低溫對(duì)鐵皮石斛活性成分合成影響機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

低溫對(duì)鐵皮石斛活性成分合成影響 機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究 王小仲 1 馬 艷 1 任得強(qiáng) 2 1 關(guān)嶺自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 貴州 關(guān)嶺 561300 2 貴州中醫(yī)藥大學(xué) 貴州 貴陽(yáng) 550025 摘要 目的 挖掘低溫條件下鐵皮石斛多糖 生物堿 黃酮合成路徑上的差異表達(dá)基因 為低溫脅迫 對(duì)鐵皮石斛活性成分合成的影響機(jī)制提供理論依據(jù) 方法 用Illumina Novaseq 6000測(cè)序技術(shù)對(duì)低溫脅 迫下鐵皮石斛葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 使用Cutadapt對(duì)獲得的序列進(jìn)行過(guò)濾組裝 獲得有效序列 Clean data 選擇log2Fold Change 處理組 對(duì)照組 1 且FDR 0 001作為參數(shù)篩選差異表達(dá)基因 通過(guò)參考基因組 Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù) Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋 運(yùn)用GO KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集 分析 結(jié)果 測(cè)序得到46 85 Gb數(shù)據(jù) 有1 815個(gè)差異表達(dá)基因參與鐵皮石斛低溫脅迫響應(yīng) 其中 1 281 個(gè)基因上調(diào)表達(dá) 534個(gè)基因下調(diào)表達(dá) 有12個(gè)多糖 6個(gè)生物堿 53個(gè)黃酮類化合物合成路徑上的差異表達(dá) 基因被檢測(cè)到 qRT PCR驗(yàn)證與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致 結(jié)論 鐵皮石斛的多糖 生物堿 黃酮合成路徑上 的71個(gè)差異表達(dá)基因參與了低溫脅迫的響應(yīng) 從而對(duì)鐵皮石斛藥材品質(zhì)產(chǎn)生影響 其中 黃酮類物質(zhì)可能在 鐵皮石斛低溫耐受過(guò)程中發(fā)揮重要作用 關(guān)鍵詞 鐵皮石斛 低溫脅迫 藥材品質(zhì) 差異表達(dá)基因 黃酮 轉(zhuǎn)錄組學(xué) 中圖分類號(hào) S567 239文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1001 3601 2025 01 0013 0097 09 Transcriptomics Study on Influencing Mechanism of Low Temperature on Active Components Synthesis in Dendrobium officinale WANG Xiaozhong1 MA Yan1 REN Deqiang2 1 Guanling Bureau of Agricultural and Rural Affairs Guanling Guizhou 561300 2 Guizhou University of Traditional Chinese Medicine Guiyang Guizhou 550025 China Abstract Objective The differential expression genes in the synthesis pathway of polysaccharides alkaloids and flavonoids of Dendrobium officinale under low temperature condition were explored which provided the theoretical basis for studying the influencing mechanism of low temperature stress to the active components synthesis of D officinale Method Illumina NovaseqTM 6000 sequencing technology was used to perform transcriptome sequencing of D officinale leaves under low temperature stress The sequences obtained by Cutadapt were filtered and assembled to obtain the clean data The differential expression genes were screened with log2Fold Change Treatment Control 1 and FDR 0 001 as parameters The differential expression genes were annotated by referring to the genome Swissprot database and Uniprot database and the differential expression genes were enriched and analyzed by GO and KEGG databases Result A total of 46 85 Gb data were obtained by sequencing 1 815 differential expression genes involved in the response of low temperature stress process of which 1 281 genes were up regulated and 534 genes were down regulated 12 6 and 53 differential expression genes in the synthesis pathway of polysaccharides alkaloids and flavonoids were detected respectively qRT PCR verification was consistent with transcriptome analysis results Conclusion A total of 71 differential expression genes in the synthesis pathway of polysaccharides alkaloids and flavonoids of D officinale involved in the response to low temperature stress thus affecting the quality of D officinale Flavonoids may play an important role in the process of low temperature tolerance of D officinale Key words Dendrobium officinale low temperature stress quality of medicinal material differential expression genes flavonoids transcriptome 收稿日期 2024 06 06 基金項(xiàng)目 貴州省科技廳基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目 重點(diǎn)大品種鐵皮石斛低溫脅迫響應(yīng)機(jī)制及耐寒品種分子標(biāo)記輔助選擇研究 黔科合基礎(chǔ) ZK 2022 一般481 貴州中醫(yī)藥大學(xué)博士啟動(dòng)資金項(xiàng)目 鐵皮石斛全基因組SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及種質(zhì)資源遺傳多樣性分析 貴中醫(yī)博士啟動(dòng) 2019 067 作者簡(jiǎn)介 王小仲 1981 男 高級(jí)農(nóng)藝師 碩士 從事中藥材資源與產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究及農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作 E mail 463500237 通信作者 馬 艷 1978 女 高級(jí)農(nóng)藝師 從事中藥材資源與產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究及農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作 E mail 506601392 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué) Guizhou Agricultural Sciences 2025 53 1 97 105 DOI 10 3969 j issn 1001 3601 2025 01 013 0 引言 研究意義 鐵皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo 為蘭科石斛屬多年 生草本植物 是傳統(tǒng)名貴中藥材 1 具有較高 的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值 但不耐低溫 低溫是影 響植物區(qū)域分布和生長(zhǎng)發(fā)育主要環(huán)境因子 隨著鐵皮石斛種植在我國(guó)不斷北移及向高 海拔地區(qū)推廣擴(kuò)大 低溫對(duì)鐵皮石斛活性成 分合成及藥材品質(zhì)的影響機(jī)制逐漸成為研 究熱點(diǎn) 前人研究進(jìn)展 現(xiàn)代研究表明 植物的低溫脅迫響應(yīng)是多基因控制的復(fù)雜 性狀 轉(zhuǎn)錄組學(xué)是挖掘重要性狀基因 揭示 關(guān)鍵機(jī)制的有效技術(shù)手段 植物遭受冷脅迫 時(shí) 通過(guò)誘導(dǎo)相關(guān)基因的大量表達(dá) 糖醇 特殊氨基酸 甘氨酸 甜菜堿及脯氨酸等小 分子質(zhì)量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累增加 使?jié)B透 壓平衡維持 降低植物水勢(shì) 從而避免或者 減少低溫造成的傷害 因而 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技 術(shù)逐漸成為研究藥用植物天然活性成分生 物合成相關(guān)功能基因挖掘及其表達(dá)規(guī)律的 重要手段 如在鐵皮石斛 2 八爪金龍 3 五 倍子 4 萱草 5 山銀花 6 等的藥用次生代謝 產(chǎn)物合成調(diào)控機(jī)制研究中得到廣泛應(yīng)用 鐵皮石斛中多糖 生物堿 黃酮類等活性成 分決定其藥材品質(zhì) 而且多糖 生物堿及黃 酮類化合物在鐵皮石斛低溫耐受過(guò)程中發(fā) 揮著十分重要的作用 黃酮類作為植物次 生代謝產(chǎn)物的重要成分 在低溫脅迫下變化 顯著 桃樹(shù)葉低溫脅迫下類黃酮代謝相關(guān) 的黃酮醇及衍生物含量和抗氧化能力顯著 提高 7 植物受低溫脅迫時(shí) 通過(guò)增加膜脂 中亞麻酸 油酸和磷脂等不飽和脂肪酸含 量增加保持細(xì)胞膜的流動(dòng)性 維持細(xì)胞正常 生理功能 百香果低溫脅迫后其茉莉酸代 謝途徑相關(guān)基因AOC AOS JAR1 MYC2 PYL和JAZ均上調(diào)表達(dá) COI1的表達(dá)水平呈 下調(diào)趨勢(shì) 8 同時(shí)植物通過(guò)積累碳水化合物 抵御嚴(yán)寒 如巨桉在4 低溫條件下葉片中 可溶性糖含量逐漸增加 參與細(xì)胞壁成分構(gòu) 成的阿拉伯糖 半乳糖等也有所增加 9 研 究切入點(diǎn) 鐵皮石斛不同種源的耐低溫特 性差異明顯 其中 浙江種源抗寒性最好 低 溫條件下植株具有更高的多糖含量 鐵皮石 斛在低溫條件下抗壞血酸過(guò)氧化物酶 丙 二醛和脯氨酸含量也表現(xiàn)出一定的規(guī)律性 2 然而 低溫條件對(duì)鐵皮石斛活性成分合成的 影響機(jī)制尚未闡明 亟待開(kāi)展相關(guān)研究 擬 解決的關(guān)鍵問(wèn)題 利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段 挖 掘低溫條件下鐵皮石斛多糖 生物堿 黃酮 合成路徑上的差異表達(dá)基因 為揭示低溫對(duì) 鐵皮石斛活性成分合成的影響機(jī)制提供理 論參考 1 材料與方法 1 1 材料 供試鐵皮石斛為森山1號(hào) 選取生長(zhǎng)一 致的組培材料作處理組和對(duì)照組 各2瓶 處理組進(jìn)行4 低溫脅迫處理 每隔24 h 處理組和對(duì)照組 常溫25 取鮮嫩葉1次 液氮快速冷凍后保存于 70 超低溫冰箱 備用 1 2 方法 1 2 1 RNA的提取及測(cè)序 將樣品放在冰 上融化后粉碎 充分混勻并離心 去上清液 用Trizol試劑分離提取總RNA 用 Oligotex mRNA 試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行純化 利用Aglient 2 100檢測(cè)RNA樣品的濃度和完整性 6個(gè) 鐵皮石斛RNA樣品均滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的建 庫(kù)要求 RNA樣品送至聯(lián)川生物科技有限 公司 使用Illumina Novaseq 60 000進(jìn)行轉(zhuǎn) 錄組測(cè)序 對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的原始測(cè)序數(shù)據(jù) Raw Reads 進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾 經(jīng)去接頭 對(duì) Ns 無(wú)法確定堿基信息 比例大于10 的讀 長(zhǎng)片段 低質(zhì)量讀長(zhǎng)片段 質(zhì)量值Qphred 20的堿基數(shù)占整個(gè)讀長(zhǎng)片段50 以上的讀 長(zhǎng)片段 的過(guò)濾 利用Cutadapt對(duì)有效序列 進(jìn)行重頭組裝 用Cd hit去除完全一樣的序 列 然后使用Tgicl進(jìn)行聚類 合并相似度大 98 貴 州 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 于90 重疊序列長(zhǎng)度大于35的序列 最后 得到基因序列 1 2 2 Gene的注釋和分類 根據(jù)處理組和 對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中每個(gè)基因的 表達(dá)量 選擇log2Fold Change Treatment Cont rol 1 且FDR 0 001的作為參數(shù)篩選得到 差異表達(dá)基因 通過(guò)參考基因組 Swissprot 數(shù)據(jù)庫(kù) Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn) 行注釋 1 2 3 差異基因的qRT PCR熒光定量分析 以Actin蛋白為內(nèi)參 參照趙俊等 10 的方 法進(jìn)行差異基因的qRT PCR熒光定量分析 PCR反應(yīng)程序 95 預(yù)變性30 s 94 變性 5 s 56 60 退火10 s 72 延伸13 s 共 42個(gè)循環(huán) 每個(gè)處理分別執(zhí)行3次生物學(xué) 重復(fù) 每個(gè)反應(yīng)分別做3個(gè)重復(fù) 反應(yīng)結(jié)束 后分析溶解曲線和熒光曲線 1 3 數(shù)據(jù)處理 以Actin蛋白為對(duì)照 Ct值取平均值 采 用2 Ct算法分析試驗(yàn)結(jié)果 2 結(jié)果與分析 2 1 鐵皮石斛差異基因表達(dá) 鐵皮石斛RNA樣品測(cè)序共計(jì)產(chǎn)生46 85 Gb 的數(shù)據(jù) 在處理組 4 低溫 和對(duì)照組 常 溫25 分別得到23 62 Gb和23 23 Gb測(cè)序 數(shù)據(jù) Raw data 經(jīng)過(guò)濾 處理組和對(duì)照組 分別得到20 67 Gb和20 65 Gb的可讀片段 表1 表 1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所有樣品的數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì) Table 1 Statistics of all samples of transcriptome sequencing 組別 Group 樣本 Sample 原始數(shù)據(jù) Gb Raw data 有效序列 Gb Clean data 有效率 Valid ratio GC含量 GC content 對(duì)照 CK DE C 1 7 97 7 04 88 28 46 00 DE C 2 7 60 6 93 91 19 46 50 DE C 3 7 66 6 68 87 26 46 00 處理 Treatment DE T 1 7 82 6 79 86 84 46 00 DE T 2 8 05 7 30 90 70 46 00 DE T 3 7 75 6 58 84 89 46 00 經(jīng)分析 共得到1 815個(gè)差異表達(dá)基因 其中 1 281個(gè)基因表達(dá)上調(diào) 534個(gè)基因表 達(dá)下調(diào) 圖1 通過(guò)參考基因組 Swissprot 數(shù)據(jù)庫(kù) Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn) 行注釋 差異表達(dá)基因均能被注釋 圖2 2 2 GO富集分析 對(duì)鐵皮石斛差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集 分析 E 值 10 5 其中 1 630個(gè)基因被富集 到不同生物過(guò)程中 差異表達(dá)基因被富集 到的生物過(guò)程分為1 525類 圖3 其中 主 要富集到細(xì)胞核 Nucleus 32 3 細(xì)胞膜 Plasma membrane 16 9 其次為細(xì)胞膜組 成分 Integral component of membrane 14 9 分子功能 Molecular function 14 1 生物 過(guò)程 Biological process 25 9 在分子功能 過(guò)程中 差異表達(dá)基因還被富集到分子功能 Molecular function 46 6 轉(zhuǎn)錄因子活性 Transcription factor activity 34 4 ATP結(jié) 合 ATP binding 27 9 DNA結(jié)合 DNA binding 27 9 GO功能分類提供了基因 主要參與的生物學(xué)過(guò)程和相關(guān)功能 為后續(xù) 進(jìn)一步篩選目的基因提供了信息 1 500 1 000 500 0 轉(zhuǎn)錄組數(shù)量 個(gè) Number of transcripts DE TVSDE C Up Down1 281 534 圖 1 鐵皮石斛低溫脅迫處理差異表達(dá)基因 Fig 1 The differential expression genes in D officinale under low temperature stress 1 期王小仲 等 低溫對(duì)鐵皮石斛活性成分合成影響機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究 99 2 3 KEGG代謝通路富集 鐵皮石斛1 815個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行 KEGG顯著性富集分析 可注釋到的差異表 達(dá)基因被富集到121個(gè)代謝通路中 不同的 代謝通路富集到的基因?yàn)? 151個(gè) 圖4 差異基因顯著富集途徑主要有2個(gè) 其中 植物 病原菌互作 Plant pathogen interaction 差異基因151個(gè) 占16 5 植物荷爾蒙信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 Plant hormone signal transduction 120個(gè) 占13 1 淀粉和糖類代謝 Starch 2 0 1 5 1 0 0 5 0 0 5 1 0 DE T 1 DE T 2 DE T 3 DE C 1 DE C 2 DE C 3 圖 2 鐵皮石斛低溫脅迫處理差異表達(dá)基因熱圖 Fig 2 Heat map of differential expression genes in D officinale under low temperature stress 100 貴 州 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) and sucrose metabolism 差異表達(dá)基因有73個(gè) 占8 0 氨基糖和核苷酸糖代謝 Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 有42個(gè) 占4 6 苯丙烷生物合成 Phenylpropanoid biosynthesis 有35個(gè) 占3 8 除以上代謝途徑以外 內(nèi)吞作用 Endo cytosis 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工 Protein proc essing in endoplasmic reticulum 類黃酮生物 合成 Flavonoid biosynthesis 晝夜節(jié)律 植物 Circadian rhythm plant 磷脂酰肌醇信號(hào)系 生物過(guò)程轉(zhuǎn)錄調(diào)控 轉(zhuǎn)錄 蛋白質(zhì)磷酸化 防御反應(yīng) 氧化還原過(guò)程蛋白質(zhì)泛素化對(duì)傷害的反應(yīng) 對(duì)幾丁質(zhì)的反應(yīng)對(duì)脫落酸的反應(yīng) 對(duì)寒冷的反應(yīng) 對(duì)鹽脅迫的反應(yīng) 細(xì)胞壁組織 對(duì)鎘離子的發(fā)應(yīng)多細(xì)胞生物發(fā)育 對(duì)缺水的反應(yīng) 脫落酸激活的信號(hào)通路 對(duì)真菌的防御反應(yīng) 對(duì)生長(zhǎng)素的反應(yīng) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 次生代謝產(chǎn)物生物合成過(guò)程 蛋白水解 乙烯激活的信號(hào)通路類黃酮生物合成過(guò)程 磷酸化 對(duì)光刺激的反應(yīng)對(duì)水楊酸的反應(yīng) 對(duì)細(xì)菌的防御反應(yīng) 核 質(zhì)膜 膜的組成部分 細(xì)胞質(zhì)葉綠體 細(xì)胞外區(qū)胞質(zhì)溶膠 線粒體 膜 胞間連絲高爾基體 細(xì)胞壁 質(zhì)膜的組成部分 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)外體 分子功能 轉(zhuǎn)錄因子活性 序列特異性 DNA 結(jié)合 ATP 結(jié)合 DNA 結(jié)合 蛋白質(zhì)結(jié)合 蛋白質(zhì)絲氨酸 蘇氨酸激酶活性 金屬離子結(jié)合 激酶活性 鋅離子結(jié)合 序列特異性 DNA 結(jié)合 500 400 300 200 100 0 數(shù)量 類 Quantity Biological process Cellular component Molecular function Ontology GO富集分析 Go enrichment analysis 圖 3 鐵皮石斛低溫脅迫差異基因的GO富集 Fig 3 Go enrichment of differential genes in D officinale under low temperature stress 植物 病原相互作用 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 黃酮生物合成 光合作用 天線蛋白 黃酮和黃酮醇的生物合成 二苯乙烯類 二芳基庚類和姜辣素的生物合成 晝夜節(jié)律植物 亞油酸代謝 咖啡因代謝 色氨酸代謝 檸檬烯和蒎烯降解 苯丙素生物合成 淀粉和蔗糖代謝 其他聚糖降解 糖胺聚糖降解 異黃酮生物合成 鞘糖脂生物合成 乳糖和新乳糖系列 自噬的調(diào)節(jié) 脂肪酸伸長(zhǎng) 鞘脂代謝 0 1 0 2 0 3 0 4 基因數(shù) 50 100 150 p value 0 125 0 100 0 075 0 050 0 025 圖 4 差異基因的KEGG代謝通路富集 Fig 4 Enrichment of KEGG metabolic pathway of differential genes 1 期王小仲 等 低溫對(duì)鐵皮石斛活性成分合成影響機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究 101 統(tǒng) Phosphatidylinositol signaling system 戊糖 和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化 Pentose and glucur onate interconversions 碳代謝 Carbon meta bolism 色氨酸代謝 Tryptophan metabolism 甘油酯代謝 Glycerolipid metabolism 半乳 糖代謝 Galactose metabolism 氨基酸生物 合成 Biosynthesis of amino acids 等也參與了 低溫脅迫的響應(yīng) 2 4 低溫脅迫處理鐵皮石斛多糖 生物堿 黃酮代謝通路 低溫脅迫鐵皮石斛 經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析 共 檢測(cè)到12個(gè)多糖 6個(gè)生物堿 53個(gè)黃酮合 成路徑上的差異表達(dá)基因 圖5 60 40 20 0 生物堿多糖黃酮 上調(diào) 下調(diào) 差異表達(dá)基因數(shù) 個(gè) Dif ferential expression gene 藥效成分 Active component 圖 5 鐵皮石斛藥效成分合成路徑差異表達(dá)調(diào)控基因 Fig 5 The differential expression regulatory genes in the synthetic pathway of medicinal components of D officinale 多糖類化合物是鐵皮石斛植物內(nèi)主要 活性成分之一 其生物合成受溫度影響較大 通過(guò)低溫脅迫下對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè) 序 發(fā)現(xiàn)12個(gè)基因參與多糖類化合物的低 溫響應(yīng) 其中 9個(gè)上調(diào) 3個(gè)下調(diào) CSLD3 GATL9基因上調(diào)尤為顯著 GO富集分析發(fā) 現(xiàn) CSLD3 GATL9基因均參與多糖生物合 成過(guò)程 GO 0000271 轉(zhuǎn)移酶活性 轉(zhuǎn)移糖 基 GO 0016757 其中 CSLD3基因還參與 冷響應(yīng) GO 00009409 甘露聚糖合酶活性 GO 0051753 纖維素合酶活性 GO 0016 759 纖維素合酶 UDP形成 活性 GO 0016 760 纖維素生物合成過(guò)程 GO 0030244 細(xì)胞壁組織 GO 0071555 等 KEGG富集分 析發(fā)現(xiàn) CSLD3 GATL9基因均參與淀粉和 蔗糖代謝 K00500 氨基糖和核苷酸糖代 謝 K00520 生物堿也是鐵皮石斛植物內(nèi)生物堿類 活性成分 其生物合成亦受溫度影響 6個(gè) 基因參與生物堿類化合物的低溫響應(yīng) 其中 5個(gè)上調(diào) 1個(gè)下調(diào) TYDC2基因上調(diào)尤為顯 著 GO富集分析發(fā)現(xiàn) 5個(gè)上調(diào)基因中 TYDC2基因參與生物堿合成有酪氨酸脫羧 酶活性 GO 0004837 細(xì)胞氨基酸代謝過(guò)程 GO 0006520 L 苯丙氨酸分解代謝過(guò)程 GO 0006559 磷酸吡哆醛結(jié)合 GO 000301 苯乙醛合酶活性 GO 990055 等多個(gè)生物合 成 下調(diào)基因MA16 Dca002252參與調(diào)控分 子功能 GO 0003674 細(xì)胞成分 GO 000 5575 生物過(guò)程 GO 0008150 等 KEGG富 集分析發(fā)現(xiàn) 下調(diào)基因MA16 Dca002252參 與酪氨酸代謝 K00350 異喹啉生物堿生 物合成 K00950 等 黃酮類化合物作為植物內(nèi)常見(jiàn)化合物 其生物合成受溫度的影響較大 鐵皮石斛中 黃酮類化合物也是其活性成分之一 其參與 低溫響應(yīng)的基因有53個(gè)差異基因得到表達(dá) 其中 上調(diào)基因40個(gè) 下調(diào)基因13個(gè) 上調(diào) 基因中UGT73C4 ACT 2 MA16 Dca009088 尤為顯著 下調(diào)基因中TKPR1尤為顯著 GO富集分析發(fā)現(xiàn) 上調(diào)基因UGT73C4 MA16 Dca009088均參與類黃酮生物合成過(guò) 程 GO 0009813 細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合的細(xì)胞器 GO 0043231 類黃酮葡萄糖醛酸化 GO 0052696 槲皮素3 O 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性 GO 0080043 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性 GO 008004 ACT 2基因參與胍丁胺N4 香豆酰 轉(zhuǎn)移酶活性 GO 0047634 下調(diào)基因TKPR1 參與蛋白質(zhì)結(jié)合 GO 0005515 細(xì)胞核 GO 0005634 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) GO 0005783 花粉發(fā)育 GO 0009555 花粉外壁形成 GO 0010584 氧化還原酶活性 GO 0016491 種子發(fā)育 GO 0048316 輔酶結(jié)合 GO 0050662 氧 102 貴 州 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 化還原過(guò)程 GO 0055114 孢粉生物合成過(guò) 程 GO 0080110 KEGG富集分析發(fā)現(xiàn) UGT 73C4基因參與黃酮和黃酮化生物合成 K00944 ACT 2基因參與K00940 苯丙烷 生物合成 K00945 芪類 二芳基庚烷和姜 酚生物合成 K00941 類黃酮生物合成 MA16 Dca009088基因參與類胡蘿卜素生物 合成 K00906 2 5 差異表達(dá)基因qRT PCR熒光定量 選取特異參與到低溫條件下鐵皮石斛 多糖 生物堿 黃酮合成路徑中的6個(gè)重要 差異表達(dá)基因 5個(gè)上調(diào)基因 1個(gè)下調(diào)基 因 進(jìn)行qRT PCR分析驗(yàn)證 如圖6所示 MA16 Dca021921 RLK1 12倍 MA16 Dca 021379 TYDC2 11倍 MA16 Dca002818 GLC1 83倍 MA16 Dca008721 CYP93A1 8倍 MA16 Dca015800 BHLH4 21倍 5個(gè) 基因表達(dá)水平均顯著上調(diào) MA16 Dca 027206 CSLG3 201倍 下調(diào)表達(dá) 與轉(zhuǎn)錄組 分析結(jié)果一致 但在差異倍數(shù)上有差異 5 000 4 000 3 000 2 000 1 000 0 C T MA16 Dca021379 2 000 1 500 1 000 500 0 C T MA16 Dca008721 30 000 20 000 10 000 0 C T MA16 Dca002818 8 000 6 000 4 000 2 000 0 C T MA16 Dca015800 4 000 3 000 2 000 1 000 0 C T MA16 Dca021921 25 000 20 000 15 000 10 000 5 000 0 C T MA16 Dca027206 C T C T C T C T C T C T 圖 6 鐵皮石斛冷脅迫差異表達(dá)基因的qRT PCR驗(yàn)證 Fig 6 Verification of differential expression genes in D officinale under cold stress by qRT PCR 3 討論 鐵皮石斛在冷馴化過(guò)程通過(guò)激活高能 量需求的糖水解 氨基酸分解代謝和檸檬 酸循環(huán)等途徑提高鐵皮石斛的抗寒性 復(fù)雜 調(diào)控過(guò)程需要信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo) 逆境響應(yīng)相關(guān) 基因表達(dá)的啟動(dòng)以及抗逆相關(guān)代謝反應(yīng)的 誘發(fā)等基因大量表達(dá) 研究表明 低溫脅迫 下 鐵皮石斛的多糖 黃酮 生物堿等次生 代謝產(chǎn)物合成增加 鐵皮石斛多糖的組成 和調(diào)控十分復(fù)雜 本研究在鐵皮石斛低溫脅 迫下挖掘出參與多糖合成的基因家族有 UAM UGP RHM SPS CSLA和PGM GAPDH 分別參與了細(xì)胞壁多糖和糖蛋白 甘露糖 蔗糖 淀粉 纖維素 半纖維素以及其他寡 糖和葡萄糖基的生物合成 參與到多糖類的 合成代謝中 與佟巖等 11 的研究結(jié)果一致 另外 本研究還發(fā)現(xiàn)了CSLD GATL GLC GT CSLG GATL CSLE等基因家族參與鐵 1 期王小仲 等 低溫對(duì)鐵皮石斛活性成分合成影響機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究 103 皮石斛低溫脅迫下多糖合成的響應(yīng) 相關(guān)基 因的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究 黃酮類化合物在抵抗生物和非生物脅 迫的保護(hù)劑功能 吸引授粉者的視覺(jué)信號(hào) 以及植物激素活性的調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要 作用 本研究挖掘出黃酮類化合物合成路徑 上參與響應(yīng)的基因共53個(gè) 有UGT CYP CXE GT ACT BHLH等基因家族 顯示黃酮類可 能在鐵皮石斛低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮十 分重要的作用 植物家族1 UDP 糖基轉(zhuǎn)移 酶 UGTs 是植物中最大的GT家族 負(fù)責(zé)將 糖部分轉(zhuǎn)移到多種小分子上 并控制許多代 謝過(guò)程 但其在植物中的生理學(xué)意義是未知 的 LI等 12 13 研究揭示了UGT79B2和UGT 79B3擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因可被各種非生 物脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo) 包括冷 鹽和干旱脅迫 UGT79B2 B3的過(guò)量表達(dá)顯著增強(qiáng)植物對(duì)低 溫以及干旱和鹽脅迫的耐受性 而由RNAi RNA干擾 和CRISPR Cas9策略產(chǎn)生的UGT 79b2 b3雙突變體更易受不利條件的影響 UGT79B2和UGT79B3被鑒定為花青素鼠李 糖基轉(zhuǎn)移酶 受CBF1 CRT DRE結(jié)合因子1 也稱為DREB1B 調(diào)節(jié) 并通過(guò)調(diào)節(jié)花青素 積累賦予非生物脅迫耐受性 生物堿類化合物在抵御非生物脅迫下 發(fā)揮著重要作用 研究表明 鐵皮石斛低溫 脅迫下生物堿類代謝產(chǎn)物主要由TYDC SD RLK等基因家族共同調(diào)控 酪氨酸脫羧酶 TYDC 在植物中參與合成許多具有臨床藥 用價(jià)值的芐基異喹啉類生物堿 BIAs 位于 BIAs生物合成的初始位置 其在合成BIAs 過(guò)程中發(fā)揮重要作用 通過(guò)博落回轉(zhuǎn)錄組 數(shù)據(jù)篩選到1個(gè)博落回TYDC McTYDC2 候 選基因 其表達(dá)規(guī)律與博落回中BIAs代謝 規(guī)律相符 14 本研究共挖掘12個(gè)多糖 6個(gè)生物堿類 53個(gè)黃酮類合成路徑上的差異表達(dá)基因參 與了鐵皮石斛低溫脅迫的響應(yīng) 相關(guān)基因功 能和機(jī)制仍待進(jìn)一步研究 表明 轉(zhuǎn)錄組測(cè) 序是挖掘和揭示植物抗逆機(jī)制的有效手段 相關(guān)研究結(jié)果可為鐵皮石斛低溫脅迫相關(guān) 研究提供參考 4 結(jié)論 研究對(duì)2組生長(zhǎng)一致的鐵皮石斛鮮嫩葉 在低溫處理及常溫對(duì)照條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組 測(cè)序和分析 共得到71個(gè)差異表達(dá)基因參 與到鐵皮石斛低溫脅迫的響應(yīng)中 從而對(duì)鐵 皮石斛的品質(zhì)產(chǎn)生影響 其中黃酮類成分可 能發(fā)揮十分重要的作用 相關(guān)基因的功能和 機(jī)制有待進(jìn)一步研究 參考文獻(xiàn) References 殷維 黃曉聰 鐵皮石斛 中華九大仙草之首 J 中南藥學(xué) 用藥與健康 2017 3 8 13 YIN W HUANG X C Dendrobium officinale the leader of the 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