基于RPA-CRISPR_Cas12a的番茄花葉病毒可視化檢測(cè)方法的建立.pdf

2024 50 4 235 241PlantProtection 收稿日期 2 0 2 3 0 7 2 5 修訂日期 2 0 2 3 1 1 1 3 基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 2 0 2 1 Y F D 1 4 0 0 1 0 0 2 0 2 1 Y F D 1 4 0 0 1 0 3 通信作者E m a i l 周濤t a o z h o u s i g 1 6 3 c o m 張永江z h a n g y j p v i y e a h n e t 為并列第一作者 基于RPA CRISPR Cas12a的番茄花葉病毒可視化 檢測(cè)方法的建立 董 錚1 趙振興1 范奇璇1 2 王思元1 周 濤2 張永江1 1 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 北京 1 0 0 1 7 6 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 北京 1 0 0 1 9 3 摘要 番茄花葉病毒 t o m a t o m o s a i c v i r u s T o M V 屬于植物桿狀病毒科Virgaviridae煙草花葉病毒屬Tobamo virus成員 主要危害番茄和辣椒 多數(shù)茄科植物易感染 嚴(yán)重影響果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量 本研究根據(jù)T o M V編碼的 外殼蛋白的基因保守序列 設(shè)計(jì)重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù) r e c o m b i n a s e p o l y m e r a s e a m p l i f i c a t i o n R P A 特異性引物和 簇狀規(guī)則間隔短鏈重復(fù)序列 c l u s t e r e d r e g u l a r l y i n t e r s p a c e d s h o r t p a l i n d r o m i c r e p e a t s C R I S P R 及相關(guān)蛋白1 2 a C R I S P R a s s o c i a t e d 1 2 a C a s 1 2 a 的c r R N A并挑選報(bào)告基因 通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系建立了T o M V的快速可視化檢測(cè)方 法 當(dāng)熒光報(bào)告基因F Q終濃度為4 0 0 n m o l L C a s 1 2 a c r R N A比例為1 5 終濃度為2 0 0 n m o l L 1 1 0 0 0 n m o l L 1 時(shí)檢測(cè)信號(hào)最強(qiáng) 只需R P A和C R I S P R C a s 1 2 a分別反應(yīng)1 5 m i n 即可在便攜式藍(lán)光照射設(shè)備下直接觀察到陽(yáng)性信 號(hào) 該方法可特異性檢測(cè)T o M V 對(duì)攜帶T o M V樣品的R N A檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1 7 2 a g L 是普通R T P C R檢 測(cè)靈敏度的1 0 0 0 0倍 可用于T o M V快速靈敏的可視化檢測(cè) 關(guān)鍵詞 番茄花葉病毒 R P A C R I S P R C a s 1 2 a 可視化檢測(cè) 中圖分類號(hào) S 4 3 6 4 1 2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A DOI 1 0 1 6 6 8 8 j z w b h 2 0 2 3 3 8 1 EstablishmentofRPA CRISPR Cas12a basedvisualdetectionof tomatomosaicvirus DONGZheng1 ZHAOZhenxing1 FANQixuan1 2 WANGSiyuan1 ZHOUTao2 ZHANGYongjiang1 1 ChineseAcademyofInspectionandQuarantine Beijing 1 0 0 1 7 6 China 2 CollegeofPlantProtection ChinaAgriculturalUniversity Beijing 1 0 0 1 9 3 China Abstract Tomatomosaicvirus ToMV isamemberofthegenusTobamovirusinthefamilyVirgaviridae ToMV mainlyinfectstomato pepper andmostSolanaceaeplants resultinginseverelossesinfruitqualityandyield In thisstudy thespecificprimersofrecombinasepolymeraseamplification RPA andthecrRNAofclustered regularlyinterspacedshortpalindromicrepeats CRISPR associated1 2a CRISPR Cas1 2a weredesignedbasedon theconservedsequenceofthecoatproteinsequenceofToMV andthereportergenewasselected Byoptimizing thereactionsystem arapidvisualdetectionmethodforToMVdetectionwasestablished andthedetectionsignal wasstrongestwhenthefinalconcentrationoffluorescentreporterFQwas4 0 0nmol L theCas1 2a crRNAratio was1 5 andthefinalconcentrationwas2 0 0nmol L 1 1 0 0 0nmol L 1 Withonly1 5minofRPAand CRISPR Cas1 2areaction respectively positivesignalscanbedirectlyobservedunderaportablebluelight irradiationequipment ThismethodcanbeusedforspecificdetectionofToMV andtheminimaldetectionlimit indetectingthetotalRNAofToMVcontainingsamplesis1 7 2ag L 1 0 0 0 0timesthatofRT PCR basedToMV detection Hence theestablishedRPA CRISPR Cas1 2a baseddetectionisarapid sensitiveandvisualmethodfor ToMVdetection Keywords tomatomosaicvirus RPA CRISPR Cas1 2a visualizationdetection 2 0 2 4 番茄花葉病毒 t o m a t o m o s a i c v i r u s T o M V 屬于植物桿狀病毒科Virgaviridae煙草花葉病毒 屬Tobamovirus 1 基因組分別編碼外殼蛋白 c o a t p r o t e i n C P 運(yùn)動(dòng)蛋白 m o v e m e n t p r o t e i n M P 與復(fù)制相關(guān)的1 2 6 k D蛋白和1 8 3 k D蛋 白 2 T o M V在全世界均有分布 主要危害番茄 Solanumlycopersicum和辣椒Capsicumannuum 易侵染多數(shù)茄科植物 3 嚴(yán)重影響果實(shí)的品質(zhì)和 產(chǎn)量 T o M V可以通過(guò)嫁接 植株間互相接觸 機(jī) 械接種傳播 也可以通過(guò)種子傳毒 3 被T o M V 侵染的葉片出現(xiàn)花葉癥狀 有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致葉片變 形 植株矮縮 甚至死亡 果實(shí)會(huì)出現(xiàn)著色不均或 凹陷的褐色病斑 4 目前檢測(cè)T o M V的方法主要有雙抗體夾心酶聯(lián) 免疫吸附測(cè)定 d o u b l e a n t i b o d y s a n d w i c h a s s a y D A S E L I S A 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 d o t E L I S A 膠體 金免疫層析測(cè)定 R T P C R 實(shí)時(shí)定量R T P C R等 3 但是這些方法在實(shí)現(xiàn)快速和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)T o M V方面存 在一些局限性 目前使用的大多數(shù)檢測(cè)方法很耗時(shí) 而且需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)知識(shí) 限制了在實(shí)驗(yàn) 室之外的診斷應(yīng)用 因此 有必要建立一種快速 靈 敏 可視化的T o M V現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法 5 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù) r e c o m b i n a s e p o l y m e r a s e a m p l i f i c a t i o n R P A 是一種在恒定溫度 3 7 4 2 啟動(dòng)D N A指數(shù)級(jí)擴(kuò)增的檢測(cè)技術(shù) 由于該 技術(shù)反應(yīng)速度快 靈敏 不需要昂貴的儀器 已被廣 泛應(yīng)用于多種植物病原物的檢測(cè) 6 C R I S P R C a s系 統(tǒng)由簇狀規(guī)則間隔短鏈重復(fù)序列 c l u s t e r e d r e g u l a r l y i n t e r s p a c e d s h o r t p a l i n d r o m i c r e p e a t s C R I S P R 及 相關(guān)蛋白1 2 a C R I S P R a s s o c i a t e d 1 2 a C a s 1 2 a 組 成 存在于許多細(xì)菌和古細(xì)菌的先天免疫系統(tǒng)中 7 在該系統(tǒng)中 C a s蛋白與入侵病毒D N A序列互補(bǔ)的 C R I S P R R N A c r R N A 形成一個(gè)核糖核蛋白 r i b o n u c l e o p r o t e i n R N P 復(fù)合物 來(lái)靶向特定的病毒序 列 8 雖然該系統(tǒng)主要用于基因編輯 9 1 2 但最近 有研究表明 一些C a s蛋白可用于檢測(cè)特定的核酸 序列 1 3 1 5 例如 C a s 1 2 a在與其D N A底物特異性 相互作用后獲得了非特異性的單鏈D N a s e活性 1 2 前人利用這一特性應(yīng)用C a s 1 2 a作為生物傳感器 除 了C a s 1 2 a及其c r R N A的R N P復(fù)合物外 還添加了 一個(gè)熒光報(bào)告基因 F Q 標(biāo)記的單鏈D N A底物 在 C a s 1 2 a激活后 它非特異性地降解單鏈D N A 釋放 熒光基團(tuán) 產(chǎn)生熒光信號(hào) 該方法已被用于檢測(cè)人 乳頭瘤病毒 h u m a n p a p i l l o m a v i r u s H P V 和新型 冠狀病毒 c o r o n a v i r u s d i s e a s e 2 0 1 9 C O V I D 1 9 1 3 1 6 表明該方法在病毒診斷方面具有巨大潛 力 近年來(lái) C R I S P R C a s 1 2 a被應(yīng)用于植物R N A 病毒 1 7 1 8 和D N A病毒 1 9 的檢測(cè) 證明其在植物病 毒病的檢測(cè)中具有很大的應(yīng)用潛力 1 材料與方法 1 1 材料 本研究中所用的帶病毒材料包括 T o M V 南芥 菜花葉病毒 a r a b i s m o s a i c v i r u s A r M V 黃瓜花葉 病毒 c u c u m b e r m o s a i c v i r u s C M V 辣椒輕斑駁病 毒 p e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s P M M o V 番茄褐色 皺紋果病毒 t o m a t o b r o w n r u g o s e f r u i t v i r u s T o B R F V 番茄斑駁花葉病毒 t o m a t o m o t t l e m o s a i c v i r u s T o M M V 番茄環(huán)斑病毒 t o m a t o r i n g s p o t v i r u s T o R S V 煙草環(huán)斑病毒 t o b a c c o r i n g s p o t v i r u s T R S V 煙草花葉病毒 t o b a c c o m o s a i c v i r u s T M V 番茄斑萎病毒 t o m a t o s p o t t e d w i l t v i r u s T S W V 侵染的辣椒或番茄的葉片或種子樣品均由 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院保存 1 2 方法 1 2 1 總R N A提取 稱取1 0 0 0粒健康或帶病毒的番茄或辣椒種子在 干磨機(jī)中打碎至粉末狀 按質(zhì)量體積比1 2比例加入 1 P B S緩沖液 N a C l 1 3 7 m m o l L K C l 1 2 7 m m o l L N a 2 H P O 4 1 2 H 2 O 1 0 m m o l L K H 2 P O 4 2 m m o l L 充分混合放置4 5 m i n 取1 m L上清液備用 取健康 或帶病毒的番茄或辣椒葉片在液氮中充分研磨 稱 取0 1 g備用 按照植物總R N A提取試劑盒 D P 4 3 2 天根生化科技有限公司 說(shuō)明書提取R N A 于 8 0 保存?zhèn)溆?1 2 2 R P A引物 c r R N A及熒光報(bào)告基因F Q 設(shè)計(jì) 根據(jù)N C B I中T o M V外殼蛋白對(duì)應(yīng)基因序列 進(jìn)行序列比對(duì)分析并設(shè)計(jì)引物 使用N C B I中P r i m e r B L A S T h t t p s w w w n c b i n l m n i h g o v t o o l s p r i m e r b l a s t 對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性驗(yàn) 證 使用在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站C R I S P R進(jìn)行c r R N A設(shè)計(jì) 632 5 0卷第4期董錚等 基于R P A C R I S P R C a s 1 2 a的番茄花葉病毒可視化檢測(cè)方法的建立 表1 c r R N A 熒光報(bào)告基因F Q序列和引物均由北京擎科生物科技有限公司合成 表1 番茄花葉病毒的RPA擴(kuò)增引物 crRNA及熒光報(bào)告基因序列 Table1 SequencesofprimersusedforRPAamplification crRNA andfluorescencereportergeneoftomatomosaicvirus 引物 P r i m e r 序列 5 3 S e q u e n c e 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 b p E x p e c t e d s i z e T o M V R P A F C T T A C T C A A T C A C T T C T C C A T C G C A A T T T G T G 2 1 9 T o M V R P A R C A T T G T A C C T G T A C A C C T T A T A A A C A T C G C C T o M V c r R N A U A A U U U C U A C U A A G U G U A G A U A A A C A C A G C A A G C A A G A A C U A C U F Q F A M C C G G A A A A A A A A A A A A C C G G B H Q 1 1 2 3 R P A檢測(cè)方法 本研究按照R P A恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒 W L R B 8 2 0 7 K I T 安普未來(lái)生物科技有限公司 進(jìn)行 R P A反應(yīng) 擴(kuò)增體系為5 0 L 每個(gè)反應(yīng)管中加入 待測(cè)樣品R N A模板2 L B u f f e r A 2 9 4 L B u f f e r B 2 5 L T o M V R P A F 2 L T o M V R P A R 2 L d d H 2 O 1 2 1 L 混合均勻后在 4 2 反應(yīng)1 5 m i n 反應(yīng)結(jié)束后純化擴(kuò)增產(chǎn)物 加 入等體積的T r i s飽和酚 氯仿 異戊醇 2 5 2 4 1 抽提液 混勻 1 2 0 0 0 r m i n離心5 m i n 取上清 進(jìn)行顯色反應(yīng) 1 2 4 C R I S P R C a s 1 2 a等溫快速可視化檢測(cè)方法 本研究采用的C R I S P R C a s 1 2 a反應(yīng)擴(kuò)增體系為 1 0 N E B u f f e r 3 1 2 L R N a s e i n h i b i t o r 4 0 U L 0 5 L D T T 0 1 m m o l L 0 5 L T o M V c r R N A 1 0 m o l L 2 L L b C a s 1 2 a C p f 1 5 m o l L 0 8 L 熒光報(bào)告基因F Q 1 0 m o l L 0 8 L d d H 2 O 1 1 4 L 將上述溶液加到反應(yīng)管中充分混 合后 加入2 L純化好的R P A反應(yīng)產(chǎn)物 再次充分 混勻 離心 3 7 反應(yīng)1 5 m i n 反應(yīng)結(jié)束后在藍(lán)光 4 4 0 4 6 0 n m 下觀察 當(dāng)溶液發(fā)出綠色熒光時(shí) 判 定待測(cè)樣品為T o M V陽(yáng)性 1 2 5 C R I S P R C a s 1 2 a等溫快速可視化檢測(cè)體系 優(yōu)化 對(duì)熒光報(bào)告基因F Q終濃度進(jìn)行優(yōu)化時(shí) 將其終 濃度依次設(shè)置為1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 n m o l L 其他試驗(yàn)條件保持不變 對(duì)C a s 1 2 a c r R N A濃度比例 進(jìn)行優(yōu)化時(shí) 將其濃度比例分別設(shè)置為2 1 1 1 1 2 1 5 1 1 0 其他試驗(yàn)條件保持不變 在優(yōu)化好熒光報(bào)告 基因F Q終濃度和C a s 1 2 a c r R N A濃度比例的基礎(chǔ) 上 確定最終濃度 將C a s 1 2 a c r R N A最終濃度分別設(shè) 置為1 2 5 n m o l L 1 6 2 5 n m o l L 1 2 5 n m o l L 1 1 2 5 n m o l L 1 5 0 n m o l L 1 2 5 0 n m o l L 1 1 0 0 n m o l L 1 5 0 0 n m o l L 1 2 0 0 n m o l L 1 1 0 0 0 n m o l L 1 4 0 0 n m o l L 1 2 0 0 0 n m o l L 1 1 2 6 特異性分析 提取辣椒和番茄上常見(jiàn)的A r M V C M V P M M o V T o B R F V T o M M V T o R S V T R S V T M V T S W V樣品總R N A作為模板 使用建立的基于 R P A C R I S P R C a s的等溫快速可視化檢測(cè)體系對(duì) 其進(jìn)行擴(kuò)增 以驗(yàn)證該檢測(cè)體系是否與其他病毒有 交叉反應(yīng) 1 2 7 靈敏度分析 將T o M V的R N A按1 0倍濃度梯度稀釋為 1 7 2 n g L 1 7 2 n g L 1 7 2 p g L 1 7 2 p g L 1 7 2 p g L 1 7 2 f g L 1 7 2 f g L 1 7 2 f g L 1 7 2 a g L 1 7 2 a g L 將稀釋后的樣品分別取 2 L進(jìn)行R P A C R I S P R C a s等溫快速可視化檢 測(cè) R P A檢測(cè)和R T P C R檢測(cè) 確定檢測(cè)靈敏度 參照 番茄花葉病毒檢疫鑒定方法 G B T 3 6 7 7 1 2 0 1 8 3 設(shè)計(jì)R T P C R引物 引物序列為 R T T o M V F 5 C G A G A G G G G C A A C A A A C A T 3 R T T o M V R 5 A C C T G T C T C C A T C T C T T T G G 3 擴(kuò) 增片段長(zhǎng)度為3 1 8 b p 參照全式金T r a n s S c r i p t I I O n e S t e p R T P C R S u p e r M i x試劑盒配制2 0 L 總反應(yīng)體系 包括R N A 4 L R T T o M V F和R T T o M V R 1 0 m o l L 各0 4 L T r a n s S c r i p t I I O n e S t e p E n z y m e M i x 0 4 L 2 T S I I O n e S t e p R e a c t i o n M i x 1 0 L d d H 2 O 4 8 L 反應(yīng)條件為 4 5 3 0 m i n 9 4 5 m i n 9 4 3 0 s 5 8 3 0 s 7 2 4 0 s 3 5個(gè)循環(huán) 7 2 1 0 m i n 1 2 8 樣品檢測(cè) 收集1 0份辣椒和番茄的葉片或種子樣品提取 總R N A 表2 使用建立的R P A C R I S P R C a s 1 2 a 體系進(jìn)行T o M V的檢測(cè) 并與R T P C R檢測(cè)方法比 較 分析檢測(cè)準(zhǔn)確率 732 2 0 2 4 表2 10份待檢測(cè)番茄花葉病毒樣品 Table2 10samplesusedfordetectionoftomatomosaicvirus 編號(hào)樣品類別取樣部位來(lái)源 N o S a m p l e c a t e g o r y S a m p l i n g l o c a t i o n O r i g i n 1番茄葉片廣東 2番茄葉片山東 3番茄種子甘肅 4番茄葉片福建 5番茄葉片遼寧 6辣椒葉片山東 7辣椒種子內(nèi)蒙古 8辣椒葉片山東 9辣椒種子山東 1 0辣椒葉片山東 2 結(jié)果與分析 2 1 可視化反應(yīng)體系優(yōu)化 為建立最適的R P A C R I S P R C a s 1 2 a反應(yīng)體 系 進(jìn)行熒光報(bào)告基因F Q終濃度優(yōu)化 試驗(yàn)結(jié)果 如圖1 a所示 當(dāng)熒光報(bào)告基因F Q終濃度達(dá)到 4 0 0 n m o l L時(shí) 離心管中綠色熒光強(qiáng)度達(dá)到最亮 繼續(xù)增加濃度時(shí)亮度不再增加 因此選擇4 0 0 n m o l L 為熒光報(bào)告基因F Q終濃度 C a s 1 2 a c r R N A濃度比例的優(yōu)化結(jié)果如圖1 b 所示 當(dāng)C a s 1 2 a c r R N A濃度比例為1 5時(shí) 離心管 中綠色熒光強(qiáng)度達(dá)到最亮 最終確定C a s 1 2 a c r R N A濃度比例為1 5 C a s 1 2 a c r R N A濃度的優(yōu)化結(jié)果如圖1 c所示 結(jié)果表明C a s 1 2 a c r R N A濃度為2 0 0 n m o l L 1 1 0 0 0 n m o l L 1和4 0 0 n m o l L 1 2 0 0 0 n m o l L 1 時(shí)離心管中綠色熒光強(qiáng)度達(dá)到最亮 考慮成本問(wèn)題 最終確定C a s 1 2 a c r R N A濃度為2 0 0 n m o l L 1 1 0 0 0 n m o l L 1 結(jié)合上述優(yōu)化試驗(yàn) 最終確定顯色體系為 2 L純化的R P A反應(yīng)產(chǎn)物 靶標(biāo)濃度約為2 5 1 0 0 n g L 1 0 N E B u f f e r 3 1 2 L 4 0 U L R N A s e i n h i b i t o r 0 5 L 0 1 m m o l L D T T 0 5 L 1 0 m o l L T o M V c r R N A 2 L 5 m o l L L b C a s 1 2 a C p f 1 0 8 L 1 0 m o l L熒光報(bào)告基因 F Q 0 8 L d d H 2 O 1 1 4 L 2 2 檢測(cè)體系的特異性分析 為了評(píng)估R P A C R I S P R C a s 1 2檢測(cè)體系的特 異性 根據(jù)優(yōu)化好的R P A C R I S P R C a s 1 2 a反應(yīng)體 圖1 RPA CRISPR Cas12a反應(yīng)體系優(yōu)化 Fig 1 OptimizationofRPA CRISPR Cas12areactionsystem 系對(duì)分別攜帶 A r M V C M V P M M o V T o B R F V T o M M V T o R S V T R S V T M V T S W V的樣品進(jìn) 行檢測(cè) 以d d H 2 O為陰性對(duì)照 N C 結(jié)果顯示 攜 帶T o M V病毒的樣品檢測(cè)為陽(yáng)性 帶有其他9種病 毒的樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性 圖2 2 3 檢測(cè)體系的靈敏度測(cè)定 以攜帶T o M V的番茄樣品總R N A為模板 R P A C R I S P R C a s 1 2 a反應(yīng)能檢測(cè)到的極限為 1 7 2 a g L 圖3 a R P A反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度為 1 7 2 f g L 圖3 b 而普通R T P C R的檢測(cè)靈敏度 為1 7 2 p g L 圖3 c 在此條件下 建立的R P A C R I S P R C a s 1 2 a檢測(cè)的靈敏度顯著高于普通R T P C R 是普通R T P C R的1 0 0 0 0倍 832 5 0卷第4期董錚等 基于R P A C R I S P R C a s 1 2 a的番茄花葉病毒可視化檢測(cè)方法的建立 圖2 番茄花葉病毒RPA CRISPR Cas12體系的特異性分析 Fig 2 SpecificityassayofRPA CRISPR Cas12fordetectionoftomatomosaicvirus 圖3 番茄花葉病毒RPA CRISPR Cas12a RPA和RT PCR體系靈敏度分析 Fig 3 SensitivitytestofRPA CRISPR Cas12a RPAandRT PCRfordetectionoftomatomosaicvirus 932 2 0 2 4 2 4 辣椒和番茄樣品的檢測(cè) 使用建立的R P A C R I S P R C a s 1 2 a體系進(jìn)行 T o M V的檢測(cè) 以d d H 2 O為陰性對(duì)照 N C 攜帶 T o M V的番茄樣品總R N A為陽(yáng)性對(duì)照 P 結(jié)果顯 示 總共在3份樣品中檢出T o M V 圖4 a R T P C R檢 測(cè)結(jié)果與R P A C R I S P R C a s 1 2 a檢測(cè)結(jié)果一致 圖4 b 圖4 RPA CRISPR Cas12a RT PCR檢測(cè)10份樣品攜帶番茄花葉病毒 Fig 4 RPA CRISPR Cas12a RT PCRdetectionoftomatomosaicvirusin10samples 3 結(jié)論與討論 T o M V主要危害番茄 辣椒及多數(shù)茄科植物 在世界各地廣泛分布 快速 準(zhǔn)確地檢測(cè)該病毒有 助于預(yù)防其進(jìn)一步傳播 然而 現(xiàn)有的T o M V診斷 方法只能在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行 本研究開(kāi)發(fā)了一種快 速 特異 靈敏的R P A C R I S P R C a s 1 2 a技術(shù)的 T o M V可視化檢測(cè)方法 在R P A C R I S P R C a s 1 2 a 檢測(cè)體系中加入熒光報(bào)告基因F Q F A M C C G G A A A A A A A A A A A A C C G G B H Q 1 如果發(fā)現(xiàn)目 標(biāo)序列 熒光報(bào)告基因被切割出F A M基團(tuán) 可在藍(lán) 光 4 4 0 4 6 0 n m 下直接觀察到綠色熒光信號(hào) 增加 了該方法的便攜性 因此 該方法具有在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè) 中使用的潛力 本研究構(gòu)建的R P A C R I S P R C a s 1 2 a體系的靈 敏度是R P A反應(yīng)的1 0倍 是R T P C R的1 0 0 0 0 倍 顯著高于傳統(tǒng)的R T P C R R P A與C R I S P R C a s 1 2 a系統(tǒng)相結(jié)合 能夠獲得比R P A反應(yīng)靈敏度 更高的檢測(cè)技術(shù) 對(duì)環(huán)境要求低 操作簡(jiǎn)單 不需 要P C R儀和瓊脂糖凝膠電泳 可以實(shí)現(xiàn)在田間 口 岸等現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求 但是通常檢測(cè)靈敏度 越高的技術(shù) 在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)生污染的可能性越 大 因此可以優(yōu)先選用帶有濾芯的滅菌移液器槍 頭和單獨(dú)開(kāi)蓋的離心管進(jìn)行試驗(yàn) 后續(xù)可以考 慮在同一個(gè)離心管中進(jìn)行R P A反應(yīng)和C R I S P R C a s 1 2 a可視化反應(yīng) 減少中途開(kāi)蓋操作 降低污 染的可能 本研究建立的R P A C R I S P R C a s 1 2 a檢測(cè)方 法只需反應(yīng)3 0 m i n 利用便攜式恒溫金屬浴和充 電式藍(lán)光燈 即可快速檢測(cè)T o M V 可用于田間 和口岸檢疫等 為我國(guó)番茄花葉病毒的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào) 和田間診斷等提供了更為便捷的技術(shù)手段 具有 廣泛的應(yīng)用前景 對(duì)我國(guó)番茄花葉病毒的防控具 有重要意義 參考文獻(xiàn) 1 金鳳媚 薛俊 郟艷紅 等 天津地區(qū)番茄黃化曲葉病毒 D N A A的克隆和序列分析 J 華北農(nóng)學(xué)報(bào) 2 0 1 1 2 6 1 5 8 6 2 2 金鳳媚 薛俊 宋建 等 天津地區(qū)番茄褪綠病毒的分子檢測(cè) 042 5 0卷第4期董錚等 基于R P A C R I S P R C a s 1 2 a的番茄花葉病毒可視化檢測(cè)方法的建立 與基因組部分序列分析 J 華北農(nóng)學(xué)報(bào) 2 0 1 6 3 1 2 2 3 2 7 3 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì) 番茄花葉病毒檢疫鑒定方法 第4部 分原理 G B T 3 6 7 7 1 2 0 1 8 S 北京 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社 2 0 1 8 4 曹金強(qiáng) 柴阿麗 謝學(xué)文 等 番茄花葉病毒對(duì)番茄莖部和果 實(shí)危害嚴(yán)重 J 中國(guó)蔬菜 2 0 1 6 1 0 8 4 8 6 5 D U A N X u e y a n M A W e n d i J I A O Z h i y u a n e t a l R e v e r s e t r a n s c r i p t i o n r e c o m b i n a s e a i d e d a m p l i f i c a t i o n a n d C R I S P R C a s 1 2 a b a s e d v i s u a l d e t e c t i o n o f m a i z e c h l o r o t i c m o t t l e v i r u s J O L P h y t o p a t h o l o g y R e s e a r c h 2 0 2 2 4 1 2 3 D O I 1 0 1 1 8 6 s 4 2 4 8 3 0 2 2 0 0 1 2 8 y 6 P I E P E N B U R G O W I L L I A M S C H S T E M P L E D L e t a l D N A d e t e c t i o n u s i n g r e c o m b i n a t i o n p r o t e i n s J O L P L o S B i o l o g y 2 0 0 6 4 7 e 2 0 4 D O I 1 0 1 3 7 1 j o u r n a l p b i o 0 0 4 0 2 0 4 7 J I A N G F u g u o D O U D N J A C R I S P R C a s 9 s t r u c t u r e s a n d m e c h a n i s m s J A n n u a l R e v i e w o f B i o p h y s i c s 2 0 1 7 2 2 4 6 5 0 5 5 2 9 8 G A S I U N A S G B A R R A N G O U R H O R V A T P e t a l C a s 9 c r R N A r i b o n u c l e o p r o t e i n c o m p l e x m e d i a t e s s p e c i f i c D N A c l e a v a g e f o r a d a p t i v e i m m u n i t y i n b a c t e r i a J P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U n i t e d S t a t e s o f A m e r i c a 2 0 1 2 1 0 9 3 9 E 2 5 7 9 E 2 5 8 6 9 J I N E K M C H Y L I N S K I K F O N F A R A I e t a l A p r o g r a m m a b l e d u a l R N A g u i d e d D N A e n d o n u c l e a s e i n a d a p t i v e b a c t e r i a l i m m u n i t y J S c i e n c e 2 0 1 2 3 3 7 6 0 9 6 8 1 6 8 2 1 1 0 H W A N G W Y F U Y a n f a n g R E Y O N D e t a l E f f i c i e n t g e n o m e e d i t i n g i n z e b r a f i s h u s i n g a C R I S P R C a s s y s t e m J N a t u r e B i o t e c h n o l o g y 2 0 1 3 3 1 3 2 2 7 2 2 9 1 1 S H A L E M O S A N J A N A N E H A R T E N I A N E e t a l G e n o m e s c a l e C R I S P R C a s 9 k n o c k o u t s c r e e n i n g i n h u m a n c e l l s J S c i e n c e 2 0 1 4 3 4 3 6 1 6 6 8 4 8 7 1 2 G A R S T A D B A S S A L O M C P I N E S G e t a l G e n o m e w i d e m a p p i n g o f m u t a t i o n s a t s i n g l e n u c l e o t i d e r e s o l u t i o n f o r p r o t e i n m e t a b o l i c a n d g e n o m e e n g i n e e r i n g J N a t u r e B i o t e c h n o l o g y 2 0 1 7 3 5 1 4 8 5 5 1 3 C H E N J S M A E n b o H A R R I N G T O N L B e t a l C R I S P R C a s 1 2 a t a r g e t b i n d i n g u n l e a s h e s i n d i s c r i m i n a t e s i n g l e s t r a n d e d D N a s e a c t i v i t y J S c i e n c e 2 0 1 8 3 6 0 6 3 8 7 4 3 6 4 3 9 1 4 H A R R I N G T O N L B B U R S T E I N D C H E N J S e t a l P r o g r a m m e d D N A d e s t r u c t i o n b y m i n i a t u r e C R I S P R C a s 1 4 e n z y m e s J S c i e n c e 2 0 1 8 3 6 2 6 4 1 6 8 3 9 8 4 2 1 5 G O O T E N B E R G J S A B U D A Y Y E H O O L E E J W e t a l N u c l e i c a c i d d e t e c t i o n w i t h C R I S