N T 5930-2025 番茄頂縮類病毒檢疫鑒定方法.pdf

ICS 65 020 20 CCS B 16 中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) SN T 5930 2025 2025 07 25發(fā)布 2026 02 01實(shí)施 番茄頂縮類病毒檢疫鑒定方法 Detection and identification of pospiviroid apicimpeditum 中華人民共和國(guó)海關(guān)總署 發(fā) 布 SN T 5930 2025 前 言 本文件按照 GB T 1 1 2020 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 1 部分 標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則 的規(guī)定 起草 請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利 本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任 本文件由中華人民共和國(guó)海關(guān)總署提出并歸口 本文件起草單位 中華人民共和國(guó)蘭州海關(guān) 中華人民共和國(guó)湛江海關(guān) 中華人民共和國(guó)大連海關(guān) 本文件主要起草人 文朝慧 王軍平 盧乃會(huì) 王溪橋 尤佳 李春雷 劉志業(yè) 王秀芬 SN T 5930 2025 番茄頂縮類病毒檢疫鑒定方法 1 范圍 本文件描述了番茄頂縮類病毒 RT PCR 和實(shí)時(shí)熒光 RT PCR 檢疫鑒定方法 本文件適用于番茄 辣椒等茄科植物材料 包括種子 種苗及其果實(shí)攜帶的番茄頂縮類病毒的檢疫 鑒定 2 規(guī)范性引用文件 下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款 其中 注日期的引用文件 僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件 不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改單 適用于本文件 SN T 2122 進(jìn)出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣方法 3 術(shù)語(yǔ)和定義 本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義 4 番茄頂縮類病毒基本信息 中文名 番茄頂縮類病毒 學(xué)名 Pospiviroid apicimpeditum 英文名 Tomato apical stunt viroid 縮寫(xiě) TASVd 分類地位 馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒科 Pospiviroidae 馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒屬 Pospiviroid 番茄頂縮類病毒的寄主范圍 傳播途徑 基因組特征等基本信息見(jiàn)附錄 A 5 方法原理 番茄頂縮類病毒基因組特征是檢測(cè)鑒定該類病毒的主要依據(jù) 采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) RT PCR 和實(shí)時(shí)熒光 RT PCR 方法特異性檢測(cè)鑒定該類病毒 6 儀器 設(shè)施 用具和試劑 6 1 儀器設(shè)備 實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀 PCR 儀 電子天平 電泳儀 凝膠成像系統(tǒng) 水浴鍋 冷凍離心機(jī) 80 超低溫冰 箱 高壓滅菌鍋 微波爐 漩渦振蕩器 研磨儀 移液器 6 2 試劑 植物總 RNA 提取試劑盒 一步法 RT PCR 檢測(cè)試劑盒 一步法實(shí)時(shí)熒光 RT PCR 檢測(cè)試劑盒 瓊脂 1 SN T 5930 2025 糖 樣品提取緩沖液等 分子生物學(xué)試劑配制按附錄 B 除有特殊說(shuō)明外 所有試驗(yàn)用試劑均為分析純 注 等效商品化試劑同等使用 7 抽樣和樣品制備 7 1 抽樣 抽樣按照 SN T 2122的規(guī)定執(zhí)行 7 2 制樣 7 2 1 種子類樣品 若樣品中存在畸形 不成熟的種子 則從中挑取出來(lái)單獨(dú)作為一個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè) 若無(wú)明顯異常 則 隨機(jī)取適量種子 研磨器研磨成粉后 按照 1 5 1 10 W V 加入抽提緩沖液 見(jiàn) B 1 2 混合均勻 3 000g 低速離心 5 min后取 100 L 上清液用于核酸檢測(cè) 或適量種子液氮研磨干粉后取 0 1 g提取 RNA 注 有特殊制樣要求如出口歐盟的茄科種子 按照要求制備待檢樣品 7 2 2 植株類樣品 對(duì)于有癥狀的種苗類樣品單獨(dú)檢測(cè) 重點(diǎn)選取表現(xiàn)癥狀的幼嫩葉片 無(wú)癥狀樣品至少選取 20株的幼 嫩葉片進(jìn)行混樣檢測(cè) 樣品研磨后按照 1 5 1 10 W V 加入提取緩沖液混合均勻 制備的汁液分別盛 裝于 1 5 mL 離心管中 3 000g 低速離心 5 min后吸取上清液用于核酸檢測(cè) 或直接將葉片或果實(shí)等進(jìn)行 研磨 取約 0 1 g樣品提取 RNA 8 檢測(cè) 8 1 RT PCR檢測(cè) 取 7 2中制備的樣品 提取總 RNA 或總核酸 然后進(jìn)行 RT PCR 檢測(cè) 并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照 陰性對(duì)照 空白對(duì)照 具體檢測(cè)步驟見(jiàn)附錄 B 8 2 實(shí)時(shí)熒光RT PCR檢測(cè) 取 7 2 中制備的樣品 提取總 RNA 或總核酸 然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 RT PCR 檢測(cè) 并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照 陰性對(duì)照 空白對(duì)照 具體檢測(cè)步驟按附錄 C 9 結(jié)果判定 樣品經(jīng) RT PCR 檢測(cè)或?qū)崟r(shí)熒光 RT PCR 檢測(cè)為陰性 判定該樣品不攜帶目標(biāo)類病毒 樣品經(jīng) RT PCR和實(shí)時(shí)熒光 RT PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性 或經(jīng) RT PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性且序列測(cè)定比對(duì)結(jié)果 與目標(biāo)類病毒具有高度同源性時(shí) 判定該樣品攜帶 TASVd 必要時(shí) 可通過(guò)生物接種等方法進(jìn)一步鑒定 10 樣品與記錄結(jié)果保存 10 1 樣品保存 對(duì)檢出 TASVd 的樣品應(yīng)妥善保存 以備復(fù)核 如涉及到貿(mào)易糾紛則應(yīng)保存到糾紛解決完畢 該類 2 SN T 5930 2025 樣品保存期滿后須經(jīng)高壓滅菌后方可處理 10 2 記錄結(jié)果保存 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存完整的試驗(yàn)記錄及相關(guān)結(jié)果圖片 3 SN T 5930 2025 附 錄 A 資料性 番茄頂縮類病毒基本信息 A 1 寄主范圍 TASVd寄主有番茄 Solanum lycopersicum 辣椒 Capsicum annuum 扭管花 Streptosolen jameso nii 素馨葉白英 Solanum laxum 藍(lán)花茄 Lycianthes rantonnetii 夜香樹(shù)屬 Cestrum sp 和曼陀羅木屬 Brugmansia sp 等植物 A 2 為害癥狀 TASVd在番茄上的癥狀包括葉片卷曲 植株頂端發(fā)育不良 嚴(yán)重矮化 產(chǎn)生壞死病斑 葉片畸形 葉 脈黃化 變脆 果實(shí)變小等 圖A 1 受TASVd侵染的觀賞植物不表現(xiàn)癥狀 圖A 1 TASVd侵染番茄的癥狀 引自https gb eppo int A 3 地理分布 歐洲 比利時(shí) 克羅地亞 德國(guó) 意大利 荷蘭 波蘭 斯洛文尼亞 非洲 科特迪瓦 加納 塞內(nèi)加爾 突尼斯 亞洲 印度尼西亞 以色列 A 4 傳播方式 TASVd易通過(guò)機(jī)械接種傳播 能通過(guò)種子 花粉 熊蜂 Bombus terrestris 傳播 Antignus 2007 等報(bào) 道在番茄 品種Hazera 189 中種傳率高達(dá)80 A 5 基因組特性 TASVd為單鏈環(huán)狀RNA 大小為360 nts 364 nts 推測(cè)具有廣泛堿基配對(duì)特征的棒狀結(jié)構(gòu) 圖A 2 圖A 2 TASVd核苷酸序列及其二級(jí)結(jié)構(gòu) 引自Kiefer et al 1983 4 SN T 5930 2025 附 錄 B 規(guī)范性 RT PCR檢測(cè) B 1 試劑 B 1 1 10 PBST緩沖液 pH 7 4 氯化鈉 NaCl 80 0 g 磷酸氫二鈉 Na 2 HPO 4 11 5 g 磷酸二氫鉀 KH 2 PO 4 2 0 g 氯化鉀 KCl 2 0 g 吐溫 20 Tween 20 5 mL 加入900 mL水溶解 用氫氧化鈉 NaOH 或鹽酸 HCl 調(diào)節(jié)pH至7 4 然后補(bǔ) 水至1 L 注 也能購(gòu)買配制好的濃縮液或干粉制劑 稀釋使用 B 1 2 樣品抽提緩沖液 pH 7 4 10 PBST 100 mL 亞硫酸鈉 Na 2 SO 3 1 3 g 聚乙烯吡咯烷酮 PVP MW24 000 40 000 20 0 g 加入800 mL水溶解 用氫氧化鈉 NaOH 或鹽酸 HCl 調(diào)節(jié)pH至7 4 然后補(bǔ)水至1 L 4 儲(chǔ)存 注 也能購(gòu)買配制好的濃縮液或干粉制劑 稀釋使用 B 1 3 核酸提取試劑 Trizol裂解液 三氯甲烷 異丙醇 75 乙醇或直接購(gòu)買商品化核酸提取試劑盒 B 1 4 RT PCR檢測(cè)試劑 一步法RT PCR檢測(cè)試劑盒 B 1 5 電泳緩沖液TAE 50 三羥甲基氨基甲烷 Tris 242 g 冰醋酸 C 2 H 4 O 2 52 1 mL 乙二胺四乙酸二鈉 Na 2 EDTA 2H 2 O 37 2 g 加水定容至 1 L 使用時(shí)加水稀釋至1 TAE 注 也能購(gòu)買配制好的濃縮液或干粉制劑 稀釋使用 B 1 6 引物序列 RT PCR檢測(cè)引物見(jiàn)表B 1 表 B 1 一步法 RT PCR 檢測(cè)引物 引物名稱 上游引物TASVd FOB 下游引物TASVd ROB 引物序列 5 3 GCTTCTCTCTGGAGACTACCCGGT TCCGGGCGAGGGCCGAAGACCT 片段大小 364 bp 5 SN T 5930 2025 B 2 試驗(yàn)步驟 B 2 1 總RNA提取 使用Trizol法提取總RNA 取7 2中制備的樣品上清液100 L或0 1 g粉末移入滅菌的1 5 mL離心 管中 加入1 mL Trizol試劑 劇烈振蕩搖勻3 min 4 12 000g離心10 min 取上清液 加入0 2 mL三氯 甲烷 上下顛倒混勻 室溫靜置3 min 4 12 000g離心10 min 取上層水相 加等體積的異丙醇 顛倒混 勻 4 12 000g離心10 min 棄上清液 加75 的乙醇洗滌沉淀 4 7 500g離心2 min 棄乙醇 沉淀于 室溫下充分干燥后 溶于30 L無(wú)Rnase水中 20 保存?zhèn)溆?注 也能用其他核酸提取方法或商品化核酸提取試劑盒 B 2 2 RT PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系見(jiàn)表 B 2 使用其他RT PCR試劑 并參考所用試劑說(shuō)明書(shū)確定各組分實(shí)際用量 根據(jù)試 驗(yàn)需要 調(diào)整反應(yīng)體積 各組分用量做相應(yīng)調(diào)整 推薦反應(yīng)參數(shù)為50 30 min 98 2 min 98 20 s 60 20 s 72 30 s 35個(gè)循環(huán) 72 7 min 注 也能使用其他一步法 RT PCR 試劑 或兩步法 RT PCR 試劑 并調(diào)整相應(yīng)反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù) 表 B 2 RT PCR 反應(yīng)體系 名稱 RNase Free ddH 2 O 2 1 step buffer 上游引物 下游引物 酶 RNA模板 總體積 工作液濃度 10 mol L 10 mol L 加樣量 L 6 5 12 5 1 0 1 0 1 0 3 0 25 B 2 3 瓊脂糖凝膠電泳 用1 TAE電泳緩沖液配制2 0 的瓊脂糖凝膠 加入GoldView核酸凝膠染料至終濃度為0 1 L mL 也可在電泳后進(jìn)行染色 將RT PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液按比例混合均勻 加入置于1 TAE緩沖液的 瓊脂糖凝膠的加樣孔中 以6 V cm 7 V cm電場(chǎng)強(qiáng)度進(jìn)行電泳30 min 40 min 電泳結(jié)束后 凝膠成像 系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果 拍照并記錄結(jié)果 注 也能采用其他核酸染料或其他電泳方式 B 3 結(jié)果判定 陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增 陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶下 結(jié)果判定如下 檢測(cè)樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶 判定RT PCR檢測(cè)結(jié)果陰性 檢測(cè)樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶 判定RT PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性 6 SN T 5930 2025 附 錄 C 規(guī)范性 實(shí)時(shí)熒光RT PCR檢測(cè) C 1 試劑 RNA提取試劑見(jiàn)B 1 3 Taq Man One Step RT PCR檢測(cè)試劑 C 2 引物和探針 實(shí)時(shí)熒光RT PCR檢測(cè)用引物探針信息見(jiàn)表C 1 表 C 1 實(shí)時(shí)熒光 RT PCR 引物和探針 名稱 TASVd F2 TASVd R2 TASVd P2 注 根據(jù)需要標(biāo)記其他熒光染料 序列 5 3 CKGGTTTCCWTCCTCTCGC CGGGTAGTCTCCAGAGAGAAG FAM TCTTCGGCCCTCGCCCGR BHQ1 C 3 試驗(yàn)步驟 C 3 1 核酸提取 核酸提取方法按B 2 C 3 2 實(shí)時(shí)熒光RT PCR 反應(yīng)體系見(jiàn)表C 2 各組分實(shí)際用量按照所用試劑說(shuō)明書(shū)確定 根據(jù)試驗(yàn)需要 調(diào)整反應(yīng)體積 包 括總體積 各組分用量做相應(yīng)調(diào)整 表 C 2 Taq Man 實(shí)時(shí)熒光 RT PCR 反應(yīng)體系 RNase Free ddH 2 O 實(shí)時(shí)熒光RT PCR反應(yīng)液 引物TASVd F2 引物TASVd R2 探針TASVd P2 酶預(yù)混液 Taq HS 2 10 mol L 10 mol L 10 mol L 5 U L 4 6 10 0 6 0 6 0 4 0 4 0 4 試劑 工作濃度 體積 L 7 SN T 5930 2025 RNA模板 總體積 3 20 表 C 2 Taq man 實(shí)時(shí)熒光 RT PCR 反應(yīng)體系 續(xù) 試劑 工作濃度 體積 L 反應(yīng)條件 42 15 min 95 變性3 min 95 變性10 s 60 退火延伸60 s 40個(gè)循環(huán) 注 1 本反應(yīng)條件在 ROCHE LightCycler480 型熒光 PCR 儀上成功運(yùn)行 根據(jù)使用的試劑 儀器類型調(diào)整相應(yīng)的反 應(yīng)參數(shù) 注 2 也能選擇兩步法實(shí)時(shí)熒光 RT PCR 檢測(cè)試劑 并調(diào)整相應(yīng)反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù) C 4 結(jié)果判定 在陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線 陽(yáng)性對(duì)照有明顯指數(shù)擴(kuò)增情況下 結(jié)果判定如下 若待檢樣品出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線 且Ct值小于35 判定檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性 若待檢樣品未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線 判定檢測(cè)結(jié)果陰性 若待檢樣品出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線 但Ct值大于或等于35 應(yīng)重新檢測(cè) 8 SN T 5930 2025 參 考 文 獻(xiàn) 1 Antignus Y Lachman O Pearlsman M The spread of Tomato apical stunt viroid TASVd in greenhouse tomato crops is associated with seed transmission and bumble bee activity J Plant Disease 2007 91 1 47 50 2 Batuman O ift i C Osei MK et al Rasta disease of tomato in Ghana is caused by the pospivi roids Potato spindle tuber viroid and Tomato apical stunt viroid J Plant Disease 2019 103 7 1525 1535 3 ISHI Veg International Seed Federation Method for detection of pospiviroids on tomato seed EB OL https worldseed org wp content uploads 2018 02 Pospiviroids tomato Feb2018 pdf 4 Kiefer MC Owens RA Diener TO Structural similarities between viroids and transposable genet ic elements J Proceedings of the National Academy of Sciences 1983 80 20 6234 6238 5 Matsushita Y Tsuda S Host ranges of Potato spindle tuber viroid Tomato chlorotic dwarf viroid Tomato apical stunt viroid and Columnea latent viroid in horticultural plants J European Journal of Plant Pathology 2015 141 1 193 197 6 Monger W Tomlinson J Boonham N et al Development and inter laboratory evaluation of real time PCR assays for the detection of pospiviroids J Journal of Virological Methods 2010 169 1 207 210 7 Verhoeven JTJ Botermans M Meekes ETM et al Tomato apical stunt viroid in the Nether lands most prevalent pospiviroid in ornamentals and first outbreak in tomatoes J European Journal of Plant Pathology 2012 133 4 803 810 8 Walter B Tomato apical stunt M In The Viroids New York 1987 USA Plenum Press 321 327 9 Walter B Thouvenel JC Fauquet C Les viroses del la Tomate en C te d Ivoire J Annales de Phytopathologie 1980 12 3 259 275 9