育苗基質(zhì) 直徑 10 cm營(yíng)養(yǎng)缽中 置溫室中并 及時(shí)覆膜保濕 2 d后揭膜 觀 察發(fā)病 3 5 西瓜 鑒定 品種的 種植管理 將待 鑒定 的西瓜種子經(jīng) 5 次氯酸鈉溶液浸種 10 min后 用蒸餾水清洗 3次 再清水浸泡 5 h后 放入 墊有兩層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中 置于恒溫箱中 在 30 32 恒溫中催芽 為了保證植株間接種的一致 性 挑選胚根長(zhǎng)至 0 2 cm 0 3 cm的種子 一起播于裝有滅菌珍珠巖或黃沙的育苗盤中 每個(gè)待鑒品種 系 各播一盤 DB33 T 994 2015 4 接種后的西瓜苗 定植于裝有滅菌育苗基質(zhì)的直徑 10 cm營(yíng)養(yǎng)缽中 定植 播種前每 缽 先 用清 水 澆透 每缽 1株 共 30株 置溫室中觀察發(fā)病 溫室溫度 保持在 23 28 之間 缽中育苗基質(zhì)的濕度 保持在 60 80 為宜 早晚注意溫度變化 防止溫度過(guò)高和過(guò)低 整個(gè)過(guò)程不使用殺菌劑 3 6 感病對(duì)照 品種和 抗病對(duì)照 品種的確定 設(shè)置 一個(gè)感病對(duì)照和一個(gè)抗病對(duì)照 抗病對(duì)照選擇 指 標(biāo)為在常規(guī)接菌量下病情指數(shù)小于 20 00的品 種 感病對(duì)照選擇 指 標(biāo)為在常規(guī)接菌量下病情指數(shù)大于 80 00的品種 抗病對(duì)照 品種可缺省 但感病對(duì) 照品種不得缺省 感病對(duì)照選用本地區(qū)的常規(guī)感病品種 4 病害 調(diào)查 與抗病性判定 4 1 病 害 調(diào)查 在 接 種后 第 15 d 逐株 調(diào)查各 鑒定 品種 系 西瓜 植株 枯萎病 的發(fā)病情況 記錄病株數(shù)和病情級(jí)別 調(diào)查時(shí)間可根據(jù)感病對(duì)照品種病級(jí)擴(kuò)展到最 高病級(jí)的時(shí)間作適當(dāng)調(diào)整 調(diào)查 病情分級(jí) 鑒定結(jié)果記錄到鑒 定結(jié)果原始記錄表 參 見(jiàn)附錄 B 4 2 調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 苗期西瓜枯萎病的主要癥狀為 葉片 先 自基部向 上 逐漸萎蔫 似缺水狀 初期 中午缺水萎蔫明顯 早 晚尚能恢復(fù)正常 數(shù)日后 植株萎蔫不再恢復(fù) 慢慢枯死 多數(shù)情況全株發(fā)病 也有的病株僅部分莖蔓 發(fā)病 發(fā)病植株莖蔓基部稍縊縮 病部縱裂 有淡紅色 至粉紅色 膠狀液溢出 根部腐爛變色 縱切根 莖 其維管束部分變褐色 病情分級(jí) 采用 0級(jí) 1級(jí) 3級(jí) 5級(jí) 7級(jí) 9級(jí)的 6級(jí)分級(jí)法 各病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 參 見(jiàn)表 1 表 1 西瓜植株枯萎病病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 病級(jí) 癥狀描述 0級(jí) 西瓜 植 株健康 無(wú)病癥 1級(jí) 西瓜 植 株 莖上出現(xiàn)輕微病斑 但生長(zhǎng)正常 3級(jí) 西瓜 植 株 莖上病斑明顯 生長(zhǎng)輕微受抑制 5級(jí) 西瓜 植 株 莖上病斑明顯 植 株 頂端萎蔫 生長(zhǎng)緩慢或僵化 7級(jí) 西瓜 植 株 50 以下變褐枯萎 9級(jí) 西瓜 植 株 50 以上變褐枯萎或枯死 4 3 調(diào)查結(jié)果的統(tǒng)計(jì) 根據(jù)調(diào)查的結(jié)果計(jì)算各品種的發(fā)病率和病情指數(shù) 發(fā)病率以 Ri 計(jì) 數(shù)值以 表示 按式 1 計(jì)算 Ri ni nt 100 1 式中 ni 發(fā)病株數(shù) nt 總株數(shù) 計(jì)算結(jié)果精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位 病情指數(shù)以 DI 計(jì) 按式 2 計(jì)算 DB33 T 994 2015 5 DI 9d t ccn n 100 2 式中 dc 相應(yīng)病級(jí) nc 各病級(jí)病株數(shù) nt 總株數(shù) 計(jì)算結(jié)果精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位 4 4 鑒定結(jié)果的校正 由于鑒定的外界條件 包括地區(qū)間不可能完全一致 即使同一地區(qū)年度間 批次間鑒定結(jié)果也可能 存在差異 為此 應(yīng)對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行校正 即采用相對(duì)病情指數(shù) 進(jìn)行校正 方法為 鑒定中必須設(shè)感病 對(duì)照 在 感病對(duì)照病情指數(shù)達(dá) 50 00以上時(shí) 進(jìn)行發(fā)病調(diào)查 由于 感病對(duì)照病情指數(shù) 不可能剛好為 50 00 為此 采用校正系數(shù) K來(lái)進(jìn)行校正 K值的求法 按式 3 計(jì)算 K 50 00 DIck 100 3 式中 50 00 感病對(duì)照 標(biāo)準(zhǔn) 病情指數(shù) DIck 本次鑒定 感病對(duì)照病情指數(shù) 用 K值與本次鑒定中被鑒定品種的 病情指數(shù) 相乘 求得被鑒定品種的相對(duì) 病情指數(shù) RDI RDI 按式 4 計(jì)算 RDI DI K 4 式中 DI 被鑒定品種 病情指數(shù) K 校正系數(shù) 以 K值在 0 75 1 25 相當(dāng)于病情指數(shù) 66 67 40 00 之間的鑒定結(jié)果為準(zhǔn)確可靠 4 5 鑒定結(jié)果的 評(píng)定 根據(jù)被鑒定品種的 相對(duì) 病情指數(shù) 評(píng)定品種的抗性級(jí)別 各抗性級(jí)別評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)表 2 表 2 西瓜品種枯萎病抗性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 序號(hào) 抗性類型 英文縮寫 相對(duì) 病情指數(shù) 標(biāo)準(zhǔn) 1 高抗 HR 0 RDI 10 00 2 抗病 R 10 00 RDI 30 00 3 中抗 MR 30 00 RDI 50 00 4 中感 MS 50 00 RDI 60 00 5 感病 S 60 00 RDI 80 00 6 高感 HS 80 00 RDI 100 00 A DB33 T 994 2015 6 A B 附 錄 A 資料性附錄 西瓜枯萎病病原 A 1 學(xué)名 尖鐮 孢西瓜 專化型 Fusarium oxysporum Sehl f sp niveum E F Smith Synder Hensen 屬真菌界 Fungi 半知菌亞門 Deuteromycotina 絲 孢 綱 Hyphomycetes 瘤座 孢 目 Tuberculariales 瘤座 孢 科 Tuberculariaceae 鐮 孢 屬 Fusarium 美麗組 elegans Wr 尖 孢 種 oxysporum Schl 真菌 A 2 培養(yǎng)特性和孢子形態(tài) A 2 1 特性 在 PDA培養(yǎng)基上 菌絲為白色 培養(yǎng)時(shí)間稍長(zhǎng)培養(yǎng)基經(jīng)常出現(xiàn)紫色 菌絲體透明 有分隔 A 2 2 孢子 形態(tài) A 2 2 1 大型分生孢子 大型分生 孢 子著生在復(fù)雜而又有分枝的分生 孢 子?；蛄鰻畹?孢 子座上 呈鐮刀形至紡錘形 橢圓 型彎曲基部有小柄 兩端尖 頂端呈鉤狀 有的呈 喙 狀彎曲 壁薄 通常具有 3個(gè) 5個(gè)分隔 以 3個(gè)分 隔的常 見(jiàn) 大小為 22 8 m 38 4 m 2 6 m 4 1 m 黃褐色至橙色 大型分生 孢 子通常有 3種培養(yǎng)型 型為勻稱鐮刀形或紡錘形 頂細(xì)胞較長(zhǎng) 足細(xì)胞明顯或不明 顯 多為 3個(gè)分隔 屬典型的尖 孢 類型 型較寬短或細(xì)長(zhǎng) 多為 3個(gè)分隔 有的可多達(dá) 4個(gè) 5個(gè)分隔 有時(shí)可達(dá) 8個(gè)分隔 型寬短 頂端呈鉤狀 有的呈 喙 狀彎曲 上端 1 3處變寬 基部細(xì)胞逐漸變窄 足細(xì)胞有或不明顯 多為 3個(gè)分隔 近于馬特型 A 2 2 2 小型分生孢子 多數(shù)為單胞 少數(shù)有 1個(gè)分隔 通常為卵形 有時(shí)為橢圓形 倒卵形 腎形 柱形 大小為 5 m 12 m 2 2 m 3 5 m 通常著生于菌絲側(cè)面的分生 孢 子梗 聚集成假頭狀 A 2 2 3 厚垣孢子 通常單生 有時(shí)雙生 多數(shù)在老熟的菌絲頂端和 中 間形成 有時(shí)亦可生于大型分生 孢 子上 表面 光滑 偶有粗糙 球形至卵圓形 淺黃至黃褐色 DB33 T 994 2015 7 B C 附 錄 B 資料性附錄 鑒定結(jié)果原始記錄表 表 B 1 給出了西瓜品種枯萎病抗性鑒定結(jié)果原始記錄表 表 B 1 西瓜品種枯萎病抗性鑒定結(jié)果原始記錄表 品種名稱 總株數(shù) 0級(jí) 株數(shù) 1級(jí) 株數(shù) 3級(jí) 株數(shù) 5級(jí) 株數(shù) 7級(jí) 株數(shù) 9級(jí) 株數(shù) 發(fā)病率 病情指數(shù) 相對(duì) 病情指數(shù) 鑒定地點(diǎn) 接種生育期 接種病原菌編號(hào) 播種日期 年 月 日 接種日期 年 月 日 調(diào)查日期 年 月 日 鑒定人 校核人 審核人 年 月 日 年 月 日 年 月 日