八仙花萼片有色原生質(zhì)體游離及應(yīng)用.pdf

中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報 2022 24 9 50 57 JournalofAgriculturalScienceandTechnology 八仙花萼片有色原生質(zhì)體游離及應(yīng)用 張蓋天 祁惠 楊鎖寧 褚志云 袁素霞 劉春 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 北京100081 摘 要 為建立八仙花 Hydrangea macrophylla 有色原生質(zhì)體游離體系 以八仙花萼片為試驗(yàn)材料 分別對材 料的預(yù)處理方式 酶液組分 酶解時間 純化離心力等影響酶解的關(guān)鍵因素進(jìn)行研究 結(jié)果表明 預(yù)處理方式 選擇分離花萼片上下表皮法 纖維素酶和離析酶水平分別為4 和0 4 質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 甘露醇0 6mol L 1 酶解液加熱冷卻后加入0 1 質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) BSA和10mmol L 1 CaCl 2 酶解2h 低溫離心機(jī)4 1426r min 1 離心5min 為最優(yōu)的八仙花萼片原生質(zhì)體游離條件 利用所建的原生質(zhì)體游離體系對4個不同品種的八仙花 萼片進(jìn)行有色原生質(zhì)體游離 200 鏡下單視野內(nèi)可獲得13 35個有色的原生質(zhì)體 對有色原生質(zhì)體進(jìn)行液泡 的H 流測定 發(fā)現(xiàn)藍(lán)色液泡較粉色液泡H 流的外排趨勢明顯 說明同一八仙花品種藍(lán)色液泡的pH高于粉色 液泡 關(guān)鍵詞 八仙花 有色原生質(zhì)體游離 液泡離子流 doi 10 13304 j nykjdb 2021 0372 中圖分類號 S682 1 9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1008 0864 2022 09 0050 08 Isolation and Application of Sepal Colored Protoplast in Hydrangea macrophylla ZHANGGaitian QIHui YANGSuoning CHUZhiyun YUANSuxia LIUChun InstituteofVegetablesandFlowers ChineseAcademyofAgriculturalSciences Beijing100081 China Abstract In order to establish isolation system of sepals colored protoplast in Hydrangea macrophylla sepals of Hydrangea macrophylla were used as experimental materials The factors influencing enzymolysis were analyzed suchastreatedmethodsofsepals thecomponentsofenzymatichydrolysates enzymolysistime centrifugalspeeds etc Theresultsshowedthattheoptimalprocedureofenzymolysiswasfollowedwiththetoringepidermisofsepals 4 w v cellulase 0 4 w v macerozyme 0 6 mol L 1 mannitol and 0 1 w v BSA 10 mmol L 1 CaCl 2 enzymolysisfor2h and1426r min 1 centrifugeat4 Thissystemwasusedtoisolatesepalcoloredprotoplastof4 Hydrangea macrophylla cultivars and 13 35 protoplasts per microscope vision at 200 were obtained H flux measurementshowedthattheH effluxingtendencyofbluevacuoleswasmoreobviousthanthatofpinkvacuolesin thesamecultivar itindicatedthatpHinbluevacuoleswashigherthanthatinpinkvacuolesofsamecultivar Key words Hydrangea macrophylla coloredprotoplastisolation vacuoleionflux 八仙花 Hydrangea macrophylla 又名繡球花 為虎耳草科八仙花屬植物 觀賞部位為大部分不 孕花及其萼片組成的傘狀頂生花序 1 原產(chǎn)于中 國 日本等國家 2 3 八仙花品種眾多 花色豐富 花型繁多 在歐美地區(qū)被廣泛應(yīng)用于庭院綠化 切 花等 近年來 八仙花盆栽 切花和干花也受到越 來越多中國消費(fèi)者的喜愛 八仙花具有特殊的栽培學(xué)特性 即在合適的 土壤pH條件下 部分品種施鋁處理后花萼片顏色 會由原本的粉色變?yōu)樗{(lán)色 4 因此 八仙花花色變 收稿日期 2021 05 06 接受日期 2021 09 22 基金項(xiàng)目 中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng) IVF BRF2020021 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目 CAAS ASTIP 2020 IVFCAAS 聯(lián)系方式 張蓋天E mail gaitianzhang 通信作者袁素霞E mail yuansuxia 劉春E mail liuchun 9期 張蓋天等 八仙花萼片有色原生質(zhì)體游離及應(yīng)用 化機(jī)理逐漸成為研究熱點(diǎn) 八仙花萼片有色細(xì)胞 主要集中于花萼片上表皮下部和葉肉細(xì)胞上部的 組織中 5 為方便對有色細(xì)胞獨(dú)有的生理與分子 特性進(jìn)行深入研究 揭示花器官有色細(xì)胞中特有 的膜結(jié)構(gòu) 蛋白結(jié)構(gòu)及功能 6 10 需將組織中的有 色細(xì)胞與無色細(xì)胞有效分離 因此 必需建立八仙 花萼片有色原生質(zhì)體游離體系 原生質(zhì)體是細(xì)胞 除去細(xì)胞壁后所得的由膜包裹的結(jié)構(gòu) 包括膜結(jié) 構(gòu) 液泡 細(xì)胞核 質(zhì)體及線粒體等 其中 液泡是 植物儲藏色素類物質(zhì)的器官 成熟細(xì)胞的液泡體 積約占細(xì)胞體積的90 11 即在顯微鏡下觀察到 的有色細(xì)胞液泡內(nèi)含有色素類物質(zhì) 而無色細(xì)胞 液泡內(nèi)不含色素類物質(zhì) 原生質(zhì)體用途廣泛 主要用于瞬時表達(dá) 如亞 細(xì)胞定位 12 原生質(zhì)體融合 13 等 其游離受諸多因素 影響 主要包括植物組織材料類型 14 預(yù)處理方 式 12 酶濃度及配比 15 滲透壓 16 酶解時間 17 和離心 力 18 等 目前 在擬南芥 Arabidopsisthaliana 19 和水 稻 Oryza sativa 20 中已建立了成熟的原生質(zhì)體游離 體系 而關(guān)于八仙花有色原生質(zhì)體游離體系的研 究尚未見報道 極大地限制了八仙花花色形成機(jī)理 的相關(guān)研究 因此 本研究擬建立高效的八仙花有 色細(xì)胞原生質(zhì)體游離體系 并應(yīng)用于不同品種八仙 花萼片的原生質(zhì)體游離 以期為后續(xù)八仙花有色細(xì) 胞瞬時轉(zhuǎn)化相關(guān)研究 細(xì)胞水平上的生理生化研究 以及單細(xì)胞測序奠定基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 供試材料 本研究選用種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地 的4個八仙花 Hydrangea macrophylla 品種 Bailmer BabyBlue Bela 和 Duro 進(jìn)行研究 所有材料均 選用盛花期萼片 其中 Bailmer BabyBlue 和 Bela 在不施鋁栽培條件下花萼片呈粉色 施鋁栽 培條件下花萼片呈藍(lán)色 Duro 在施鋁和不施鋁栽 培條件下萼片顏色變化較小 基本均呈品紅色 1 2 試劑和儀器 試 劑 纖 維 素 酶 cellulase 離 析 酶 macerozymeR 10 甘露醇 D mannitol 嗎啉乙 磺酸 morpholineethylsulfonicacid MES 三羥甲 基氨基甲烷 Tris 牛血清蛋白 bovine serum albumin BSA KCl NaCl MgSO 4 7H 2 O 乙二醇雙 2 氨基乙基醚 四乙酸 ethyleneglycoltetraacetic acid EGTA 和甘油 glycerol 購自于北京拜爾迪 生物技術(shù)有限公司 聚 L 賴氨酸 poly L lysine 購 自于西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司 CaCl2購自 于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 儀器 電子天平 BSM 220 4 上海卓精電子科 技有限公司 恒溫震蕩儀 MQT 60R 上海旻泉儀 器有限公司 離心機(jī) BY 80C 北京白洋醫(yī)療器 械有限公司 低溫離心機(jī) 1 14K Sigma 倒置顯 微鏡 DMIL LED Leica 非損傷微測儀 NMT YG 100 Younger 1 3 原生質(zhì)體游離 取盛花期萼片0 8 1 0g 經(jīng)預(yù)處理后 立即移 至含有10mL酶解液的離心管中 之后 將離心管 放置在恒溫震蕩儀 28 40r min 1 內(nèi)進(jìn)行酶解 待酶解后 將混合液置于200目篩網(wǎng)過濾殘?jiān)?所 得濾液倒入燒杯中 將所得濾液移至10mL離心管 中 并用改良后的W5洗液 19 154mmol L 1 NaCl 125mmol L 1 CaCl 2 5mmol L 1 KCl和4mmol L 1 MES TrispH6 3 滅菌 4 保存 輕柔沖洗濾網(wǎng)上 的殘?jiān)盁?沖洗后的液體移入離心管中 2000r min 1 離心5min 棄上清 沉淀由W5洗液重 懸后移至1 5mL離心管中 低溫 4 離心5min 棄上清 最后 用200 L儲存液 5 將離心管中的沉 淀懸浮 4 保存 酶解液配制方法 將纖維素酶 離析酶 甘露醇和20mmol L 1 pH6 3的MES Tris 混勻后于55 水浴10min 待冷涼至室溫后加入 0 1 質(zhì)量體積比 BSA和10mol L 1 CaCl 2 儲存液 配制方法 甘露醇 2mmol L 1 MgSO 4 10mmol L 1 KCl 20mmol L 1 MES Tris 5mmol L 1 EGTA pH 6 0 和2 質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 甘油 滅菌 4 保存 采用單因素試驗(yàn)設(shè)計 分別設(shè)置不同預(yù)處理方 式 酶濃度 酶解時間 甘露醇濃度 離心力 添加 BSA和CaCl 2 對原生質(zhì)體游離體系和方法進(jìn)行 優(yōu)化 1 4 單因素實(shí)驗(yàn) 1 4 1 試驗(yàn)材料預(yù)處理方式 對試驗(yàn)材料采用 2種不同的預(yù)處理方式進(jìn)行處理 分別為 花萼片 切絲法 花萼片上下表皮分離法 原生質(zhì)體游離 所用的纖維素酶和離析酶濃度分別為4 和0 4 質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 甘露醇濃度為0 6mol L 1 酶解 時間2h 4 條件下1426r min 1 離心 儲存液甘 51 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報 24卷 露醇濃度為0 6mol L 1 其余同1 3 1 4 2 酶濃度 設(shè)置纖維素酶質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別 為2 4 6 和8 離析酶的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別 為0 2 0 4 0 6 和0 8 試驗(yàn)材料預(yù)處理方式 采用花萼片上下表皮分離法 甘露醇0 6mol L 1 酶 解時間2h 4 條件下1426r min 1 離心5min 儲存 液甘露醇0 6mol L 1 其余同1 3 1 4 3 酶解時間 酶解時間設(shè)4個水平 分別為 1 2 3和4h 試驗(yàn)材料預(yù)處理方式采用花萼片上 下表皮分離法 纖維素酶與離析酶濃度質(zhì)量體積 比分?jǐn)?shù)分別為4 和0 4 甘露醇0 6mol L 1 4 條件下1426r min 1 離心5min 儲存液甘露 醇0 6mol L 1 其余同1 3 1 4 4 甘露醇 對酶解液與儲存液中的甘露醇分 別設(shè)0 4 0 6和0 8mol L 1 3個梯度 試驗(yàn)材料預(yù)處 理方式為花萼片上下表皮分離法 纖維素酶與離析 酶質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為4 和0 4 酶解時間2h 4 條件下1426r min 1 離心5min 其余同1 3 1 4 5 添加BSA和CaCl 2 酶與甘露醇融于含 20mmol L 1 MES Tris pH6 3 的溶液并水浴后 加入 0 1 質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) BSA和10mmol L 1 CaCl 2 以不加BSA和CaCl 2 的酶解液為對照 試 驗(yàn)材料預(yù)處理方式均為花萼片上下表皮分離法 纖維素酶與離析酶質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為4 和 0 4 甘露醇0 6mol L 1 酶解時間2h 4 條件 下1426r min 1 離心5min 其余同1 3 1 4 6 離心力 在4 條件下 分別用1164 1426 1646和1841r min 1 離心5min 試驗(yàn)材 料預(yù)處理方式為花萼片上下表皮分離法 纖維素 酶與離析酶質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為4 和0 4 甘 露醇0 6mol L 1 酶解時間2h 其余同1 3 1 5 游離原生質(zhì)體計數(shù) 使原生質(zhì)體均勻懸浮后 分別制片3張 每張 滴30 L懸浮液后覆24mm 50mm蓋玻片 鏡檢 拍照 分別從3張制片中選取9張鏡檢圖并統(tǒng)計有 色原生質(zhì)體數(shù)量 SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖 1 6 液泡H 流測定 將牙簽尖頭部用少量脫脂棉包裹成拖把狀 蘸取0 008 質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 聚 L 賴氨酸 21 涂抹 在一次性培養(yǎng)皿中 置于冰箱冷藏層晾干備用 使用特定檢測H 流的離子交換液及質(zhì)子選 擇性微電極制作探針 液泡H 流測試液繪制H 流 測定標(biāo)線 吸取部分原生質(zhì)體懸浮液移至培養(yǎng)皿中 加 入特定液泡H 流測試液 避光條件下靜置 使原 生質(zhì)體在重力作用下下沉 根據(jù)陰陽離子互作原 理 聚 L 賴氨酸涂層吸附住原生質(zhì)體 保證非損 傷微測儀質(zhì)子選擇性微電極在運(yùn)行過程中不 移動 分別隨機(jī)選取 BabyBlue 粉色 藍(lán)色原生質(zhì) 體各7個 將探針置于靠近液泡的位置 對其液泡 H Na 流進(jìn)行測定并繪制相應(yīng)測定曲線 導(dǎo)出曲 線相應(yīng)讀數(shù) SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 Origin2018 軟件進(jìn)行繪圖 2 結(jié)果與分析 2 1 單因素對有色原生質(zhì)體酶解的影響 2 1 1 材料預(yù)處理方式對有色原生質(zhì)體游離效率 的影響 對 Bailmer 和 BabyBlue 的粉色和藍(lán) 色花萼片分別采用切絲和上下表皮分離法進(jìn)行處 理 結(jié)果表明 相較于切絲法 萼片上下表皮分離 法更能高效地游離4種花萼片的有色原生質(zhì)體 圖1A 每個視野分別獲得有色原生質(zhì)體11 14 個 Bailmer 和17 22個 BabyBlue 2 1 2 不同酶含量對有色原生質(zhì)體游離效率的影 響 由圖1B可知 當(dāng)纖維素酶與離析酶質(zhì)量體積 分?jǐn)?shù)分別為4 和0 4 時 4份材料所獲得的有 色原生質(zhì)體數(shù)量 每個視野 均顯著高于其他含量 組合 因此 4 和0 4 為纖維素酶與離析酶最 佳酶解含量 2 1 3 不同酶解時間對有色原生質(zhì)體游離效率的 影響 不同的酶解時長的結(jié)果 圖1C 表明 對 Bailmer 藍(lán)色和粉色萼片來說 酶解2h獲得有 色原生質(zhì)體的數(shù)量均顯著高于酶解1 3和4h 而 對于 BabyBlue 藍(lán)色和粉色萼片 酶解1和2h 所得有色原生質(zhì)體的數(shù)量無明顯差異 但均顯著 高于酶解3和4h 綜合考慮 2h為最適酶解 時長 2 1 4 不同甘露醇濃度對有色原生質(zhì)體游離效率 的影響 對酶解液與儲存液中甘露醇的不同濃度 進(jìn)行比較 結(jié)果 圖1D 表明 當(dāng)甘露醇濃度為 0 6mol L 1 時 其滲透壓最適合有色原生質(zhì)體的 解離與儲存 52 9期 張蓋天等 八仙花萼片有色原生質(zhì)體游離及應(yīng)用 2 1 5 添加BSA和CaCl 2 對有色原生質(zhì)體游離效 率的影響 由于前4組酶解離條件篩選試驗(yàn)中 同一八仙花品種不同顏色萼片的有色原生質(zhì)體游 離結(jié)果表現(xiàn)趨勢一致 故本試驗(yàn)只選用了 Bailmer 藍(lán)色萼片和 BabyBlue 粉色萼片為試 驗(yàn)材料 結(jié)果 圖1E 顯示 在酶解液中添加 0 1 BSA和10mmol L 1 CaCl 2 后 Bailmer 藍(lán)色 萼片所得有色原生質(zhì)體的數(shù)量與對照差異不顯 著 但 BabyBlue 粉色萼片在添加0 1 BSA和 10mmol L 1 CaCl 2 后 酶解液中所得有色原生質(zhì) 體的數(shù)量顯著高于對照 綜合考慮 在酶解液中 添加0 1 BSA和10mmol L 1 CaCl 2 效果較好 2 1 6 不同離心力對有色原生質(zhì)體游離效率的影 響 以 Bailmer 藍(lán)色萼片和 BabyBlue 粉色萼 A 預(yù)處理方式 B 酶水平 C 酶解時長 D 甘露醇濃度 E 酶液組分 F 離心速率 不同小寫字母表示不同處理間差異在P 0 05水平顯 著 A Material handling method B Enzymes concentration C Hydrolysis time D Mannitol concentration E Enzyme solution component F Centrifugalspeed differentlowercaselettersindicatesignificantdifferencesbetweendifferenttreatmentsat P 0 05level 圖1 單因素對有色原生質(zhì)體酶解的影響 Fig 1 Effectofsinglefoctoronenzymatichydrolysis 53 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報 24卷 片為材料 分析不同離心力下獲得有色原生質(zhì) 體數(shù)量的差異 結(jié)果 圖1F 顯示 4 條件下 1426r min 1 離心時獲得有色原生質(zhì)體的數(shù)量顯 著高于其他3種離心速率 離心速率過低 不能 有效地沉淀有色原生質(zhì)體 而離心速率過高會破 損有色原生質(zhì)體 降低產(chǎn)量 上述研究表明 采用花萼片上下表皮分離 法 纖維素酶和離析酶的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為 4 和 0 4 加入0 1 質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) BSA和 10 mmol L 1 CaCl 2 酶解時間2 h 4 條件下 1426r min 1 離心5min 甘露醇0 6mol L 1 為八 仙花萼片有色原生質(zhì)體游離的最佳條件 2 2 八仙花萼片有色細(xì)胞原生質(zhì)體酶解體系 應(yīng)用 2 2 1 不同品種中酶解體系的應(yīng)用 按上述最優(yōu) 酶解體系對4個八仙花品種在施鋁處理 Al 3 和 未施鋁處理 CK 條件下的花萼片進(jìn)行有色原生 質(zhì)體游離 將原生質(zhì)體懸浮均勻后制片 200 鏡 下單視野內(nèi)可獲得13 35個有色的原生質(zhì) 體 圖2 圖2 不同品種八仙花花器官及原生質(zhì)體游離示意圖 Bar 50 m Fig 2 Schematicdiagramoffloralorgansandprotoplastdissociationofdifferentspeciesof Hydrangea Bar 50 m 54 9期 張蓋天等 八仙花萼片有色原生質(zhì)體游離及應(yīng)用 2 2 2 液泡H 離子流分析 使用非損傷微測技 術(shù)對八仙花品種 Babyblue 粉色 藍(lán)色液泡的 H Na 流進(jìn)行測定 結(jié)果 圖3 表明 從H 流平均 值來看 藍(lán)色液泡H 流外排趨勢較粉色液泡更加 明顯 由此推斷 藍(lán)色液泡的pH高于粉色液泡 從 Na 流平均值來看 藍(lán)色液泡Na 流吸收趨勢更為 明顯 由此推斷 H 在外流后 液泡吸收Na 來維 持液泡內(nèi)部原有溶質(zhì)含量 3 討論 八仙花萼片酶解游離出的原生質(zhì)體分為有色 原生質(zhì)體與無色原生質(zhì)體兩種 其中 有色原生質(zhì) 體是研究花色形成的重要研究對象 原生質(zhì)體游 離的基礎(chǔ)是酶解細(xì)胞壁釋放原生質(zhì)體 1960年 Cocking 22 首次利用從疣孢菌中獲得的纖維素酶 以番茄根系為材料游離出了原生質(zhì)體 這也是酶 解法游離原生質(zhì)體在植物上的首次應(yīng)用 隨后從 木霉素中提取出纖維素酶 這也是后續(xù)大量原生 質(zhì)體游離試驗(yàn)中使用頻率最高的酶 23 酶解游離 原生質(zhì)體越來越廣泛地應(yīng)用于不同物種 本研究發(fā)現(xiàn) 八仙花萼片原生質(zhì)體游離的數(shù)量 少于其他植物葉片 嫩莖和愈傷組織產(chǎn)生的原生質(zhì) 體數(shù)量 這可能是由組織材料的差異造成 酶解液 更容易浸入疏松的組織 充分與細(xì)胞壁接觸 斷開 纖維鏈并消解果膠 Yoo等 19 對擬南芥葉片原生質(zhì) 體游離時發(fā)現(xiàn) 酶解材料切絲時應(yīng)避免擠壓損傷 因?yàn)閿D壓會造成原生質(zhì)體在細(xì)胞壁構(gòu)筑的小室內(nèi) 破裂 然而 八仙花萼片組織質(zhì)密 韌性強(qiáng) 如果對 萼片采用切絲的預(yù)處理方法 會在創(chuàng)口處留下明顯 的擠壓損傷 導(dǎo)致其原生質(zhì)體游離的難度增大 本 研究發(fā)現(xiàn) 采用分離上下表皮對八仙花萼片進(jìn)行預(yù) 處理 能增加酶液與材料的接觸面積 有利于打破 組織質(zhì)密造成的酶解障礙 顯著增加原生質(zhì)體游離 的數(shù)量 在對不同品種八仙花萼片原生質(zhì)體進(jìn)行 游離時還發(fā)現(xiàn) 花萼片大且厚時 其上下表皮更易 分離 更有利于原生質(zhì)體游離 為了高效地游離原生質(zhì)體 必需配比合適比 例的酶 若酶用量過低 則酶消解細(xì)胞壁的能力 不足以支撐原生質(zhì)體游離工作的完成 若酶用量 過高 則會造成原生質(zhì)體失活 Yoshida等 5 在游 離八仙花萼片有色細(xì)胞原生質(zhì)體時 采用的纖維 素酶與離析酶質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為2 和0 2 但本研究發(fā)現(xiàn) 纖維素酶與離析酶含量分別為4 和0 4 質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 時 酶解產(chǎn)生的有色原生 質(zhì)體數(shù)量顯著高于2 和0 2 纖維素酶與離析 酶水平 另外 BSA能夠有效維持酶活 保障酶 解過程中酶功能的持續(xù)性 24 而Ca 2 能與磷脂類 注 正值為外排 負(fù)值為吸收 Note Positivevaluesareeffluxandnegativevaluesareinflux 圖3 Babyblue 離子流 Fig 3 Babyblue ionflux 55 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報 24卷 物質(zhì)上的負(fù)電荷結(jié)合維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性 在一 定程度上保障原生質(zhì)體的活性 因此 在酶液中加 入0 1 質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) BSA和10mmol L 1 CaCl 2 能獲得更多的原生質(zhì)體 25 此外 若酶解時間較 短 酶液無法與細(xì)胞壁充分反應(yīng) 若酶解時間過 長 會拉長試驗(yàn)周期 原生質(zhì)體會失活 因此 2h 為最優(yōu)酶解時長 甘露醇濃度需匹配細(xì)胞滲透 壓 細(xì)胞滲透壓過小或過大均會造成原生質(zhì)體活 性降低 甚至失活 前人研究 18 26 27 中甘露醇濃度 為0 4 1mol L 1 本研究結(jié)果表明 甘露醇濃度 為0 6mol L 1 時 八仙花有色原生質(zhì)體游離效果 最佳 由于解離花萼片產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量較少 故 需在離心過程中獲得盡可能多的原生質(zhì)體 純化 原生質(zhì)體的方法主要有離心沉降法 18 與密度梯度 自然沉降法 28 離心速率較小或自然沉淀時 部分 原生質(zhì)體會重懸于上清中 若離心速率過大 原生 質(zhì)體會因受機(jī)械損傷而失活 甚至破裂 本研究表 明 4 條件下 最佳離心速率為1426r min 1 原生質(zhì)體游離能有效地分離花萼中有色細(xì)胞 和無色細(xì)胞 以便于研究有色細(xì)胞的生理生化特 性 Yoshida等 5 使用質(zhì)子選擇微電極測得八仙花 藍(lán)色液泡pH約為4 1 紅色液泡約為3 2 本研究 中 Babyblue 藍(lán)色原生質(zhì)體液泡H 流外排 液 泡內(nèi)H 積累減少 pH相對較高 粉色原生質(zhì)體液 泡H 流吸收 液泡內(nèi)H 積累增多 pH相對較低 與前人的研究結(jié)果一致 因此 本研究建立的有 色原生質(zhì)體游離體系為后續(xù)八仙花花色形成機(jī)理 研究奠定了基礎(chǔ) 參 考 文 獻(xiàn) 1 GALOPIN G CODARIN S VIEMONT J D et al Architectural development of inflorescence in Hydrangea macrophylla cv Hermann Dienemann J Hortscience 2008 43 2 361 365 2 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會 中國植物志 第35卷第 1分冊 M 北京 科學(xué)出版社 1995 35 226 3 ITO T AOKI D FUKUSHIMA K et al Direct mapping of hydrangea blue complex in sepal tissues of Hydrangea macrophylla J OL Sci Rep 2019 9 1 5450 2021 03 20 https doi org 10 1038 s41598 019 41968 7 4 SCHREIBERHD Curiouschemistryguides Hydrangeacolors J Am Sci 2014 102 6 444 450 5 YOSHIDA K TOYAMA KATO Y KAMEDA K et al Sepal color variation of Hydrangea macrophylla and vacuolar pH measuredwithaproton selectivemicroelectrode J PlantCell Physiol 2003 44 3 262 268 6 YAMAGUCHI T FUKADA TANAKA S INAGAKI Y et al Genes encoding the vacuolar Na H exchanger and flower coloration J PlantCellPhysiol 2001 42 5 451 461 7 VERWEIJW SPELTC DISANSEBASTIANOGP etal An H P ATPase on the tonoplast determines vacuolar pH and flowercolour J Nat CellBiol 2008 10 12 1456 1462 8 EISENACH C BAETZ U MARTINOIA E Vacuolar proton pumping morethanthesumofitsparts J TrendsPlantSci 2014 19 6 344 346 9 LIY PROVENZANS BLIEKM etal Evolutionoftonoplast P ATPase transporters involved in vacuolar acidification J NewPhytol 2016 211 3 1092 1107 10 FARACO M LI Y B LI S J et al A tonoplast P 3B ATPase mediatesfusionoftwotypesofvacuolesinpetalcells J Cell Rep 2017 19 12 2413 2422 11 布坎南 植物生物化學(xué)與分子生物學(xué) M 北京 科學(xué)出版社 2002 1 40 BUCHANANBB PlantBiochemistryandMolecularBiology M Beijing SciencePress 2002 1 40 12 張婭 劉曉烽 張婧 等 茉莉花原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系的建 立及應(yīng)用 J 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報 自然科學(xué)版 2019 48 6 727 735 ZHANG Y LIU X F ZHANG J et al Development of a protoplast based transient expression system and application in Jasminum sambac J J FujianAgric For Univ Nat Sci 2019 48 6 727 735 13 姚星偉 劉凡 云興福 等 非對稱體細(xì)胞融合獲得花椰菜與 Brassica spinescens的種間雜種 J 園藝學(xué)報 2005 32 6 1039 1044 YAOXW LIUF YUNXF etal InterspecificHybridization between Brassica oleracea L var botrytis and Brassica spinescens via asymmetric somatic protoplast fusion J Acta Hortic Sin 2005 32 6 1039 1044 14 賴葉林 賀瑩 李欣欣 等 一種植物原生質(zhì)體分離與瞬時轉(zhuǎn) 化的方法 J 植物生理學(xué)報 2020 56 4 895 903 LAIYL HEY LIXX etal Anapproachtoisolationand transient transformation of protoplasts in plants J Plant Physiol 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Arabidopsismesophyll protoplasts a versatile cell system for transient gene expressionanalysis J Nat Protocols 2007 2 7 1565 1572 20 ZHANGY SUJ DUANS etal Ahighlyefficientricegreen tissue protoplast system for transient gene expression and studying light chloroplast related processes J OL Plant Methods 2011 7 1 30 2021 03 20 https doi org 10 1186 1746 4811 7 30 21 CHENX BAOH GUOJ etal Na H exchanger1participates in tobacco disease defence against Phytophthora parasitica var nicotianaebyaffectingvacuolarpHandprimingtheantioxidative system J J Exp Bot 2014 65 20 6107 6122 22 COCKINGEC Amethodfortheisolationofplantprotoplasts andvacuoles J Nature 1960 187 962 963 23 COCKING E C Plant cell protoplasts isolation and development J Annu Rev PlantPhysiol 1972 23 29 50 24 王新明 王聯(lián)結(jié) 于猛 牛血清蛋白對纖維素酶水解小麥秸稈 的影響 J 食品工業(yè)科技 2012 33 19 194 196 200 WANG X M WANG L J YU M Effect of bovine serum albumin on cellulase in hydrolysis of wheat straw J Sci Technol FoodInd 2012 33 19 194 196 200 25 張濤 仇運(yùn)廣 羅啟超 等 鈣離子和鎂離子濃度變化對磷脂 酰乙醇胺 磷脂酰甘油雙分子層膜的影響 J 物理化學(xué)學(xué)報 2019 35 8 840 849 ZHANGT QIUYG LUOQC etal Concentrationdependent effects of Ca 2 and Mg 2 on the phosphatidylethanolamine phosphatidylglycerolbilayer J ActaPhys Chim Sin 2019 35 8 840 849 26 ROBERTS ZOUHARJ CARTERC etal Isolationofintact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf derived protoplasts J Nat Protocols 2007 2 2 259 62 27 宋愛華 張文斌 孫姝蘭 等 非洲菊原生質(zhì)體游離及瞬時轉(zhuǎn) 化系統(tǒng)的建立 J 植物學(xué)報 2017 52 4 511 519 SONG A H ZHANG W B SUN S L et al Preparation of protoplastandestablishmentoftransientexpressionsystemin Gerbera hybrid J Bull Bot 2017 52 4 511 519 28 段煉 錢君 郭小雨 等 一種快速高效的水稻原生質(zhì)體制備 和轉(zhuǎn)化方法的建立 J 植物生理學(xué)報 2014 50 3 351 357 DUAN L QIAN J GUO X Y et al A Rapid and efficient method for isolation and transformation of rice protoplast J PlantPhysiol Commun 2014 50 3 351 357 責(zé)任編輯 張冬玲 57