遮雨棚和薄膜覆蓋對沙田柚可溶性固形物含量的影響.pdf

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 抗蟲 基因的原核表達及玉米的遺傳 轉(zhuǎn)化 樊書羽 金時酉 王藝燃 曲 靜 劉思言 關(guān)淑艷 馬義勇 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 長春 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 長春 摘 要 玉米的產(chǎn)量深受蟲害的影響 抗蟲 基因?qū)τ衩尊はx抗性有重要意義 利用外源抗蟲基因 構(gòu)建到原核表達載體 中 對其進行 檢測和抗黏蟲性鑒定 檢測結(jié)果表 明 基因編碼的殺蟲蛋白在大腸桿菌 中得到正確的表達 條帶大小為 抗黏蟲性鑒定結(jié) 果表明 當(dāng) 蛋白濃度為 時 對東方黏蟲致死率達到 同時構(gòu)建 植物表達載體 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源抗蟲基因 轉(zhuǎn)入玉米自交系 愈傷組織中 利用除草劑篩選及 技術(shù)檢測得到 轉(zhuǎn)基因陽性植株 株 獲得的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米植株為抗蟲轉(zhuǎn)基因玉 米的研發(fā)及抗蟲玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制奠定了基礎(chǔ) 關(guān)鍵詞 玉米 基因 表達載體 功能分析 中圖分類號 文獻標(biāo)志碼 文章編號 引文格式 樊書羽 金時酉 王藝燃 等 抗蟲 基因的原核表達及玉米的遺傳轉(zhuǎn)化 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué) 報 基金項目 吉林省自然科學(xué)基金項目 吉林省科技引導(dǎo)計劃項目 吉林省科技支撐計劃項目 吉林省教育廳 十三五 科學(xué)技術(shù)項目 作者簡介 樊書羽 女 碩士研究生 研究方向 細胞生物學(xué) 收稿日期 通信作者 樊書羽 等 抗蟲 基因的原核表達及玉米的遺傳轉(zhuǎn)化 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 玉米 是一種廣泛種植的農(nóng)作物 是我國主要的糧食 經(jīng)濟和飼料作物 轉(zhuǎn)基 因或基因改造的抗蟲和耐除草劑的玉米 已在 部分國家商業(yè)化大規(guī)模種植 目前 玉米主要 用于飼養(yǎng)牲畜或用作工業(yè)產(chǎn)品的原料 而僅 的玉米用作人類食品 近年來 在中國 個省和 個地區(qū)都暴發(fā)了黏蟲蟲害 造 成的糧食作物損失 東北地區(qū)黏蟲 暴發(fā)的面積范圍較大 華北地區(qū)的成蟲數(shù)量多 危害較重 黃淮地區(qū)和湖南省呈局部大暴發(fā)狀態(tài) 西北和西南地區(qū)蟲害暴發(fā)較晚 成蟲數(shù)量較少 初步統(tǒng)計 全國蟲害暴發(fā)面積約為 萬公頃 主要為害玉米 水稻 高粱 小麥和谷子等禾本科 作物 因此本試驗將培育抗黏蟲轉(zhuǎn)基因玉米 作為首要目的 蘇云金芽孢桿菌 是 具有昆蟲病原性特征的革蘭氏陽性孢子形成的細 菌 在孢子形成階段產(chǎn)生殺蟲蛋白作為伴孢 晶體 這些晶體基本上由一種或多種蛋白質(zhì) 和 毒素 組合而成 也被稱為 內(nèi)毒 素 蛋白是來自蘇云金芽孢桿菌的伴隨包 涵體 晶體 蛋白 其對靶生物具有可驗證的毒性 或與已知的 蛋白序列具有極高的相似性 類似地 蛋白是來自蘇云金芽孢桿菌的伴孢 包含蛋白 其表現(xiàn)出溶血 活性或與已知 的 蛋白序列具有較高的相似性 這些毒素對 人類 脊椎動物和植物無害并對其目標(biāo)昆蟲具有 高度特異性 是完全可生物降解的 因此 蛋白是可代替農(nóng)藥 控制農(nóng)業(yè)中鱗翅目害蟲的可 行替代方案 通常 蛋白會被腸道蛋白酶攝入并加工 在昆蟲堿性腸道中轉(zhuǎn)化為活性毒素 活性毒 素與易感昆蟲腸道中存在的特定受體結(jié)合 結(jié)合 的毒素受體復(fù)合物導(dǎo)致腸膜孔形成 隨后引起敗 血病并最終導(dǎo)致死亡 人類和其他哺乳動物 為酸性腸道以及 蛋白結(jié)合受體 因此不易受 到相應(yīng) 蛋白的毒性作用 多年來 幾種 含 基因的 蛋白已被安全地用于商業(yè)和農(nóng) 業(yè)的殺蟲噴霧劑 在過去的 年中 來自表 達 蛋白的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的產(chǎn)品已安全地用于 食品和飼料 這些毒素對其目標(biāo)昆蟲具有高 度特異性 對人類 脊椎動物和植物無害 并且是 完全可生物降解的 截至 年 月 共有 近 種 類抗蟲基因被發(fā)掘鑒定出來 涵 蓋了從 至 共 小類 其中 蛋白占其中的大多數(shù) 類是僅次于 類的殺蟲晶體蛋白 對鱗翅目 直翅目等類昆 蟲具有較好的殺蟲活性 其中 蛋白僅對鱗翅目昆蟲具有殺蟲活 性 且 對黏蟲的毒力要高于 和 因此在害蟲防治方面具有較為廣泛 的應(yīng)用前景 本研究將 基因構(gòu)建到 原核表達載體與植物表達載體中 利用除草劑篩 選及 技術(shù)檢測得到 轉(zhuǎn)基因陽性植株 株 為抗蟲玉米新種質(zhì)的獲得奠定了基礎(chǔ) 材料與方法 材料 基因由吉林省庫美生物科技有限公 司合成 以克隆載體 形式保存在 大腸桿菌 中 以自交系 愈傷組 織為基因受體 黏蟲幼蟲購于河南省濟源白云實 業(yè)有限公司 方法 質(zhì)粒 的提取 利用質(zhì)粒 試劑 盒提取吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物中心實驗室保存的 克隆載體 質(zhì)粒 和原核表達載 體 具體試驗方法參見文獻 擴增 基因 根據(jù) 基 因的完整序列 設(shè)計 基因的特異性下游引 物 表 利用 技術(shù)擴增 基 因 其中 反應(yīng)體系為 分別添加 總 計 反應(yīng)條件 預(yù)變性 變 性 退火 延伸 次循環(huán) 延伸 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 年 月 表 引物序列 目的片段上游引物序列 下游引物序列 目的片段大小 注 分別表示該引物用于 基因 擴增 連接植物表達載體和原核表達載體 線性化載體及目的基因片段的制備 利 用同源重組的原理 將 基因連入原核表達 載體 上 綜合 基因序列上的酶切 位點和 載體序列上的可用酶切位點 選取 限制性內(nèi)切酶 對 載體進行 雙酶切 將載體大片段與 基因連接 其中 酶切體系為 各 載體 質(zhì)粒 總計 并在 條 件下酶切 重組體系為目的基因 線性 載體 重組蛋白的表達 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細胞 經(jīng) 誘導(dǎo)表達并進行 電泳檢測 蛋白殺蟲活性的生物鑒定 人工 飼料的配制參照文獻 方法和條件 含 載體的破碎菌液為陽性對照 含空載體的 破碎菌液為陰性對照 每 培養(yǎng)皿中加入 人工黏蟲飼料 并加入不同濃度的破碎菌液 攪拌均勻 將培養(yǎng)皿放在室溫環(huán)境中蒸發(fā) 水分直至沒有明顯水滴 將 頭初孵黏蟲幼蟲接入各皿中 每個濃度 設(shè) 次重復(fù) 接蟲后 為避免蟲子逃逸在其中墊 入紗布并封緊培養(yǎng)皿 將培養(yǎng)皿置于 光照 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 光周期為黑暗 光照 濕度為 每天添加新鮮飼料 培養(yǎng) 后 調(diào)查活蟲數(shù)和死蟲數(shù) 并計算死亡率 質(zhì)粒 的提取 利用小提質(zhì)粒 試劑盒提取 實驗室保存克隆載體 質(zhì)粒 和植物表達載體 具體試驗方法 參照文獻 擴增 基因 根據(jù) 基因 的完整序列 設(shè)計 基因的特異性引物 表 利用 技術(shù)擴增 基因 線性化載體及目的基因片段的制備 利 用同源重組的原理 將 基因連入載體 上 綜合 基因序列上的酶 切位點和 載體序列上的可用酶切 位點 選取限制性內(nèi)切 對 載體進行雙酶切 將載體大片段與 基因連接 酶切體系為 各 載體質(zhì)粒 總計 并在 條件下酶切 滅活 通過 擴增技術(shù)制備 基因片段 根據(jù)同源重組原理設(shè)計引物 以植物 表達載體 質(zhì)粒為模板 按照本文 中的 擴增體系和條件 擴增 基 因 待酶切和 擴增反應(yīng)結(jié)束后 將酶切產(chǎn)物 和 產(chǎn)物進行電泳驗證 回收并純化 基 因和載體大片段 具體方法參見文獻 目的片段與線性載體的連接 將線性載 體片段與 目的基因片段按照同源重組試 劑盒方法進行連接 在干式恒溫器中 反應(yīng) 然后放在冰上靜止 后進行工程菌制 備 構(gòu)建重組載體 重 組體系為 倍 線性載 體 與線性載體片段物質(zhì)的量的比為 重組表達載體的鑒定 對表達載體 進行 及酶切驗證 反應(yīng)體 系和反應(yīng)條件同本文 和 農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化 將 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 中 樊書羽 等 抗蟲 基因的原核表達及玉米的遺傳轉(zhuǎn)化 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 制成工程菌 對工程菌進行擴繁制備成侵染菌液并 對 幼胚誘導(dǎo)形成的愈傷組織塊進行侵 染 對侵染后的愈傷組織進行抗性篩選 分化成苗 具體的侵染及再生過程參見文獻 圖 區(qū)結(jié)構(gòu)圖 轉(zhuǎn)基因植株的 檢測 對轉(zhuǎn)化的玉 米植株進行除草劑篩選 提取出抗性苗的葉片 陰性對照為未轉(zhuǎn)化玉米植株葉片 陽 性對照為植物表達載體質(zhì)粒 分別對表達元件中的 基因 基因進行 擴增 反應(yīng)條件 預(yù)變性 變性 退火溫度分別 為 退火時間 延伸 后延伸 次循環(huán) 擴增產(chǎn)物利用 瓊脂糖凝膠電泳分離 參照康為世紀公司的植物 基因組提取試劑盒說明書提取目的基因 結(jié)果與分析 基因的 擴增及鑒定 對 基因進行 擴增 約在 處有條帶 圖 證明 基因的 擴增 成功 陰性對照 目的基因 圖 基因的 鑒定 原核表達載體的構(gòu)建 以 質(zhì)粒為模板擴增 目 的基因 構(gòu)建 原核表達載體 并 進行 擴增及雙酶切驗證 目的片段大小為 圖 成功構(gòu)建 原核 表達載體 目的基因 重組質(zhì)粒 圖 原核表達載體 鑒定及酶切鑒定 表達蛋白的 檢測 電泳分析 圖 經(jīng) 誘導(dǎo)后 含 工程菌 非可溶性組分 蛋白大小約在 表達出 條明顯的特異性條帶 與預(yù)期 條帶大小相吻合 表明 基因編碼的殺蟲蛋 白在大腸桿菌 中得到正確的表達 圖 誘導(dǎo)表達 檢測 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 年 月 原核表達蛋白對黏蟲的抗性分析 由表 可知 蛋白對黏蟲的致死率隨 濃度的增大而增加 濃度為 和 時 黏蟲的死亡率分別為 和 表 蛋白對黏蟲的致死率 接蟲數(shù)死蟲數(shù)死亡率 植物表達載體 的構(gòu)建 將構(gòu)建的植物表達載體 進行 擴增及雙 酶切驗證 目的片段大小為 圖 成功構(gòu) 建植物表達載體 農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米的遺傳轉(zhuǎn)化 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染玉米愈傷組織 經(jīng)過 共培養(yǎng) 篩選 分化 生根等再生過程共得到 株 再生幼苗 移栽幼苗并對 葉期幼苗進行除草劑 篩選獲得抗除草劑 代植株 株 圖 將獲得 的抗性植株移栽到土壤并在溫室中培養(yǎng) 進行分 子檢測 陰性對照 目的基因 重組質(zhì)粒 圖 植物表達載體 鑒定及酶切鑒定 預(yù)培養(yǎng) 共培養(yǎng) 篩選 分化培養(yǎng) 生根培養(yǎng) 移栽 圖 農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米的遺傳轉(zhuǎn)化 樊書羽 等 抗蟲 基因的原核表達及玉米的遺傳轉(zhuǎn)化 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 代轉(zhuǎn)基因玉米 檢測結(jié)果 對抗除草劑玉米植株的葉片提取基因組 以未轉(zhuǎn)化植株為陰性對照 質(zhì)粒為陽性對照 分別對 基 因 基因進行 檢測 能夠擴增出明顯的 基因及 基因條帶 得到 代陽性植株 株 圖 代陽性植株 株 圖 基因 基因 陽性對照 陰性對照 空白組 轉(zhuǎn)化植株 圖 代轉(zhuǎn)基因玉米陽性植株 檢測 基因 基因 陽性對照 陰性對照 空白組 轉(zhuǎn)化植株 圖 代轉(zhuǎn)基因玉米陽性植株 檢測 討 論 抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的應(yīng)用取決于抗蟲的效 果 大量研究證實 與其他抗蟲基因相比 在表 達量相等的情況下 轉(zhuǎn) 基因的作物抗蟲性最 強 類基因是轉(zhuǎn)基因玉米研發(fā)中的重要 基因 李冬雪等 證明了對小菜蛾 煙草天蛾等 較強的殺蟲活性是由其 毒蛋白的結(jié)構(gòu)決定 的 第 批成功用于商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因玉米 如 所用的抗蟲基因均為 類 基因 類基因的晶體蛋白在玉米中的表 達 能夠有效地控制苗期及穗期的蟲害 魏紀珍 研究了 與 互作對棉 鈴蟲的影響 結(jié)果顯示 種蛋白同時運用于棉鈴 蟲時其腸道中的酶活力顯著高于 種蛋白單獨作 用和對照組 幼蟲校正死亡率依次為雙價棉 轉(zhuǎn) 棉 轉(zhuǎn) 棉 李靜靜 利用含 與 雙基因的轉(zhuǎn)基因水稻飼喂棉鈴 蟲與稻縱卷葉螟 周后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲性 明顯高于未轉(zhuǎn)基因植株 且長勢良好 本研究將 基因與原核表達載體 相連接 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 使其表達 檢測表明 基因編碼的殺蟲蛋 白在大腸桿菌 中得到正確的表達 條帶大 小為 抗蟲性鑒定試驗結(jié)果表明 蛋白對黏蟲有良好的抗性 具有潛在的應(yīng) 用價值 隨后將 基因?qū)胗衩鬃越幌?通過 檢測 除草劑篩選初步獲得 株 代陽性玉米植株 為后續(xù)植株的分子檢測 及抗蟲鑒定奠定了基礎(chǔ) 楊素娟等 的研究指 出 基因當(dāng)濃度為 時 對東方黏 蟲致死率達到 本試驗與其結(jié)論相似 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 年 月 參考文獻 王月琴 玉米對亞洲玉米螟抗性研究 應(yīng)用昆蟲 學(xué)報 楊素娟 對東方粘蟲 亞洲玉米螟具有抗蟲作用的 蛋白 篩選與分析 哈爾濱 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 魏曉禹 邵詩迪 孫蘇等 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米幼胚遺傳轉(zhuǎn)化 體系的建立 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 梁海生 轉(zhuǎn) 基因抗蟲玉米的農(nóng)藝性狀分析 綿陽 西南科技大學(xué) 季麗麗 玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及 基因轉(zhuǎn)化玉米的 研究 長春 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 王國莉 丘裕雄 范紅英 轉(zhuǎn)基因玉米實驗室 檢測體系的 優(yōu)化及應(yīng)用 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué) 趙邯鄲 轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的獲得及后代鑒定分析 長 春 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 錢雪艷 蘇穎 姚瑤等 農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗蟲基因 轉(zhuǎn) 化大豆的研究 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 王江 武奉慈 劉新穎 等 轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑復(fù)合性狀 玉米 雙抗 對亞洲玉米螟的抗性及對草甘膦的耐 受性研究 植物保護學(xué) 李國平 劉冰 黃建榮 等 轉(zhuǎn)聚合 和 基因抗蟲耐除草劑玉米的田間抗性評價 植 物保護 任夢云 陳彥君 關(guān)瀟 轉(zhuǎn) 基因抗蟲玉米對無脊椎 動物多樣性影響研究 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報 陳亮 黃慶華 孟麗輝 等 轉(zhuǎn)基因作物飼用安全性評價研 究進展 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 宋新元 張欣芳 于壯 等 轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全評價策略 生物安全學(xué)報 孫越 劉秀霞 李麗莉 等 抗亞洲玉米螟 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因 玉米的培育 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報 宋福平 蘇云金芽孢桿菌 和 基因的研究 長春 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 宋苗 轉(zhuǎn) 基因抗蟲玉米的遺傳穩(wěn)定性分析及農(nóng) 藝性狀觀察 綿陽 西南科技大學(xué) 王文治 胡天嬌 楊本鵬 等 轉(zhuǎn) 基因抗蟲甘蔗植株 的培育 分子植物育種 吳楠 大豆查爾酮還原酶基因 干擾表達載體的 構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 長春 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 李暉 玉米 基因的克隆及功能分析 長 春 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 劉雙 陳昭汀 董昭旭 等 擬南芥抗寒基因 的克隆及 功能分析 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報 李冬雪 田崇兵 劉長華 等 轉(zhuǎn) 基因抗蟲超級粳稻 田間目的基因表達及抗螟蟲性研究 中國農(nóng)學(xué)通報 汪小福 陳笑蕓 張小明 等 轉(zhuǎn) 基因水稻分子特征 及其特異性 檢測方法 遺傳 張林 新抗蟲基因 的克隆及其在大豆中的遺 傳轉(zhuǎn)化和功能鑒定 長春 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 魏紀珍 和 防治棉鈴蟲的交互抗性和互作 北京 中國植物保護學(xué)會 植?？萍紕?chuàng)新與農(nóng)業(yè)精準(zhǔn) 扶貧 中國植物保護學(xué)會 年學(xué)術(shù)年會論文集 中 國植物保護學(xué)會 中國植物保護學(xué)會 李靜靜 含 和 雙基因的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的 研究 杭州 浙江大學(xué) 責(zé)任編輯 林海濤