‘甜蜜藍(lán)寶石’葡萄組培技術(shù)研究.pdf

中 國果菜 China Fruit tissue culture rapid propagation technology 處理 消毒試劑 消毒時(shí)間 min T1 1 NaClO 15 T2 1 NaClO 20 T3 3 NaClO 15 T4 3 NaClO 20 T5 0 1 HgCl 2 12 T6 0 1 HgCl 2 15 栽培生理 周閏 等 甜蜜藍(lán)寶石 葡萄組培技術(shù)研究 63 濾 紙吸去表面多余水分 然后切去兩端褐化的傷口 將 消毒過的材料切成長 1 0 cm 左右?guī)б粋€(gè)腋芽的莖段 正 插于啟動(dòng)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng) 啟動(dòng)培養(yǎng)基為 1 2 MS 不 添加任何激素 每瓶接種 1 個(gè)莖段 每個(gè)處理接種 20 個(gè) 莖段 設(shè) 3 次重復(fù) 設(shè)置培養(yǎng)室條件如下 保持溫度 26 左右 相對(duì)濕度為 40 60 每日光照 12 h 15 d 后 統(tǒng) 計(jì)接種材料的污染率 褐變率和成活率 計(jì)算方法分別 見公式 1 2 3 用以確定最佳的消毒方法 污染率 污染莖段數(shù) 接種莖段 數(shù) 100 1 褐變率 褐變莖段數(shù) 接種莖段 數(shù) 100 2 成活率 成活莖段數(shù) 接種莖段 數(shù) 100 3 1 2 4 快繁體系的建立 1 初代培養(yǎng) 采用篩選出的最佳消毒方法進(jìn)行消毒 把消毒后的 莖段接種于初代培養(yǎng)基上 設(shè)置四個(gè)配方 分別記作 PC1 PC2 PC3 PC4 培養(yǎng)基成分見表 2 每瓶接種 1 個(gè) 莖段 每個(gè)處理接種 30 個(gè)莖段 3 次重復(fù) 培養(yǎng)條件為保 持溫度 26 左右 相對(duì)濕度為 40 60 每日光照 12h 30 d 后 記錄生長情況并統(tǒng)計(jì)萌芽率 萌芽率按照公式 4 計(jì)算得出 萌芽率 A T 100 4 式中 A為萌芽的莖段總數(shù) T為接種的莖段總數(shù) 表 2 不同初代培養(yǎng)基配方 Table 2 Different formulations of primary mediums 2 增殖培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)腋芽生長最好的培養(yǎng)基作為篩選出的 初代培養(yǎng)基配方 接種 50 d 后 當(dāng)該培養(yǎng)基上腋芽生長 至株高 4 5 cm 時(shí) 將其剪下 去掉葉片 從中剪取健康 飽滿的處在中間節(jié)位的單芽莖段 長度約 0 5 1 cm 做 到莖段基本一致 然后接種于增殖培養(yǎng)基上 每瓶接種 3 個(gè)莖段 培養(yǎng)基設(shè)置 5 個(gè)配方 分別記作 PZ1 PZ2 PZ3 PZ4 PZ5 培養(yǎng)基成分見表 3 每個(gè)處理接種 15 個(gè)莖段 設(shè) 3 次重復(fù) 培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng) 45 d 后統(tǒng)計(jì)萌芽率 平均株高 增殖系數(shù)和生長情況 其中增殖系數(shù)按照公 式 5 計(jì)算 增殖系數(shù) B W 100 5 式中 B為可用于下次繼代的莖段總數(shù) W為接種的 莖段總數(shù) 表 3 不同增殖培養(yǎng)基配方 Table 3 Different formulations of breeding mediums 3 生根培養(yǎng) 增殖培養(yǎng) 45 d 后 將腋芽生長最好的培養(yǎng)基作為篩 選出的增殖培養(yǎng)基配方 將其中生長的腋芽剪下去掉 葉片 從中剪取健康飽滿的中間節(jié)位的單芽莖段 長度 0 5 1 cm 做到莖段基本一致 接種于生根培養(yǎng)基 培養(yǎng) 基設(shè)置 5 個(gè)配方 分別記作 PT1 PT2 PT3 PT4 PT5 培 養(yǎng)基成分見表 4 每瓶接種 5 個(gè)莖段 每個(gè)處理接種 20 個(gè)莖段 設(shè) 3 次重復(fù) 培養(yǎng)條件與增殖培養(yǎng)條件一致 50d 后觀察生長情況 統(tǒng)計(jì)萌芽率 生根率 主根密度及平均 根長 其中生根率按照公式 6 計(jì)算得出 生根率 C W 100 6 式中 C為生根的莖段總數(shù) W為接種的莖段總數(shù) 表 4 不同生根培養(yǎng)基配方 Table 4 Different formulations of rooting mediums 4 煉苗和移栽 生根培養(yǎng) 50 d 以上 當(dāng)生根良好的組培苗株高達(dá)到 處理 配方 PC1 1 2 MS PC2 1 2 MS 6 BA0 5 mg L IBA0 1 mg L PC3 1 2 MS 6 BA1 0 mg L IBA0 1 mg L PC4 MS 處理 配方 PZ1 1 2 MS 6 BA0 1 mg L IBA0 05 mg L PZ2 1 2 MS 6 BA0 3 mg L IBA0 05 mg L PZ3 1 2 MS 6 BA0 5 mg L IBA0 05 mg L PZ4 1 2 MS 6 BA0 3 mg L NAA0 05 mg L PZ5 1 2 MS 處理 配方 PT1 1 4 MS IBA0 1 mg L PT2 1 4 MS IBA0 5 mg L PT3 1 4 MS IBA1 0 mg L PT4 1 4 MS NAA0 5 mg L PT5 1 2 MS 栽培生理中國果菜64 5 7 cm 帶 5 7 個(gè)葉片時(shí) 將試管苗置于煉苗室 先擰 松瓶蓋煉苗 2 3 d 再完全打開瓶口煉苗 7 10 d 待莖 稈顏色加深 葉片發(fā)亮?xí)r即可出瓶移栽 將植株小心取 出 用自來水洗凈組培苗根部的培養(yǎng)基 準(zhǔn)備配制好的 基質(zhì) 含椰糠 草炭土 珍珠巖和蛭石四種成分 比例為 2 1 1 1 用多菌靈溶液攪拌至基質(zhì)土坨不散 分裝 至營養(yǎng)缽 直徑約 6 5 cm 然后移栽組培苗 將苗子置于 育苗箱中 蓋上蓋子保濕 然后保持溫度在 25 左右 注 意通風(fēng) 防止基質(zhì)發(fā)霉 當(dāng)出現(xiàn)新生葉 1 2 片時(shí) 打開蓋 子通風(fēng) 2 d 將苗再次轉(zhuǎn)入營養(yǎng)袋 觀察成活情況 1 3 統(tǒng)計(jì)分析方法 采用 Excel 2007 軟件和 SPSS 22 0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處 理及分析 2 結(jié)果與分析 2 1 外植體最佳消毒方法 用次氯酸鈉消毒后 外植體易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象且影 響腋芽的萌發(fā) 而用升汞消毒則顏色較正常 由表 5 可 知 0 1 升汞消毒的表現(xiàn)優(yōu)于 1 3 次氯酸鈉 莖段外 植體的最佳消毒處理是 T6 即 0 1 升汞消毒 15 min 外 植體污染率 褐變率和成活率分別是 46 7 13 3 和 40 0 因此 外植體的消毒方法采用先用 75 酒精消毒 40 s 再用 0 1 升汞消毒 15 min 表 5 外植體最佳消毒方法的篩選 Table 5 Selection of the best method for disinfection of explants 注 同列不同小寫字母表示處理間差異達(dá)顯著水平 P 0 05 下表同 2 2 不同初代培養(yǎng)基對(duì)莖段誘導(dǎo)的影響 莖段外植體接種到不同初代培養(yǎng)基上 30 d 后統(tǒng)計(jì) 莖段外植體萌芽率 見表 6 結(jié)果表明 外植體在四種培 養(yǎng)基配方上都有萌芽 但是在不添加任何激素的 1 2 MS 上的表現(xiàn)最好 萌芽率達(dá)到 57 8 新芽生長正常 以 1 2 MS 為基本培養(yǎng)基的另兩個(gè)配方 其中添加了 6 BA 和 IBA兩種激素 莖段基部產(chǎn)生較多愈傷組織 且新芽生長 不正常 后期出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象 在不添加任何激素的 MS 培養(yǎng)基上 莖段基部膨大明顯 影響腋芽的生長 導(dǎo)致出 芽慢且有玻璃化現(xiàn)象 所以確定最佳初代培養(yǎng)基配方為 1 2 MS 30 g L蔗糖 6 5 g L瓊脂 表 6 不同初代培養(yǎng)基莖段誘導(dǎo)情況 Table 6 Stem segment induction in different primary mediums 2 3 不同增殖培養(yǎng)基對(duì)莖段培養(yǎng)的影響 增殖培養(yǎng)過程中 5 種培養(yǎng)基上的莖段生長表現(xiàn)各 不相同 第 45 天統(tǒng)計(jì)情況 結(jié)果見表 7 以不添加任何激 素的 1 2 MS增殖效果最好 增殖系數(shù)高達(dá) 5 2 顯著高于 其他處理 基本不產(chǎn)生愈傷 生長正常 還能同時(shí)生根 在 PZ1 PZ2 和 PZ3 三種培養(yǎng)基上 莖段基部愈傷率都達(dá)到 100 隨著 6 BA濃度的提高 萌芽率逐漸升高 但是愈 傷組織越來越大 新芽葉片短小 節(jié)間短縮 且部分出現(xiàn) 叢生芽及玻璃化的現(xiàn)象 PZ4 中生長激素用 NAA 替換 IBA 但是其產(chǎn)生的愈傷組織更大葉片小且偏黃 新芽 生長不正常 說明該配方不合適 表 7 不同增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果 Table 7 Culture effect of different propagation medium 2 4 不同生根培養(yǎng)基對(duì)葡萄生根的影響 生根培養(yǎng) 50 d 后 隨機(jī)選取 10 株苗進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 結(jié)果 見表 8 見下頁 甜蜜藍(lán)寶石 葡萄品種容易生根 不添 加任何激素的 1 2 MS培養(yǎng)基生根率也很高 但是新梢莖 稈纖細(xì) 不利于移栽 添加不同濃度的生長素后均有生 根 其中 1 4 MS培養(yǎng)基中添加 IBA濃度為 0 1 mg L時(shí) 處理 污染率 褐變率 成活率 T1 75 0 18 0 a 6 7 2 9 b 18 3 10 4 b T2 66 7 7 6 ab 11 7 2 9 b 21 7 7 6 b T3 65 0 5 0 ab 10 0 5 0 b 25 0 10 0 ab T4 60 0 13 2 ab 21 7 5 8 a 18 3 7 6 b T5 55 0 13 2 ab 8 3 2 9 b 36 7 10 4 ab T6 46 7 2 9 b 13 3 2 9 b 40 0 10 0 a 處理 萌芽率 生長情況 PC1 57 8 8 4 a 基部產(chǎn)生少量愈傷 新芽生長正常 PC2 50 0 5 8 ab 基部產(chǎn)生較多愈傷 新芽出現(xiàn)少量玻璃化現(xiàn)象 PC3 41 1 10 7 b 基部產(chǎn)生大量愈傷 新芽出現(xiàn)較多玻璃化現(xiàn)象 PC4 45 6 5 1 ab 基部膨大明顯 新芽出芽慢且有少量玻璃化現(xiàn)象 栽培生理 周閏 等 甜蜜藍(lán)寶石 葡萄組培技術(shù)研究 培養(yǎng)基編號(hào) 萌芽率 平均株高 cm 增殖系數(shù) PZ1 57 8 7 7 c 3 2 0 4 b 1 8 0 2 c PZ2 86 7 23 1 ab 2 5 0 2 c 2 0 0 2 c PZ3 95 6 3 9 a 2 2 0 3 c 1 5 0 5 c PZ4 71 1 10 2 bc 3 5 0 6 b 2 6 0 4 b PZ5 88 9 3 8 ab 6 0 0 3 a 5 2 0 1 a 65 即 培養(yǎng)基 PT1 效果最好 萌芽率達(dá)到 91 7 生根率達(dá)到 88 3 生長正常 隨著 IBA 濃度逐漸提高 雖然新梢莖 稈更加粗壯 但基部產(chǎn)生的愈傷更多 導(dǎo)致萌芽率及生 根率逐漸降低 新梢生長過慢 而添加 0 5 mg L的 NAA 則出現(xiàn)部分只長根不萌芽的現(xiàn)象 萌芽率只有 30 生 根率只有 55 且根為氣生根 愈傷組織大而疏松 2 5 煉苗移栽情況 試管苗馴化時(shí) 保持溫度 20 28 濕度在 80 左 右 讓試管苗逐漸適應(yīng)外界的環(huán)境 不能操之過急 本試 驗(yàn)采用配制好的基質(zhì)土用于幼苗的馴化 再次移栽至營 養(yǎng)袋時(shí) 已經(jīng)產(chǎn)生較多新根 在營養(yǎng)袋生長兩周后 統(tǒng)計(jì) 成活率高達(dá) 90 3 討論 外植體消毒作為組織培養(yǎng)的第一步 具有關(guān)鍵作 用 外植體的生長發(fā)育情況及對(duì)其消毒時(shí)間的長短 對(duì) 發(fā)芽率尤為重要 因此尋求最佳的消毒藥劑及其濃度和 時(shí)間的組合 控制外植體污染和褐變率 是消毒環(huán)節(jié)的 重要問題 10 11 本試驗(yàn)篩選出了較優(yōu)的消毒方法 但外植 體污染率太高 萌芽率過低 可能因?yàn)槿〔挠谝巴獾沫h(huán) 境 且取材季節(jié)過晚 雨季天氣來臨 病菌種類多變且繁 殖活躍 12 導(dǎo)致難以消毒 雖然通過延長消毒時(shí)間可以降 低部分污染率 但同時(shí)也增加了死亡率 最終萌芽率也 不高 所以進(jìn)一步探索合適的取材時(shí)間很有必要 植物激素具有刺激形成層細(xì)胞的分裂 誘導(dǎo)愈傷組 織 不定芽和不定根的形成等生理作用 缺乏或者過多 都會(huì)對(duì)植物生長產(chǎn)生不利影響 7 植物組織培養(yǎng)增殖過 程中 可以通過腋芽產(chǎn)生不定芽 叢生芽 和腋芽萌發(fā)成 新梢兩種方式擴(kuò)繁 生長素類物質(zhì)在兩種方式中均是必 需的 而細(xì)胞分裂素類物質(zhì)在促發(fā)叢生芽的方式中是必 需的 但在腋芽萌發(fā)成新梢的過程中不是必需的 13 15 但 本試驗(yàn)增殖培養(yǎng)過程 在添加了激素的培養(yǎng)基中 因?yàn)榛?部產(chǎn)生較多愈傷 抑制了發(fā)根和抽莖 芽的生長受到抑 制 生長緩慢 或者部分產(chǎn)生了叢生芽 但是難以繼續(xù)生 長 并出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象 所以選擇不添加任何激素的 1 2 MS基本培養(yǎng)基作為增殖培養(yǎng)基 以腋芽萌發(fā)成新梢的 方式進(jìn)行擴(kuò)繁 不產(chǎn)生叢生芽 繼代增殖系數(shù)相對(duì)較低 但組培苗生長健壯 多次繼代培養(yǎng)后無玻璃化 褐化現(xiàn) 象 16 17 生根培養(yǎng)過程中 隨著添加 IBA 濃度的逐步升 高 基部產(chǎn)生的愈傷也不斷增多 導(dǎo)致萌芽率及生根率 逐漸降低 新梢生長減緩 但是在不添加生長激素的培養(yǎng) 基中 新梢莖稈纖細(xì) 不利于移栽 所以選擇添加 0 1 mg L 的 IBA進(jìn)行生根培養(yǎng)最合適 這說明一定濃度的外源生 長素如 IBA IAA可促進(jìn)葡萄根的發(fā)育和試管苗生長 但 濃度過高誘導(dǎo)產(chǎn)生大量愈傷組織 則會(huì)抑制試管苗的生 長 18 21 與大部分研究一致 營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)組培苗的生長狀況影響很大 20 雖然本 試驗(yàn)中莖段可以一次成苗 一次成苗即將繼代培養(yǎng)和生 根培養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行 既能加快試管苗的培育速度 又能減少 勞動(dòng)力的消耗 具有很大優(yōu)勢 但因?yàn)椴捎迷鲋撑囵B(yǎng)基配 方同步生根的苗子莖稈過于纖細(xì) 不利于煉苗移栽 而采 用生根培養(yǎng)基配方一次成苗 則增殖太慢 因?yàn)樯囵B(yǎng) 后的瓶苗莖稈過于老化 難以再增殖 而用兩次成苗法 即用增殖培養(yǎng)基先增殖 然后再轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn) 行生根培養(yǎng) 則起到了壯苗的作用 能有效提高移栽的成 活率 且培養(yǎng)基大量元素的用量減半 在生產(chǎn)上更有成本 優(yōu)勢 所以本試驗(yàn)增殖和生根分兩步完成 這與大部分 研究一次成苗的結(jié)論不一致 21 分析原因可能是培養(yǎng)基 的配方需要調(diào)整 也可以嘗試縮短生根培養(yǎng)的時(shí)間 及時(shí) 轉(zhuǎn)接繼代 用以提高增殖率 今后仍需進(jìn)一步探索 培養(yǎng)基編號(hào) 萌芽率 生根率 主根密度 條 株 平均根長 cm 生長情況 PT1 91 7 7 6 a 88 3 2 9 ab 3 6 0 3 cd 3 0 0 3 b 植株莖稈較粗壯 基部產(chǎn)生的愈傷組織很少 PT2 83 3 12 6 ab 83 3 10 4 ab 4 2 0 2 bc 2 8 0 2 b 植株莖稈較粗壯 基部產(chǎn)生較多愈傷組織 植株生長較慢 PT3 71 7 10 4 b 73 3 7 6 b 5 5 0 6 a 2 5 0 4 b 植株莖稈粗壯 基部產(chǎn)生較多愈傷組織 植株生長過慢 PT4 30 0 10 0 c 55 0 8 7 c 4 5 0 4 b 1 0 0 4 c 植株玻璃化現(xiàn)象較重 基部愈傷組織大而疏松 PT5 88 3 2 9 ab 90 0 10 0 a 3 3 0 4 d 5 0 0 9 a 新梢莖稈纖細(xì) 表 8 不同生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果 Table 8 Culture effect of different rooting medium 栽培生理 中國果菜 66 4 結(jié)論 甜蜜藍(lán)寶石 葡萄的組織培養(yǎng)包括莖段外植體消 毒 啟動(dòng)培養(yǎng) 增殖培養(yǎng) 生根培養(yǎng)以及煉苗移栽環(huán)節(jié) 本研究發(fā)現(xiàn) 甜蜜藍(lán)寶石 外植體的最佳消毒方法是先 采用 75 酒精消毒 40 s 再用 0 1 升汞消毒 15 min 最 佳初代培養(yǎng)基為 1 2 MS 30 g L蔗糖 6 5 g L瓊脂 萌芽 率達(dá)到 57 8 1 2 MS增殖培養(yǎng)效果最好 增殖培養(yǎng) 45 d 增殖系數(shù)高達(dá) 5 2 生根培養(yǎng)基以 1 4 MS IBA0 1 mg L 效果最好 生根培養(yǎng) 50 d 生根率達(dá)到 88 3 新芽莖稈 較為粗壯 生長正常 煉苗時(shí) 保持溫度 20 28 濕度 在 80 左右 成活率高達(dá) 90 該組培繁殖體系可用于 甜蜜藍(lán)寶石 葡萄新品種的繁育 有一定的潛在應(yīng)用前 景 為其商業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參考 參考文獻(xiàn) 1 劉鳳之 中國葡萄栽培現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢 J 落葉果樹 2017 49 1 1 4 2 吳昊 甜蜜藍(lán)寶石葡萄的高產(chǎn)栽培技術(shù) J 河北農(nóng)業(yè) 2019 10 44 47 3 沈傳進(jìn) 王利民 張平 等 鮮食葡萄組織培養(yǎng)快速繁育系 統(tǒng)的建立 J 河北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011 15 7 16 21 4 沈傳進(jìn) 對(duì)烏海市葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的再認(rèn)識(shí) J 華北農(nóng)學(xué)報(bào) 2006 S3 133 136 5 蔡文博 段虹 王軍 等 4 個(gè)鮮食葡萄品種組培快繁體系的 建立 J 核農(nóng)學(xué)報(bào) 2019 33 2 248 254 6 曹孜義 劉國民 實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程 M 蘭州 甘 肅科學(xué)技術(shù)出版社 1998 17 20 7 李國樹 邱璐 徐成東 等 葡萄組織培養(yǎng)快速繁殖體系研 究 J 北方園藝 2011 9 134 136 8 曾建國 吳雪梅 巨峰葡萄組培快繁過程中初代培養(yǎng)基的 篩選 J 現(xiàn)代園藝 2010 7 4 7 9 劉娜 許軻 張文 等 四個(gè)釀酒葡萄品種組培快繁體系的 初建 J 植物生理學(xué)報(bào) 2013 49 10 1071 1076 10 莫銀屏 徐豐 石雪暉 等 湘釀 1 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