設(shè)施韭菜根腐病致病鐮孢菌鑒定及生物學(xué)特性研究.pdf

園藝學(xué)報(bào) 2022 49 4 893 906 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2021 0051 http www ahs ac cn 893 收稿日期 2021 06 15 修回日期 2021 11 16 基金項(xiàng)目 遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 2020 MS 345 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤微生態(tài)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目 2019DD154522 遼寧省農(nóng)業(yè)科 學(xué)院青年基金項(xiàng)目 2019 QN 05 E mail gaoxiaomei8115 設(shè)施韭菜根腐病致病鐮孢菌鑒定及生物學(xué)特性 研究 高曉梅 1 呂國(guó)忠 2 李 楊 1 敖 靜 1 劉曉輝 1 孫玉祿 1 1 遼寧省微生物科學(xué)研究院 遼寧朝陽(yáng) 122000 2 大連民族大學(xué) 遼寧大連 116600 摘 要 韭菜根腐病是設(shè)施連作多年生韭菜的重要病害之一 為明確遼寧省設(shè)施韭菜根腐病的病原 菌種類 從韭菜感病根系分離純化獲得 45 株鐮孢菌 結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及 EF 1a Histone3 IGS 基因片段 序列分析結(jié)果 鑒定為尖孢鐮孢菌 Fusarium oxysporum 層出鐮孢菌 F proliferatum 和腐皮鐮孢菌 F solani 經(jīng)柯赫氏法則證病 確定均可引起韭菜根腐病對(duì)病原菌的生物學(xué)特性研究結(jié)果表明 3 種 鐮孢菌最適生長(zhǎng)溫度為 30 左右 最適 pH 7 8 黑暗條件有利于病原菌菌絲生長(zhǎng) 菌絲的致死溫度為 75 10 min 分生孢子致死溫度為 56 10 min 病原菌對(duì)碳源鼠李糖以及氮源硝酸鈉 甘氨酸利用率最 高 綜上 尖孢鐮孢菌 層出鐮孢菌和腐皮鐮孢菌是遼寧省設(shè)施韭菜根腐病的主要病原菌 其中尖孢鐮 孢菌分布最廣 致病力最強(qiáng) 屬于優(yōu)勢(shì)致病菌 關(guān)鍵詞 韭菜 根腐病 鐮孢菌 鑒定 生物學(xué)特性 中圖分類號(hào) S 633 3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 0513 353X 2022 04 0893 14 Identification of the Pathogens Causing Root Rot on Allium tuberosum and Study on Their Biological Characteristics GAO Xiaomei 1 L Guozhong 2 LI Yang 1 AO Jing 1 LIU Xiaohui 1 and SUN Yulu 1 1 Microbial Research Institute of Liaoning Province Chaoyang Liaoning 122000 China 2 Dalian Minzu University Dalian Liaoning 116600 China Abstract Chinese chive Allium tuberosum root rot is one of the main diseases of continuous cropping chive in greenhouse In order to explore the main pathogens of chive root rot disease in Liaoning Province 45 isolates of the genus Fusarium were generated from diseased chive roots and finally identified as F oxysporum F proliferatum and F solani based on their morphological characteristics and EF 1a Histone3 rDNA IGS sequences analysis These three Fusarium species were confirmed to be the pathogenic agents of the disease according to Koch s rule Studies on the biological characteristics of the three pathogens showed that the most suitable growth temperature is about 30 the optimal growth pH value are at pH 7 8 full dark is conducive to the mycelial growth of the three species their mycelia can be killed at 75 for 10 min their conidia can not germinate at 56 for 10 min These pathogens have Gao Xiaomei L Guozhong Li Yang Ao Jing Liu Xiaohui Sun Yulu Identification of the pathogens causing root rot on Allium tuberosum and study on their biological characteristics 894 Acta Horticulturae Sinica 2022 49 4 893 906 the highest utilization rate of rhamnose as carbon source and sodium nitrate and glycine as nitrogen source In summary F oxysporum F proliferatum and F solani are the principal pathogenic fungi causing root rot of A tuberosum of which F oxysporum is the most dominant pathogenic species because of its wide distribution and stronger pathogenicity Keywords Chinese chive root rot Fusarium identification biological characteristics 韭菜 Allium tuberosum 為百合科蔥屬多年生草本植物 其韭香濃郁 且具健胃 助消化 降 低血脂血壓等功效 是深受人們喜愛(ài)的藥食兩用蔬菜 韭菜在中國(guó)各地均有栽培 隨著北方設(shè)施栽 培面積的不斷擴(kuò)大和連作年限的增加 韭菜根腐病 Fusarium spp 日趨普遍 給菜農(nóng)造成了嚴(yán)重 經(jīng)濟(jì)損失 國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道 對(duì)韭菜生產(chǎn)影響較大的病害主要有韭菜灰霉病 Botrytis cinerea 疫病 Phytophthora nicotianea 菌核病 Sclerotium rolfsii 等 此外 立枯絲核菌 Rhizoctonia solani 可以引起韭菜根腐病 Cho Shin 2004 葉腐病 Misawa Kuninaga 2013 和莖基腐病 宋 加偉 2017 Rout 等 2015 報(bào)道尖孢鐮孢菌 Fusarium oxysporum f sp cepae 可引起韭菜莖 基腐病 各種病害交叉影響 病害發(fā)生此消彼長(zhǎng) 近年來(lái)隨著連作年限增加 韭菜根腐病發(fā)生日益 嚴(yán)重 根腐病是一種典型的土傳病害 病原鐮孢菌在土壤中可長(zhǎng)期存活 當(dāng)遇適宜條件時(shí)極易發(fā)生 2015 年以來(lái) 遼寧省設(shè)施韭菜根腐病發(fā)生嚴(yán)重 但至今缺乏相關(guān)報(bào)道和系統(tǒng)研究 筆者對(duì)韭菜 根腐病進(jìn)行了廣泛調(diào)查 采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離純化 通過(guò)柯赫氏法則完成致病性測(cè)定 基于形態(tài)特征和轉(zhuǎn)錄延伸因子 EF 1 組蛋白 Histone 3 rDNA 基因內(nèi)間隔區(qū) IGS 基因序 列分析將病原菌鑒定到種 并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究 為進(jìn)一步研究病害的發(fā)病規(guī)律及科 學(xué)防控奠定理論基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 韭菜根腐病病害調(diào)查及病害樣品采集 2017 2020 年于韭菜養(yǎng)根期間 在遼寧省設(shè)施韭菜主產(chǎn)區(qū) 7 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn) 8 個(gè)村調(diào)查韭菜根腐病發(fā)生 情況 并采用五點(diǎn)法采集具有典型癥狀的根腐病樣 56 份 其中朝陽(yáng)市朝陽(yáng)縣腰而營(yíng)子鄉(xiāng)腰而營(yíng)子村 120 4472E 41 5095N 朝陽(yáng)縣孫家灣鎮(zhèn)莊頭營(yíng)子村 120 8569E 41 4868N 喀左縣昆都營(yíng)子 鎮(zhèn)金杖子村 119 6348E 41 0805N 喀左縣昆都營(yíng)子鎮(zhèn)水泉溝村 119 5965E 41 1058N 分別為 15 份 9 份 5 份和 4 份 錦州市凌?？h新安鎮(zhèn)新安村 121 1451E 41 0137N 凌?？h建業(yè)鄉(xiāng)綏 豐村 121 1749E 41 0157N 北鎮(zhèn)市溝幫子鎮(zhèn)姚屯村 121 5058E 41 2201N 北鎮(zhèn)市中安鎮(zhèn)楊 臺(tái)村 122 2638E 41 7254N 分別為 6 份 8 份 6 份和 3 份 參考方中達(dá) 1998 編著的 植病 研究方法 根據(jù)韭菜根腐病的實(shí)際發(fā)病統(tǒng)計(jì)結(jié)果制定病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 0 級(jí) 根系健康 且植株健壯 無(wú)癥狀 1 級(jí) 少于 25 的根系變色 腐爛 植株生長(zhǎng)稍慢 2 級(jí) 25 根系變色 腐爛 50 植株生長(zhǎng)變慢 有黃尖 3 級(jí) 50 根系變色 腐爛 75 植株稍細(xì)弱葉尖枯黃 4 級(jí) 75 根系變色 腐爛 鱗莖基盤變褐腐爛 根系再生能力受損 植株極矮小 細(xì)弱 甚至死亡 統(tǒng) 計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù) 發(fā)病率 M 發(fā)病植株總數(shù) 調(diào)查植株總數(shù) 100 病情指數(shù) DI 各 級(jí)病株數(shù) 代表值 調(diào)查植株綜總和 最高病級(jí)代表值 100 高曉梅 呂國(guó)忠 李 楊 敖 靜 劉曉輝 孫玉祿 設(shè)施韭菜根腐病致病鐮孢菌鑒定及生物學(xué)特性研究 園藝學(xué)報(bào) 2022 49 4 893 906 895 1 2 病原菌的分離與鑒定 1 2 1 病原菌的分離 采用組織分離法分離韭菜根上的真菌 將剪取的韭菜根系病健交界處用 75 酒精浸泡 3 5 s 后 置于 5 NaClO 4 浸泡 5 min 用無(wú)菌水沖洗 3 次置于含鏈霉素的 PDA 平板上 28 培養(yǎng)分離 另采 用單孢分離方法純化分離的鐮孢菌菌株 董娟華 等 2009 共獲得鐮孢菌菌株 45 株 保存于遼 寧省微生物菌種保藏中心 LCCC 備用 1 2 2 形態(tài)學(xué)鑒定 將單孢分離的菌株接種于鐮孢菌鑒定培養(yǎng)基 PDA PSA SNA 平板上 標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)后觀察 分離物菌落 分生孢子梗和分生孢子形態(tài)特征 參考 Booth 1971 Leslie 和 Summerell 2006 的鐮孢菌形態(tài)學(xué)鑒定方法進(jìn)行鐮孢菌的鑒定 1 2 3 分子生物學(xué)鑒定 選取形態(tài)學(xué)鑒定中典型的鐮孢菌 10 株 接種于鋪好玻璃紙的平板上 28 培養(yǎng) 5 d 后采用改 良 CTAB 法 張穎慧 等 2008 提取 DNA 選擇引物 EF 1a EF1Ha EF2Tb O Donnell et al 2009 Histone3 H3 1a H3 1b Glass Donaldson 1995 和 IGS iNL11 iCNS1 Dita et al 2010 對(duì)菌株進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 擴(kuò)增產(chǎn)物在 1 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè) 純化后送至上海美吉生物 醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序 并在 NCBI http www ncbi nlm gov 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 同源性比對(duì) 基于 GenBank 中報(bào)道的其他相關(guān)病原菌的序列信息 利用最大似然法 Maximum Likehood ML 通過(guò) MEGA X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Bootstrap 檢驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)為 1 000 1 3 鐮孢菌分離頻率及病原菌的誘發(fā) 根據(jù)經(jīng)典形態(tài)學(xué)分類方法統(tǒng)計(jì)由韭菜根腐病根上分離獲得的真菌菌株 并計(jì)算各屬真菌的分離 頻率 統(tǒng)計(jì)鐮孢菌數(shù)量并計(jì)算各種鐮孢菌的分離頻率 由于腐霉菌也是根腐病常見(jiàn)致病菌之一 所以采用黃瓜誘生法確定韭菜根腐病病根是否為腐霉 菌侵染造成 將黃瓜洗凈表面后切成 1 cm 的小段 置于滅菌培養(yǎng)皿中 將表面消毒后的韭菜病根放 在黃瓜段切面上 18 誘發(fā) 5 d 后鏡檢 1 4 病原菌致病性測(cè)定 將健康的 2 年生韭菜秧苗根系用鋼絲球刮出微傷后栽回營(yíng)養(yǎng)缽中 每缽澆灌 50 mL 孢子懸浮液 對(duì)照澆灌等量無(wú)菌水 每個(gè)處理 5 個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽 逐日觀察發(fā)病情況 30 d 后撥出韭菜秧苗 取病健交 界處組織再次分離鑒定病原菌 并統(tǒng)計(jì)感染指數(shù) 1 5 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定 病原菌在 PDA 平板上活化培養(yǎng) 3 d 從菌落邊緣打取直徑 5 mm 的菌餅 備用 進(jìn)行不同溫度 10 15 20 25 30 35 40 不同 pH 4 11 用 1 mol L 1 HCl 和 1 mol L 1 NaOH 調(diào) 節(jié) 不同碳源 PDA 培養(yǎng)基中的葡萄糖分別用蔗糖 菊糖 山梨糖 木糖 乳糖 果糖 鼠李糖 和甘露糖置換 不同氮源 PDA 培養(yǎng)基中分別添加 0 5 氯化銨 硝酸鈉酸鉀 酒石酸銨 甘 氨酸 胱氨酸 丙氨酸 以及不同光照條件 全光照 全黑暗 12 h 光暗交替 處理 每處理接 種 3 個(gè)培養(yǎng)皿 重復(fù) 3 次 25 不同溫度處理依設(shè)計(jì) 恒溫培養(yǎng) 5 d 后用十字交叉法測(cè)菌落直徑 進(jìn)行菌絲致死溫度 40 45 50 55 60 65 70 75 試驗(yàn) 每個(gè)處理 5 個(gè)菌餅轉(zhuǎn)入 PDA 培 養(yǎng) 重復(fù) 3 次 進(jìn)行孢子致死溫度 40 44 48 52 56 60 64 68 72 試驗(yàn) 每個(gè)處理 3 Gao Xiaomei L Guozhong Li Yang Ao Jing Liu Xiaohui Sun Yulu Identification of the pathogens causing root rot on Allium tuberosum and study on their biological characteristics 896 Acta Horticulturae Sinica 2022 49 4 893 906 滴懸浮液置于載玻片上 24 h 后觀察萌發(fā)情況 重復(fù) 3 次 用 Excel 和 DPS12 0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分 析 Duncan s 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn) 2 結(jié)果與分析 2 1 韭菜根腐病發(fā)病情況及其典型癥狀 通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn) 韭菜根腐病在遼寧省保護(hù)地普遍發(fā)生 常年發(fā)病率 5 20 病情指數(shù)可達(dá) 10 56 保護(hù)地韭菜苗期至成株期均可發(fā)生 田間 發(fā)病呈斑塊狀 發(fā)病面積逐年增大 加重 病原 菌主要危害根系 根系受侵染后 初期變褐 腐爛 部分根系失去營(yíng)養(yǎng)吸收功能而導(dǎo)致地上部葉尖 變黃 生長(zhǎng)緩慢 隨著受害根系增多 植株逐漸細(xì)弱 最終凋亡 圖 1 圖 1 韭菜鐮孢菌根腐病癥狀 a 韭菜根腐病地上部典型癥狀 b 健康根系 c 根腐病根系 Fig 1 The symptom of Allium tuberosum root rot a Above ground symptom on plant b Healthy root c Rot root 發(fā)病初期鱗莖的基盤表現(xiàn)健康 腐爛僅限根系組織 無(wú)維管束侵染癥狀 圖 2 a b 發(fā)病嚴(yán) 重后基盤受損 根系再生受限 根系 鱗莖等干腐 導(dǎo)致病株死亡 據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)到 為害韭菜根系的病害較少 除了立枯絲核菌引起的韭菜根腐病外 在保護(hù) 地生產(chǎn)中韭菜鐮孢菌根腐病易與韭菜鱗莖腐病 bulb rot 混淆 Yamazaki 等 2013 報(bào)道日本韭菜 保護(hù)地廣泛發(fā)生韭菜鱗莖腐病 F proliferatum 病原菌侵染鱗莖引起病株葉片萎蔫 葉尖變黃 生長(zhǎng)緩慢最后停止 基盤維管束變褐明顯 圖 2 c d 根系也隨之逐漸變褐 腐爛 韭菜鱗莖 腐病是一種系統(tǒng)侵染病害 病原菌侵染后維管束組織變褐明顯 基盤與根系變褐腐爛 植株迅速萎 蔫死亡 韭菜作為一種多年生草本作物 其根系具有強(qiáng)大的再生代償能力 因此韭菜根腐病發(fā)生初 期具有一定的隱蔽性 隨著發(fā)病日趨嚴(yán)重導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降 甚至絕收毀棚 高曉梅 呂國(guó)忠 李 楊 敖 靜 劉曉輝 孫玉祿 設(shè)施韭菜根腐病致病鐮孢菌鑒定及生物學(xué)特性研究 園藝學(xué)報(bào) 2022 49 4 893 906 897 圖 2 韭菜鐮孢菌根腐 鱗莖腐病株鱗莖剖面對(duì)比圖 a b 根腐病鱗莖剖面 c d 鱗莖腐病鱗莖剖面 Yamazaki et al 2013 e 健康鱗莖剖面 Fig 2 The different basal bulb of Allium tuberosum on root rot and bulb rot a b Basal bulb of root rot c d Basal bulb of bulb rot Yamazaki et al 2013 e Basal bulb of healthy root 2 2 設(shè)施韭菜根際真菌分離鑒定 采用形態(tài)學(xué)鑒定方法對(duì)遼寧省 8 個(gè)地區(qū)采集的 56 份韭菜根腐病病根進(jìn)行病原真菌分離鑒定 獲得 10 個(gè)屬 448 個(gè)真菌菌株 包括鐮孢菌屬 Fusarium 青霉菌屬 Penicillium 炭疽菌屬 Colletotrichum 疫霉屬 Phytophthora 粘帚霉屬 Gliocladium 絲核菌屬 Rhizoctonia 木 霉屬 Thichoderma 漆斑菌 Myrraherium 和地霉屬 Geotrichum 以及未定屬 1 個(gè) 其中鐮孢 菌屬真菌 395 株 占 88 17 是韭菜根腐病患病根組織上的優(yōu)勢(shì)菌 其經(jīng)純化后單孢分離獲得 45 個(gè)菌株 鐮孢菌屬菌株中尖孢鐮孢菌復(fù)合群分離頻率最高 各地區(qū)稍有差異 分別為 69 45 77 02 層出鐮孢菌復(fù)合類群分離頻率稍低 為 28 65 24 95 腐皮鐮孢菌分離頻率最低 一 般為 2 29 4 16 另外其他鐮孢菌菌株分離頻率在 3 17 以下 除鐮孢菌屬外 分離獲得的常見(jiàn)植物致病菌還包括絲核菌 炭疽菌 疫霉屬 但分離頻率很低 分別為 1 55 2 90 1 63 推測(cè)屬于機(jī)會(huì)病原菌或腐生菌 另外粘帚霉 木霉 毛殼 地霉和 1 個(gè)未定屬等非致病菌分離頻率很低 合計(jì) 5 75 黃瓜誘發(fā)法鏡檢未發(fā)現(xiàn)腐霉菌 鐮孢菌檢出率 96 25 其中尖孢鐮孢菌 81 50 層出鐮孢菌 12 10 腐皮鐮孢菌 2 65 其他菌和空白占 3 75 2 3 鐮孢菌形態(tài)學(xué)鑒定 將 45 個(gè)鐮孢菌純化菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定 獲得具有細(xì)微形態(tài)學(xué)差異的菌株 10 株 將此 10 株鐮孢菌在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)和觀察 參照 Booth 1971 Leslie 和 Summerell 2006 劃分 為 3 個(gè)類群 分別為尖孢鐮孢菌復(fù)合群 Fusarium oxysporum species complex FOSC 層出鐮孢菌 Gao Xiaomei L Guozhong Li Yang Ao Jing Liu Xiaohui Sun Yulu Identification of the pathogens causing root rot on Allium tuberosum and study on their biological characteristics 898 Acta Horticulturae Sinica 2022 49 4 893 906 復(fù)合群 F proliferatum species complex FPSC 和腐皮鐮孢菌復(fù)合群 F solani species complex FSSC 尖孢鐮孢菌 FOSC 以 CY C11 菌株為代表 在 PDA 上 27 培養(yǎng) 5 d 氣生菌絲大量 菌落 初為白色 后逐漸變?yōu)樽仙?可產(chǎn)生紫色到深紫色色素 直徑達(dá) 6 58 cm 圖 3 a 氣生菌絲上產(chǎn) 孢梗大量 為較短的單瓶梗 圖 3 b 氣生菌絲上產(chǎn)生大量的小型分生孢子 卵形或棒槌形 頂 端略膨大 基部平截 假頭生 多為 0 隔 偶爾見(jiàn) 1 隔 大小 4 7 15 1 m 2 2 4 3 m 圖 3 c 培養(yǎng)后期可產(chǎn)生大量分生孢子座 大型分生孢子細(xì)長(zhǎng) 兩端略彎曲 呈舟形 多為 3 5 隔 21 4 49 3 m 2 3 4 9 m PDA PSA 和 SNA 培養(yǎng)基上均可見(jiàn) 圖 3 d 厚垣孢子多 見(jiàn) 球形或橢圓形 單生 對(duì)生或串生 圖 3 尖鐮孢菌菌落形態(tài)及顯微形態(tài) a PDA 上 5 d 菌落形態(tài) 正反面 b 產(chǎn)孢梗 c 小型分生孢子 d 大型分生孢子 橙色粘孢團(tuán) Fig 3 Morphological characteristics of Fusarium oxysporum a Colony on PDA surface and bottom b Conidiophore c Microconidia d Macroconidia in orange slime 層出鐮孢菌 FPSC 以 JZ B421 菌株為代表 在 PDA 上 27 培養(yǎng) 5 d 氣生菌絲絲絨狀至粉 狀 菌落初為白色 后逐漸變?yōu)榉凵练圩仙?可產(chǎn)生深粉色色素 直徑達(dá) 6 05 cm 圖 4 a 氣 生菌絲上產(chǎn)孢梗大量 分枝較多 為單瓶梗或?qū)映鰪?fù)瓶梗 氣生菌絲上產(chǎn)生大量的小型分生孢子 卵形或棒槌形 頂端略膨大 基部平截 多為 0 隔 偶爾見(jiàn) 1 隔 大小 4 7 16 5 m 2 2 4 5 m 圖 4 b 串生形成短串 斜疊生或聚生 圖 4 d 大型分生孢子細(xì)長(zhǎng) 兩端略彎曲 呈舟形 多為 3 5 隔 22 6 49 3 m 2 6 4 8 m 圖 4 c 產(chǎn)生于 SNA 培養(yǎng)基上 且產(chǎn)生大量 的厚垣孢子 腐皮鐮孢菌 FSSC 以 CY B131 菌株為代表 在 PDA 培養(yǎng)基上 27 培養(yǎng) 5 d 氣生菌絲薄絨 狀 白至淺灰色 菌落呈白色 不產(chǎn)生色素 直徑為 5 56 cm 圖 5 a 氣生菌絲上產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為長(zhǎng) 筒形單瓶梗 長(zhǎng)度通常大于 50 m 不分枝或稀少分枝 圖 5 b 小型分生孢子圓形 卵圓形 腎形等 壁較厚 0 1 個(gè)隔膜 大小 10 7 18 1 m 2 9 5 7 m 大型分生孢子馬特型 兩端較頓 頂部稍尖 壁較厚 2 8 個(gè)隔膜 多數(shù) 3 5 個(gè)隔膜 大小 14 4 42 6 m 3 5 6 5 m 圖 5 c 厚垣孢子多 圓形 壁光滑 單生或?qū)ι?直徑 6 3 9 8 m 高曉梅 呂國(guó)忠 李 楊 敖 靜 劉曉輝 孫玉祿 設(shè)施韭菜根腐病致病鐮孢菌鑒定及生物學(xué)特性研究 園藝學(xué)報(bào) 2022 49 4 893 906 899 圖 4 層出鐮孢菌菌落形態(tài)及顯微形態(tài) a PDA 上 5 d 菌落形態(tài) 正反面 b 產(chǎn)孢梗和小型分生孢子 c 串生小型分生孢子 d 小型和大型分生孢子 Fig 4 Morphological characteristics of Fusarium proliferatum a Colony on PDA surface and bottom b Conidiophore and microconidia c Microconidia in chain d Microconidia and macroconidia 圖 5 腐皮鐮孢菌菌落形態(tài)及顯微形態(tài) a PDA 上 5 d 菌落形態(tài) 正反面 b 產(chǎn)孢梗和分生孢子 c 小型分生孢子和大型分生孢子 Fig 5 Morphological characteristics of Fusarium solani a Colony on PDA surface and bottom b Conidiophore and conidia c Microconidia and macroconidia 2 4 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析 分別利用 3 對(duì)引物 EF1Ha EF2Tb H3 1a H3 1b iNL11 iCNS1 進(jìn)行病原菌基因組 DNA 擴(kuò)增 得到大小分別約為 710 550 2 350 bp 的擴(kuò)增條帶 基于 EF 1a 和 Histone3 部分序列構(gòu)建的最大似 然樹(shù)分別見(jiàn)圖 6 和圖 7 分離自韭菜根上的 10 株鐮孢菌歸入 3 個(gè)復(fù)合類群 其中 CY C11 CY B121 CY B122 JZ B21 JZ B511 菌株屬于尖孢鐮孢菌復(fù)合群 JZ B421 JZ C32 菌株屬于層出鐮孢菌 復(fù)合群 CY A11 CY B131 JZ B22 菌株屬于腐皮鐮孢菌復(fù)合群 基于 IGS 部分序列構(gòu)建的最大似然樹(shù)見(jiàn)圖 8 3 株腐皮鐮孢菌未擴(kuò)增出適合的條帶 剩余 7 株 鐮孢菌與其他基因序列結(jié)果基本一致 分別歸屬于尖孢鐮孢菌和層出鐮孢菌 其中 CY C11 CY B121 與 CY B122 JZ B21 與 JZ B511 分別與 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中不同的鐮孢菌菌株形成親緣關(guān)系 較近的譜系 推斷由于 IGS 基因擴(kuò)增片段較長(zhǎng) 對(duì)同一種內(nèi)鐮孢菌的區(qū)分度較好 Gao Xiaomei L Guozhong Li Yang Ao Jing Liu Xiaohui Sun Yulu Identification of the pathogens causing root rot on Allium tuberosum and study on their biological characteristics 900 Acta Horticulturae Sinica 2022 49 4 893 906 圖 6 基于 EF 1a 基因序列構(gòu)建的韭菜根腐病菌的最大簡(jiǎn)約樹(shù) Fig 6 Most parsimonious tree based on EF 1a gene sequence of chive Fusarium root rot pathogen and related fungi 圖 7 基于 Histone3 基因序列構(gòu)建的韭菜根腐病菌的最大簡(jiǎn)約樹(shù) Fig 7 Most parsimonious tree based on Histone3 gene sequence of chive Fusarium root rot pathogen and related fungi 高曉梅 呂國(guó)忠 李 楊 敖 靜 劉曉輝 孫玉祿 設(shè)施韭菜根腐病致病鐮孢菌鑒定及生物學(xué)特性研究 園藝學(xué)報(bào) 2022 49 4 893 906 901 圖 8 基于 IGS 基因序列構(gòu)建的韭菜根腐病菌的最大簡(jiǎn)約樹(shù) Fig 8 Most parsimonious tree based on IGS gene sequence of chive Fusarium root rot pathogen and related fungi 2 5 致病性測(cè)定 健康的韭菜根系分別接種尖孢鐮孢菌 CY C11 層出鐮孢菌 JZ B421 和腐皮鐮孢菌 CY B131 后均發(fā)生根腐 癥狀表現(xiàn)與田間癥狀基本一致 圖 9 從發(fā)病韭菜根部再次分離出的 病原菌 其菌落的外部形態(tài)特征 如菌落質(zhì)地 顏色 大小等 分生孢子的類型 大小 分隔數(shù)及 形狀 產(chǎn)孢細(xì)胞的結(jié)構(gòu)等 都與接種的菌株相同 圖 9 韭菜根腐病人工接種根系發(fā)病癥狀 Fig 9 The symptom of chive root rot after artificial inoculation of three Fusarium species Gao Xiaomei L Guozhong Li Yang Ao Jing Liu Xiaohui Sun Yulu Identification of the pathogens causing root rot on Allium tuberosum and study on their biological characteristics 902 Acta Horticulturae Sinica 2022 49 4 893 906 3 種鐮孢菌均可引起韭菜根腐病 發(fā)病率可達(dá) 95 以上 病情指數(shù)在 80 以上 表 1 說(shuō)明尖 孢鐮孢菌 層出鐮孢菌和腐皮鐮孢菌均為韭菜鐮孢菌根腐病的致病菌 其中尖孢鐮孢菌和腐皮鐮孢 菌致病性強(qiáng)于層出鐮孢菌 鑒于田間根腐病中尖孢鐮孢菌分離頻率最高且致病性較強(qiáng) 可以說(shuō)明尖 孢鐮孢菌菌是韭菜根腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌 腐皮鐮孢菌在田間感病根系分離頻率不足 10 而在致病 性測(cè)定中表現(xiàn)很強(qiáng)的致病力 推斷人為將根系刮傷有助于其侵染 層出鐮孢菌同樣具有較強(qiáng)的致病 性 且在某些韭菜栽培區(qū)其導(dǎo)致根腐病的比例較高 也是韭菜根腐病的重要病原之一 表 1 3 種韭菜鐮孢菌對(duì)韭菜根系的致病性 Table 1 The pathogenicity of three Fusarium species to chive root 病原菌 Pathogens 發(fā)病率 Morbidity 病情指數(shù) Disease index 尖孢鐮孢菌 F oxysporum 96 88 1 46 ab 87 01 1 79 a 層出鐮孢菌 F proliferatum 95 71 1 21 b 80 83 2 08 b 腐皮鐮孢菌 F s o la n i 98 90 0 33 a 86 18 1 51 a 注 表中數(shù)據(jù)為平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差 n 5 同列不同小寫(xiě)字母表示各處理差異顯著水平 P 0 05 Note Data in the table are mean S D n 5 Different letters in the same column mean significant difference at P 0 05 level 2 6 病原菌生物學(xué)特性 如表 2 所示 3 株病原菌在 9 種供試碳源上均可較好地生長(zhǎng) 但利用能力差異顯著 尖孢鐮孢 菌對(duì)蔗糖 菊糖 葡萄糖 乳糖 鼠李糖等多種碳源利用良好 其他碳源次之 而層出鐮孢菌和腐 皮鐮孢菌則僅在鼠李糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快 3 種病原菌均在含山梨糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢 表 2 營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件對(duì) 3 種病原鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響 Table 2 Effects of nutrients and culturing conditions on the mycelium growth of three Fusarium species 試驗(yàn) Test 培養(yǎng)條件 Culture condition 菌落直徑 mm Colony diameter 尖孢鐮孢菌 F oxysporum 層出鐮孢菌 F proliferatum 腐皮鐮孢菌 F solani 碳源 Carbon source 蔗糖 Sucrose 83 94 0 50 a 69 86 1 78 c 57 75 0 40 c 菊糖 Inulin 83 85 1 20 a 76 21 0 53 b 58 07 0 22 c 葡萄糖 Glucose 84 64 2 39 a 67 48 1 03 c 56 66 0 15 c 山梨糖 Sorbose 68 96 0 76 c 53 79 1 98 e 51 26 0 75 d 木糖 Xylose 68 71 1 60 c 62 91 1 77 d 57 72 1 02 c 乳糖 Lactose 83 74 0 50 a 76 65 1 23 b 60 61 1 18 b 果糖 Fructose 75 96 1 28 b 66 64 3 28 c 57 08 2 88 c 鼠李糖 Rhamnose 82 53 0 87 a 82 02 2 36 a 65 21 1 21 a 甘露糖 Mannose 78 38 3 62 b 74 52 1 07 b 58 47 0 66 c 氮源 Nitrogen source NH 4 Cl 77 01 1 71 a 58 51 1 55 c 51 01 1 80 d NaNO 3 74 32 0 76 a 62 74 2 55 b 59 68 0 49 b KNO 3 68 42 2 47 bcd 66 70 1 39 a 54 82 2 74 c 酒石酸銨 Ammonium tartrate 58 06 3 62 e 48 73 1 55 d 55 22 1 40 c 甘氨酸 Glycine 72 57 1 97 ab 56 06 0 28 c 63 22 2 90 a 胱氨酸 Cystine 65 15 3 84 d 65 64 0 81 ab 59 86 1 54 b 丙氨酸 Alanine 66 22 4 71 cd 56 94 1 32 c 61 47 2 09 a CK PDA 71 67 2 99 abc 56 92 4 16 c 61 40 0 32 a 溫度 Temperature 10 15 19 0 35 e 16 04 0 37 f 12 29 0 32 e 15 42 66 0 77 d 43 54 0 83 e 29 66 1 09 d 20 57 31 2 04 c 55 81 0 41 d 43 04 1 56 c 25 72 46 2 10 b 71 26 2 07 b 52 25 1 17 b 30 78 39 3 83 a 74 82 1 61 a 56 86 1 06 a 35 71 74 1 83 b 70 66 1 75 b 54 47 1 83 ab 40 58 16 3 70 c 67 06 1 41 c 45 09 2 41 c 高曉梅 呂國(guó)忠 李 楊 敖 靜 劉曉輝 孫玉祿 設(shè)施韭菜根腐病致病鐮孢菌鑒定及生物學(xué)特性研究 園藝學(xué)報(bào) 2022 49 4 893 906 903 續(xù)表 2 試驗(yàn) Test 培養(yǎng)條件 Culture condition 菌落直徑 mm Colony diameter 尖孢鐮孢菌 F oxysporum 層出鐮孢菌 F proliferatum 腐皮鐮孢菌 F solani pH 4 41 91 0 91 c 44 32 0 26 e 30 95 3 11 e 5 56 01 0 32 b 55 27 1 54 d 47 47 1 24 cd 6 61 13 0 24 a 72 11 0 28 b 49 40 0 30 bcd 7 62 56 2 27 a 76 07 2 72 a 51 52 0 78 ab 8 60 81 4 95 a 68 36 1 30 c 54 80 2 09 a 9 60 75 3 20 a 67 35 0 13 c 52 27 1 76 ab 10 53 74 0 73 b 65 87 1 08 c 50 74 1 67 bc 11 52 46 0 34 c 44 31 2 18 e 46 59 3 68 d 光照 Illumination 全光照 Full illumination 70 28 1 44 c 67 42 3 54 b 50 17 3 30 b 全黑暗 Full darkness 78 34 0 84 a 75 27 0 81 a 60 02 1 36 a 12 h 光照 12 h 黑暗 12 h illumination 12 h darkness 73 28 1 34 b 70 54 1 51 ab 56 86 0 86 a 注 表中數(shù)據(jù)為平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差 n 3 同列不同小寫(xiě)字母表示各處理差異顯著水平 P 0 05 Note Data in the table are mean S D n 3 Different letters in the same column mean significant difference at P 0 05 level 3 株病原菌在 8 種氮源上均可生長(zhǎng) 尖孢鐮孢菌在含氯化銨 硝酸銨的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好 其 次是甘氨酸和對(duì)照培養(yǎng)基 層出鐮孢菌在含硝酸鉀的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最優(yōu) 其次是胱氨酸和硝酸鈉 腐皮鐮孢菌在含有硝酸鈉 胱氨酸 丙氨酸及對(duì)照培養(yǎng)基生長(zhǎng)最好 其次是硝酸鉀和酒石酸銨 病原菌菌絲在 10 40 均能生長(zhǎng) 25 35 菌絲生長(zhǎng)較快 30 時(shí)生長(zhǎng)最快 菌絲致密 較前人報(bào)道的 28 稍高 這是否由于設(shè)