紅花草莓''莓紅''花瓣花色苷積累及其MYB基因的表達(dá)分析.pdf

園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1470 1484 Acta Horticulturae Sinica 1470 doi 10 16420 j issn 0513 353x 2020 0477 http www ahs ac cn 收稿日期 2021 01 22 修回日期 2021 02 22 基金項(xiàng)目 福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新專項(xiàng)基金項(xiàng)目 CXZX2018087 通信作者 Author for correspondence E mail cqx0246 jianqingchen 紅花草莓 莓紅 花瓣花色苷積累及其 MYB 基 因的表達(dá)分析 洪燕紅 葉清華 李澤坤 王 威 謝 倩 陳清西 陳建清 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院 福州 350002 摘 要 以紅花草莓品種 莓紅 為研究材料 觀察花瓣發(fā)育過程中色澤及花色苷變化規(guī)律 同時(shí) 對(duì) 4 個(gè)發(fā)育時(shí)期花瓣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序 基于相關(guān)性篩選花色苷合成途徑的關(guān)鍵功能基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 結(jié)果表明 1 花瓣發(fā)育過程中 花色苷總含量呈先升后降趨勢 且在半開期達(dá)到最高 2 花色苷合成 途徑關(guān)鍵功能基因 FaPAL Fa4CL 1 Fa4CL 2 FaDFR Fa3GT 表達(dá)水平與花色苷含量正相關(guān) 3 R2R3 MYB 基因 FaMYB6 和 FaMYB90 與花色苷含量呈正相關(guān) 4 Pearson 相關(guān)性分析表明 FaMYB6 與 FaPAL FaDFR 顯著正相關(guān) FaMYB90 與 FaPAL Fa4CL 1 Fa4CL 2 FaDFR Fa3GT 極顯著正相 關(guān) FaMYB82 則與上述 5 個(gè)結(jié)構(gòu)基因之間均極顯著負(fù)相關(guān) 綜上 莓紅 草莓花瓣發(fā)育過程中 花色苷積 累引起花瓣顏色變紅 FaMYB82 FaMYB6 FaMYB90 可能通過調(diào)節(jié) FaPAL Fa4CL FaDFR 和 Fa3GT 的表達(dá)來調(diào)控花瓣色澤形成 關(guān)鍵詞 草莓 紅花 花瓣 花色苷 生物合成 R2R3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子 中圖分類號(hào) S 668 1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 0513 353X 2021 08 1470 15 Accumulation of Anthocyanins in Red flowered Strawberry Meihong Petals and Expression Analysis of MYB Gene HONG Yanhong YE Qinghua LI Zekun WANG Wei XIE Qian CHEN Qingxi and CHEN Jianqing College of Horticulture Fujian Agriculture and Forestry University Fuzhou 350002 China Abstract Meihong which is a red flowered strawberry variety was dynamically observed the anthocyanin contents during petals development Moreover we performed transcriptome sequencing on four development periods of petals for screening key functional genes and transcription factors in the anthocyanin synthesis pathway The results showed that 1 During the lifecycle of petal the content of anthocyanin is sharply increased and reached the highest at the petal half open period and then decreased 2 The key functional genes of the anthocyanin synthesis pathway FaPAL Fa4CL 1 Fa4CL 2 FaDFR and Fa3GT were positively correlated with the accumulation of anthocyanins in their expression patterns 3 FaMYB6 and FaMYB90 were performed positively correlation with anthocyanin content 4 Pearson correlation analysis showed that FaMYB6 was significantly positively correlated with FaPAL and FaDFR FaMYB90 had a significant positive correlation with FaPAL Fa4CL 1 Fa4CL 2 FaDFR and Fa3GT 洪燕紅 葉清華 李澤坤 王 威 謝 倩 陳清西 陳建清 紅花草莓 莓紅 花瓣花色苷積累及其 MYB 基因的表達(dá)分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1470 1484 1471 FaMYB82 was significantly negatively correlated with FaPAL Fa4CL 1 Fa4CL 2 FaDFR and Fa3GT In summary FaMYB82 FaMYB6 FaMYB90 regulate the transcriptional of anthocyanin synthesis genes facilitated the accumulation of anthocyanin caused the color formation of the petals in Meihong strawberry Keywords strawberry red flower petal anthocyanin biosynthesis R2R3 MYB transcription factor 草莓 Fragaria ananassa Duch 的花朵多為白色 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì) 1985 英國的 Ellis 1962 用開白花八倍體鳳梨草莓 Fragaria ananassa 2n 8x 56 和開紫紅花六 倍體歐洲紅花委陵菜 Potentilla palustris 2n 6x 42 雜交 于 1989 年培育出第 1 個(gè)開粉花的 草莓品種 Pink Panda 之后國內(nèi)外開始進(jìn)行紅花草莓育種工作 目前已培育出一批紅花草 莓品種 其中 小桃紅 和 四季紅 是中國育成的首批開紅花的草莓品種 薛莉 等 2012 雷家 軍 等 2015 Xue et al 2016 王慶蓮 等 2017 由于紅花草莓花瓣呈不同程度紅色 不同于 一般栽培草莓花瓣的白色 且其花量大 花期長 兼具觀賞與食用價(jià)值 研究表明 紅花草莓花瓣中含有花色苷物質(zhì) Xue et al 2016 花色苷的生物合成是植物類 黃酮合成途徑的 1 個(gè)分支 受多個(gè)結(jié)構(gòu)基因 包括 PAL C4H 4CL CHS CHI F3H F3 H F3 5 H DFR 和 ANS 等 調(diào)控 Jaakola et al 2002 Fogelman et al 2015 花色苷的生物合成在模式植 物 如擬南芥 矮牽牛 玉米等 中已研究得較為清楚 其合成代謝在轉(zhuǎn)錄水平上受 MYB bHLH WD40 復(fù)合體的調(diào)控 Sun et al 2020 其中 R2R3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用被廣泛報(bào)道 曹雨薇 等 2019 姚亦凡 等 2020 在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與類黃酮物質(zhì)代謝相關(guān)的 R2R3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子 如 AtMYB75 AtMYB112 和 AtMYB123 等 Stracke et al 2001 Lotkowska et al 2015 大多 數(shù)參與花色苷合成的 MYB 轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)花色苷合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá) 使花色苷合成量增多 例如 月季中的 RhMYB10 Raymond et al 2018 梅花中的 PmMYB108 Zhang et al 2018 和獼猴 桃中的 AcMYB123 Wang et al 2019a 等 目前 紅花草莓新品種選育多以傳統(tǒng)雜交育種為主 耗時(shí)費(fèi)力 近年來關(guān)于花色苷生物合成轉(zhuǎn) 錄調(diào)控的研究取得了重要進(jìn)展 因此對(duì)轉(zhuǎn)錄因子定向修飾的分子育種 有望加快紅花草莓新花色品 種選育工作 然而如今對(duì)紅花草莓花色苷及花色形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理的研究鮮少 本研究中以紅花草 莓品種 莓紅 為研究材料 觀察花朵發(fā)育過程花色表型變化 檢測不同發(fā)育時(shí)期花瓣花色苷含量 從轉(zhuǎn)錄組中篩選出花色苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和 R2R3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子 為后續(xù)對(duì)紅花草莓花中關(guān)于花 色苷合成的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ) 同時(shí)為人工進(jìn)行分子調(diào)控紅花草莓花色及新品種選育提供理論依據(jù) 1 材料與方法 1 1 材料 試驗(yàn)所用紅花草莓品種為 莓紅 白花草莓品種為 蒙特瑞 購自于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)草莓資 源圃 栽培條件為光照 16 h 黑暗 8 h 溫度 21 0 1 0 正常水肥管理 以花苞 4 mm 大小 花 瓣未著色 記為 S1 第 2 天記為 S2 依次類推 至花瓣完全展開記為 S7 以 7 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期 S1 S7 花瓣為研究試材 圖 1 Hong Yanhong Ye Qinghua Li Zekun Wang Wei Xie Qian Chen Qingxi Chen Jianqing Accumulation of anthocyanins in red flowered strawberry Meihong petals and expression analysis of MYB gene 1472 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1470 1484 圖 1 莓紅 和 蒙特瑞 草莓花朵發(fā)育的 7 個(gè)時(shí)期 Fig 1 The seven developmental stages of flowers on Meihong and Monterey strawberries 1 2 花色苷總含量測定 參照 Huang 等 2016 的方法 取 S1 S7 時(shí)期花瓣各 0 10 g 分別用液氮研磨成粉末后轉(zhuǎn)移 至 10 mL 離心管 加入 5 mL 1 鹽酸甲醇溶液 1 99 體積比 振蕩混勻后置于 4 冰箱黑暗充 分浸提 24 h 期間多次振蕩 之后離心 15 min 4 13 000 r min 1 上清液利用紫外可見分光 光度計(jì) PerkinElmer Lambda 25 測定 A 530 和 A 657 試驗(yàn)設(shè)生物學(xué)重復(fù) 5 次 1 3 花色苷合成相關(guān)基因篩選 基因表達(dá)量數(shù)據(jù)來源于 莓紅 草莓 4 個(gè)時(shí)期花瓣 S1 S2 S3 和 S6 各時(shí)期均 3 個(gè)生物學(xué) 重復(fù) 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫 提取樣本總 RNA 后 去除 rRNA 富集 mRNA 反轉(zhuǎn)錄形成雙鏈 cDNA 修 復(fù) cDNA 雙末端后 加上接頭 PCR 擴(kuò)增構(gòu)建上機(jī)文庫 用 AMPure XP beads 篩選 200 bp 左右的 cDNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并再次使用 AMPure XP beads 純化 PCR 產(chǎn)物 最終獲得文庫 并通過質(zhì)控分 析 基于八倍體草莓參考基因組 Edger et al 2019 利用 HISAT2 軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比對(duì)回帖分 析 隨后 stringtie 軟件被用來計(jì)算各個(gè)基因在花瓣各時(shí)期的表達(dá)量 FPKM 利用 DESeq2 軟件進(jìn) 行差異基因分析 結(jié)合 KEGG Nr Pfam 等數(shù)據(jù)庫注釋鑒定并篩選 莓紅 草莓花瓣發(fā)育過程中與 花色苷含量相關(guān)的花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因 基于 Pearson 系數(shù) r 對(duì)差異表達(dá)的 R2R3 MYB 與花 色苷含量和花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析 篩選出調(diào)控 莓紅 草莓花瓣花色苷 合成的 R2R3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因 1 4 R2R3 MYB 蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析和結(jié)構(gòu)分析 從 TAIR 數(shù)據(jù)庫 https www arabidopsis org index jsp 下載 9 個(gè)擬南芥花色苷合成相關(guān) R2R3 MYB 蛋白序列 從 NCBI 上下載 28 個(gè)其他薔薇科物種花色苷合成相關(guān) R2R3 MYB 蛋白 序列 采用 MEGA 7 0 用鄰接法 Bootstrap 值設(shè)為 1 000 次 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析 用 MEME 網(wǎng)站 http meme suite org index html 分析蛋白氨基酸序列保守基序 1 5 qRT PCR 分析 使用 Trizol 試劑盒 Invitrogen Carlsbad CA USA 提取不同發(fā)育時(shí)期 S1 S2 S3 和 S6 花瓣 RNA 每個(gè)時(shí)期 3 個(gè)重復(fù)共 12 個(gè)樣本 使用天根 FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix 試劑 洪燕紅 葉清華 李澤坤 王 威 謝 倩 陳清西 陳建清 紅花草莓 莓紅 花瓣花色苷積累及其 MYB 基因的表達(dá)分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1470 1484 1473 盒反轉(zhuǎn)錄 采用 Oligo 7 設(shè)計(jì)引物 引物序列見表 1 以 FaUBC10 為內(nèi)參基因 Lin Wang et al 2014 引物合成由福州尚亞生物技術(shù)有限公司完成 采用全式金 2 Easy Taq PCR SuperMix dye 試劑盒進(jìn)行 PCR 反應(yīng) 鑒定引物特異性 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94 5 min 94 30 s 55 30 s 72 1 min 35 個(gè)循環(huán) 72 10 min 以 12 個(gè)樣本 cDNA 為模板進(jìn)行目標(biāo)基因 qRT PCR 反應(yīng) 采用天根 Real Universal Color PreMix SYBR Green 熒光定量試劑盒進(jìn)行 反應(yīng)體系為 20 L 參 照說明書 其中 cDNA 為 1 L 反應(yīng)程序 兩步法 為 95 15 min 95 10 s 60 20 s 40 個(gè)循環(huán) 測定儀器為 Roche 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀 LightCycler 96 每個(gè)樣品重復(fù) 3 次 用 2 Ct 法 Livak Schmittgen 2001 計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量 表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences 基因名稱 Gene Name 基因 ID Gene ID 引物序列 5 3 Primer sequences FaMYB82 maker Fvb6 4 augustus gene 249 24 F ATCGTTAGAGGCAACATTACCG R TCGCAGCTTCCTCTTTACGAA FaMYB6 maker Fvb5 1 augustus gene 245 45 F AGACCAACGCCTCATCGACT R CTCCCCGCAATCAAAGACCAC FaMYB90 maker Fvb6 3 snap gene 424 65 F AACTACCTTCGGCCAAACATC R TCCAGTAGTTCTTCACATCATTACC FaPAL maker Fvb6 2 augustus gene 174 36 F CGCCCCAATTCTAAGTCCGTT R CAGAGCCAACAGCAGTACCAT Fa4CL 1 maker Fvb5 2 snap gene 144 44 F AGTTCAGACCCTTCCTCATGT R CTAGCTGGAGGCAAAAAGGAT Fa4CL 2 maker Fvb5 3 augustus gene 134 28 F GCTGTGTTGATTTCGCATCCT R GCTTCCTAACCACAAATGCCACT FaF3H 1 maker Fvb1 3 augustus gene 64 31 F CATCCACCCCAAGCTCAT R CAATCCTGCACTGCCTCT FaF3H 2 maker Fvb1 4 augustus gene 56 40 F GCATCGACCCCAAGCTCAT R CCAATCCTGCACCGCTTCT FaDFR maker Fvb2 4 snap gene 258 87 F CACGCCTATGGATTTCGAGT R AGACCTCCTTTCGATGCTCT FaANS maker Fvb5 3 augustus gene 266 54 F TCATGCACATAGGCGACACC R CAGAAAACCGCCCACGAGAT Fa3GT maker Fvb7 1 augustus gene 319 41 F CGCTCTTTTCACGTATGCTT R CTTGCTGGTGGTTCTAGTAGGT Fa3 5GT maker Fvb7 2 snap gene 316 69 F CCACACCTCCGATCTTCACC R CGTACCACCCACAAGAACCT FaUBC10 內(nèi)參 Reference gene maker Fvb5 2 augustus gene 25 49 F TGCCCTGACCATATCGAAGG R CTTGCGGTGGTCTCATACTT 1 6 數(shù)據(jù)處理 所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)是至少 3 個(gè)獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的平均值 數(shù)據(jù)利用 SPSS 軟件分析 差異統(tǒng)計(jì)比 較利用 ANOVA 統(tǒng)計(jì)方法對(duì)多重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析 用 Adobe Fireworks CS4 GraphPad Prism 7 0 進(jìn)行繪圖 2 結(jié)果與分析 2 1 紅花草莓 莓紅 和白花草莓 蒙特瑞 不同發(fā)育時(shí)期花瓣的花色苷含量 如圖 2 所示 莓紅 草莓花瓣中花色苷總含量總體呈先升后降趨勢 S1 時(shí)期花瓣花色苷總含 Hong Yanhong Ye Qinghua Li Zekun Wang Wei Xie Qian Chen Qingxi Chen Jianqing Accumulation of anthocyanins in red flowered strawberry Meihong petals and expression analysis of MYB gene 1474 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1470 1484 量基本為 0 S6 時(shí)期最高 是 S1 時(shí)期的 94 07 倍 S7 時(shí)期急劇下降 比 S6 降低了 41 33 這表 明 莓紅 草莓在花苞到花瓣半展?fàn)顟B(tài)時(shí)花瓣中花色苷含量不斷積累 完全展開時(shí)花色苷降解 含 量降低 而白花草莓 蒙特瑞 花瓣在不同發(fā)育時(shí)期均幾乎檢測不出花色苷 說明 蒙特瑞 草莓 花瓣發(fā)育期無明顯花色苷積累 圖 2 紅花草莓 莓紅 和白花草莓 蒙特瑞 不同發(fā)育時(shí)期花瓣的花色苷總含量 Fig 2 Total anthocyanin content in petals of red flowered strawberry Meihong and white flowered strawberry Monterey at different developmental stages P 0 01 2 2 花色苷合成結(jié)構(gòu)基因鑒定及表達(dá)分析 選取花色苷含量顯著變化時(shí)期 S1 S2 S3 和 S6 的花瓣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 基于 KEGG 注釋結(jié)果 鑒定出 110 個(gè)與花色苷合成途徑 包含修飾和轉(zhuǎn)運(yùn) 相關(guān)的差異表達(dá)結(jié)構(gòu)基因 篩除低 表達(dá)豐度的基因 FPKM 10 經(jīng) Z score 標(biāo)準(zhǔn)化 Fig 3 Expression analysis of Structural genes related to anthocyanin synthesis in Meihong strawberry petals FPKM 10 standardized by Z score Hong Yanhong Ye Qinghua Li Zekun Wang Wei Xie Qian Chen Qingxi Chen Jianqing Accumulation of anthocyanins in red flowered strawberry Meihong petals and expression analysis of MYB gene 1476 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1470 1484 圖 4 莓紅 草莓花瓣 MYB 基因數(shù) 類型統(tǒng)計(jì) Fig 4 Statistics on the number and types of MYB genes in Meihong strawberry petals 篩除低表達(dá)豐度的基因 FPKM 0 60 P 0 80 P 0 01 而顯著下調(diào)表達(dá)的 15 個(gè) R2R3 MYB 中有 6 個(gè)與花色苷含量之間呈極顯著強(qiáng)負(fù)相關(guān) r 0 80 P 10 和其與花色苷含量間相關(guān)性 r 0 85 篩選了 3 個(gè) R2R3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子 即 FaMYB82 FaMYB6 和 FaMYB90 將其蛋白序列與擬南芥和其他薔 薇科植物中與花色苷合成相關(guān)的 R2R3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 并分析保守結(jié)構(gòu)域 結(jié)果 圖 6 發(fā)現(xiàn) FaMYB90 與 AtMYB75 AtMYB90 和 AtMYB113 等 Wang et al 2010 2019 同聚在 H 大簇中 與 RhMYB10 和 PpMYB9 聚在一小簇中 從其保守基序可以看到 FaMYB90 和 RhMYB10 蛋白上皆具有 Motif 1 Motif 2 Motif 8 和 Motif 9 且出現(xiàn)順序一致 FaMYB82 與 AtMYB11 AtMYB12 和 AtMYB111 同聚在 F 簇中 但從保守基序上看 FaMYB82 只具有 Motif 2 與同簇的 其他 3 個(gè)蛋白差異較大 FaMYB6 則與 PpMYB17 PpMYB18 PpMYB19 PpMYB20 和 PbMYB3 聚在 C 大簇中 可以看到 C 大簇中的 MYB 蛋白都具有 Motif 10 Motif 3 Motif 1 Motif 2 和 Motif 9 且出現(xiàn)順序皆一致 表明這 3 個(gè)差異 R2R3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子可能具有調(diào)控花色苷生物合成的功能 2 5 花色苷合成相關(guān)差異基因 qRT PCR 分析 基于基因表達(dá)量 FPKM 10 和其與花色苷含量的相關(guān)性 r 0 85 篩選了 3 個(gè) R2R3 MYB 基因 FaMYB82 FaMYB6 和 FaMYB90 和 9 個(gè)差異結(jié)構(gòu)基因 FaPAL Fa4CL 1 Fa4CL 2 FaF3H 1 FaF3H 2 FaDFR FaANS Fa3GT 和 Fa3 5GT qRT PCR 分析 圖 7 發(fā)現(xiàn) 這些基因相對(duì)表 達(dá)量變化趨勢均與轉(zhuǎn)錄組中基因表達(dá)量 FPKM 變化趨勢一致 其中 FaPAL Fa4CL 1 Fa4CL 2 洪燕紅 葉清華 李澤坤 王 威 謝 倩 陳清西 陳建清 紅花草莓 莓紅 花瓣花色苷積累及其 MYB 基因的表達(dá)分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1470 1484 1477 FaDFR Fa3GT FaMYB6 和 FaMYB90 在花瓣由白變紅 S1 至 S6 發(fā)育過程中 相對(duì)表達(dá)量均逐 漸升高 S6 時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量顯著高于 S1 圖 5 莓紅 草莓花瓣差異 R2R3 MYB 基因表達(dá)量 A FPKM 10 經(jīng) Z score 標(biāo)準(zhǔn)化 及其與 花色苷含量的 Pearson 相關(guān)性 r 分析 B Fig 5 Expression analysis of differential R2R3 MYB genes A FPKM 10 standardized by Z score and Pearson correlation analysis between differential R2R3 MYB genes and anthocyanin content B in Meihong strawberry petals Hong Yanhong Ye Qinghua Li Zekun Wang Wei Xie Qian Chen Qingxi Chen Jianqing Accumulation of anthocyanins in red flowered strawberry Meihong petals and expression analysis of MYB gene 1478 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1470 1484 圖 6 R2R3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化樹和保守基序分析 分支上數(shù)值為鄰接法 1 000 次 Bootstrap 檢驗(yàn)的自引導(dǎo)值 Fig 6 Phylogenetic tree and conserved motif analysis of R2R3 MYB transcription factor The branch values were self guided values of Bootstrap test for 1 000 times by neighbor joining method FaF3H 1 FaF3H 2 FaANS 和 Fa3 5GT 基因相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)先升后降趨勢 S3 顯著高于其 他 3 個(gè)發(fā)育時(shí)期 FaMYB82 相對(duì)表達(dá)量變化趨勢則與花色苷含量變化趨勢相反 隨著花瓣顏色的加 深 相對(duì)表達(dá)量逐漸降低 說明在 莓紅 花瓣轉(zhuǎn)色前后 大部分結(jié)構(gòu)基因上調(diào)表達(dá) FaMYB6 和 FaMYB90 可能對(duì)花色苷的積累起正調(diào)控作用 而 FaMYB82 則可能起負(fù)調(diào)控作用 洪燕紅 葉清華 李澤坤 王 威 謝 倩 陳清西 陳建清 紅花草莓 莓紅 花瓣花色苷積累及其 MYB 基因的表達(dá)分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1470 1484 1479 圖 7 花色苷合成相關(guān) 9 個(gè)差異結(jié)構(gòu)基因和 3 個(gè) R2R3 MYB 基因的相對(duì)表達(dá)量 以數(shù)據(jù)最低表達(dá)量 即 S1 時(shí)期 Fa3GT 的表達(dá)量 作為參照數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)相對(duì)量計(jì)算 Fig 7 Relative expression levels of nine differential structural genes and three R2R3 MYB genes related to anthocyanin synthesis The lowest expression level of the data the expression level of Fa3GT in S1 period was used as the reference data to calculate the relative amount of data Hong Yanhong Ye Qinghua Li Zekun Wang Wei Xie Qian Chen Qingxi Chen Jianqing Accumulation of anthocyanins in red flowered strawberry Meihong petals and expression analysis of MYB gene 1480 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1470 1484 另外 將花瓣不同發(fā)育時(shí)期的 3 個(gè) R2R3 MYB 基因相對(duì)表達(dá)量與花色苷含量進(jìn)行線性關(guān)系分析 發(fā)現(xiàn) FaMYB6 和 FaMYB90 與花色苷含量呈顯著正相關(guān)性 R 2 分別為 0 9728 和 0 9284 圖 8 圖 8 3 個(gè) R2R3 MYB 基因與花色苷含量的線性關(guān)系分析 Fig 8 Analysis of linear relationship between three R2R3 MYB genes and anthocyanin content 基于基因表達(dá)量 對(duì) 3 個(gè) R2R3 MYB 基因與 9 個(gè)差異結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行 Pearson 相關(guān)性分析 FaMYB90 與 FaPAL Fa4CL 1 Fa4CL 2 FaDFR 和 Fa3GT 極顯著正相關(guān) r 0 80 P 0 60 P 0 80 P 0 01 而與其他差異結(jié)構(gòu)基因間的相關(guān)性則較弱 FaMYB82 與 FaPAL Fa4CL 1 Fa4CL 2 FaDFR 和 Fa3GT 均極顯著負(fù)相關(guān) r 0 80 P 0 01 表 2 這些結(jié)果顯示 FaMYB6 和 FaMYB90 與花色苷合成呈正相關(guān) 表 2 3 個(gè) R2R3 MYB 基因與 9 個(gè)結(jié)構(gòu)基因的 Pearson 相關(guān)性分析 Table 2 Pearson correlation analysis between three R2R3 MYB genes and nine structural genes 基因名稱 Gene name Pearson 系數(shù) r FaPAL Fa4CL 1 Fa4CL 2 FaF3H 1 FaF3H 2 FaDFR FaANS Fa3GT Fa35GT FaMYB82 0 90 0 93 0 87 0 28 0 32 0 88 0 70 0 85 0 81 FaMYB6 0 61 0 54 0 58 0 27 0 20 0 62 0 30 0 56 0 86 FaMYB90 0 92 0 87 0 95 0 31 0 33 0 94 0 70 0 90 0 79 Note FaMYB82 maker Fvb6 4 augustus gene 249 24 FaMYB6 maker Fvb5 1 augustus gene 245 45 FaMYB90 maker Fvb6 3 snap gene 424 65 FaPAL maker Fvb6 2 augustus gene 174 36 Fa4CL 1 maker Fvb5 2 snap gene 144 44 Fa4CL 2 maker Fvb5 3 augustus gene 134 28 FaF3H 1 maker Fvb1 3 augustus gene 64 31 FaF3H 2 maker Fvb1 4 augustus gene 56 40 FaDFR maker Fvb2 4 snap gene 258 87 FaANS maker Fvb5 3 augustus gene 266 54 Fa3GT maker Fvb7 1 augustus gene 319 41 Fa3 5GT maker Fvb7 2 snap gene 316 69 洪燕紅 葉清華 李澤坤 王 威 謝 倩 陳清西 陳建清 紅花草莓 莓紅 花瓣花色苷積累及其 MYB 基因的表達(dá)分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1470 1484 1481 為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上結(jié)論 檢測篩選所得與草莓花瓣花色苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和 MYB 基因 在白花草莓品種 蒙特瑞 花瓣發(fā)育過程中的表達(dá)模式 檢測發(fā)現(xiàn) 白花品種 蒙特瑞 的花瓣在 發(fā)育過程中不積累花色苷 圖 2 檢測篩選得到調(diào)控花色苷合成途徑結(jié)構(gòu)基因 FaPAL Fa4CL 1 Fa4CL 2 FaF3H 1 FaF3H 2 FaDFR FaANS Fa3GT 和 Fa3 5GT 和 MYB 基因 FaMYB6 FaMYB82 和 FaMYB90 在白花草莓 蒙 特瑞 S1 S2 S3 S6 時(shí)期花瓣的表達(dá)模式 結(jié)果 圖 9 顯示所有基因的表達(dá)模式均與 莓紅 差異顯著 雖然白花草莓花瓣中花色苷合成途徑的上游調(diào)控基因 FaPAL Fa4CL 1 和 Fa4CL 2 表達(dá) 模式還是逐漸上升 但是與紅花草莓相比 上升幅度顯著下降 白花草莓花瓣中的花色苷下游合成 基因 FaF3H 1 FaF3H 2 FaDFR FaANS Fa3GT 和 Fa3 5GT 表達(dá)量基本不變 甚至不表達(dá) 紅 花草莓花瓣中篩選所得花色苷合成調(diào)控 R2R3 MYB 基因 FaMYB6 FaMYB82 和 FaMYB90 表達(dá)模式 在白花草莓花瓣中也顯著不同 表達(dá)量在發(fā)育過程中沒有顯著改變 其中 FaMYB6 表達(dá)量很低 結(jié) 合以上結(jié)果 表明在紅花草莓轉(zhuǎn)錄組篩選所得的基因確實(shí)涉及花色苷合成及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控 Hong Yanhong Ye Qinghua Li Zekun Wang Wei Xie Qian Chen Qingxi Chen Jianqing Accumulation of anthocyanins in red flowered strawberry Meihong petals and expression analysis of MYB gene 1482 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1470 1484 圖 9 候選花色苷合成相關(guān)基因在白花草莓 蒙特瑞 花瓣發(fā)育過程中的表達(dá)模式分析 以數(shù)據(jù)最低表達(dá)量 即 S1 時(shí)期 Fa3GT 的表達(dá)量作為參照數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)相對(duì)量計(jì)算 Fig 9 Relative expression levels of nine structural genes and three R2R3 MYB genes related to anthocyanin synthesis in white flowered strawberry Monterey The lowest expression level of the data Fa3GT in S1 period was used as the reference data to calculate the relative amount of data 3 討論 在本研究中 找到了參與紅花草莓花色苷生物合成的結(jié)構(gòu)基因 如 4CL F3H DFR ANS 和 3GT 等 且這些基因均具有兩個(gè)以上成員 不同基因成員的表達(dá)模式并不完全一致 這說明 莓 紅 草莓花瓣中花色苷合成的每一步可能是由多基因共同調(diào)控的 由于 莓紅 草莓花瓣中的花色 苷是由無到有的 故集中于研究不同發(fā)育時(shí)期花色苷合成相關(guān)的差異基因 共篩選出 110 個(gè)與花色 苷合成途徑相關(guān)的差異結(jié)構(gòu)基因 包括與花色苷修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因 可以發(fā)現(xiàn)大部分結(jié)構(gòu)基因 在花的發(fā)育過程中表達(dá)量不斷提高 說明在 莓紅 草莓花瓣發(fā)育過程中 花色苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基 因的上調(diào)表達(dá) 使得花色苷得以大量合成積累 花色苷的生物合成除了受結(jié)構(gòu)基因和環(huán)境因子的調(diào)控外 還受多種轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控 其中主要 包括 R2R3 MYB bHLH 和 WD40 等 目前已在多個(gè)植物中鑒定出多個(gè)與花色苷生物合成相關(guān)的 R2R3 MYB bHLH 和 WD40 等轉(zhuǎn)錄因子 An et al 2012 Zhao et al 2013 Schwinn et al 2014 Matus et al 2017 Meng et al 2020 本研究中發(fā)現(xiàn)有 14 個(gè)顯著上調(diào)的 R2R3 MYB 與花色苷含量間 呈極顯著極強(qiáng)正相關(guān) 6 個(gè)顯著下調(diào)的 R2R3 MYB 與花色苷含量間呈極顯著極強(qiáng)負(fù)相關(guān) 對(duì)選擇的 3 洪燕紅 葉清華 李澤坤 王 威 謝 倩 陳清西 陳建清 紅花草莓 莓紅 花瓣花色苷積累及其 MYB 基因的表達(dá)分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1470 1484 1483 個(gè) R2R3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子 FaMYB90 FaMYB6 和 FaMYB82 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析 發(fā)現(xiàn) 3 個(gè) R2R3 MYB 均分別與已報(bào)道的其他植物中與花色苷合成相關(guān)的 R2R3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子如 RhMYB10 Raymond et al 2018 AtMYB12 Wang et al 2016 和 PpMYB20 Zhou et al 2016 等聚集在一起