N T 5930-2025 番茄頂縮類病毒檢疫鑒定方法.pdf

ICS 65 020 20 CCS B 16 中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準 SN T 5930 2025 2025 07 25發(fā)布 2026 02 01實施 番茄頂縮類病毒檢疫鑒定方法 Detection and identification of pospiviroid apicimpeditum 中華人民共和國海關總署 發(fā) 布 SN T 5930 2025 前 言 本文件按照 GB T 1 1 2020 標準化工作導則 第 1 部分 標準化文件的結構和起草規(guī)則 的規(guī)定 起草 請注意本文件的某些內容可能涉及專利 本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任 本文件由中華人民共和國海關總署提出并歸口 本文件起草單位 中華人民共和國蘭州海關 中華人民共和國湛江海關 中華人民共和國大連海關 本文件主要起草人 文朝慧 王軍平 盧乃會 王溪橋 尤佳 李春雷 劉志業(yè) 王秀芬 SN T 5930 2025 番茄頂縮類病毒檢疫鑒定方法 1 范圍 本文件描述了番茄頂縮類病毒 RT PCR 和實時熒光 RT PCR 檢疫鑒定方法 本文件適用于番茄 辣椒等茄科植物材料 包括種子 種苗及其果實攜帶的番茄頂縮類病毒的檢疫 鑒定 2 規(guī)范性引用文件 下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款 其中 注日期的引用文件 僅該日期對應的版本適用于本文件 不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改單 適用于本文件 SN T 2122 進出境植物及植物產品檢疫抽樣方法 3 術語和定義 本文件沒有需要界定的術語和定義 4 番茄頂縮類病毒基本信息 中文名 番茄頂縮類病毒 學名 Pospiviroid apicimpeditum 英文名 Tomato apical stunt viroid 縮寫 TASVd 分類地位 馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒科 Pospiviroidae 馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒屬 Pospiviroid 番茄頂縮類病毒的寄主范圍 傳播途徑 基因組特征等基本信息見附錄 A 5 方法原理 番茄頂縮類病毒基因組特征是檢測鑒定該類病毒的主要依據 采用反轉錄聚合酶鏈式反應 RT PCR 和實時熒光 RT PCR 方法特異性檢測鑒定該類病毒 6 儀器 設施 用具和試劑 6 1 儀器設備 實時熒光 PCR 儀 PCR 儀 電子天平 電泳儀 凝膠成像系統(tǒng) 水浴鍋 冷凍離心機 80 超低溫冰 箱 高壓滅菌鍋 微波爐 漩渦振蕩器 研磨儀 移液器 6 2 試劑 植物總 RNA 提取試劑盒 一步法 RT PCR 檢測試劑盒 一步法實時熒光 RT PCR 檢測試劑盒 瓊脂 1 SN T 5930 2025 糖 樣品提取緩沖液等 分子生物學試劑配制按附錄 B 除有特殊說明外 所有試驗用試劑均為分析純 注 等效商品化試劑同等使用 7 抽樣和樣品制備 7 1 抽樣 抽樣按照 SN T 2122的規(guī)定執(zhí)行 7 2 制樣 7 2 1 種子類樣品 若樣品中存在畸形 不成熟的種子 則從中挑取出來單獨作為一個樣品進行檢測 若無明顯異常 則 隨機取適量種子 研磨器研磨成粉后 按照 1 5 1 10 W V 加入抽提緩沖液 見 B 1 2 混合均勻 3 000g 低速離心 5 min后取 100 L 上清液用于核酸檢測 或適量種子液氮研磨干粉后取 0 1 g提取 RNA 注 有特殊制樣要求如出口歐盟的茄科種子 按照要求制備待檢樣品 7 2 2 植株類樣品 對于有癥狀的種苗類樣品單獨檢測 重點選取表現癥狀的幼嫩葉片 無癥狀樣品至少選取 20株的幼 嫩葉片進行混樣檢測 樣品研磨后按照 1 5 1 10 W V 加入提取緩沖液混合均勻 制備的汁液分別盛 裝于 1 5 mL 離心管中 3 000g 低速離心 5 min后吸取上清液用于核酸檢測 或直接將葉片或果實等進行 研磨 取約 0 1 g樣品提取 RNA 8 檢測 8 1 RT PCR檢測 取 7 2中制備的樣品 提取總 RNA 或總核酸 然后進行 RT PCR 檢測 并設置陽性對照 陰性對照 空白對照 具體檢測步驟見附錄 B 8 2 實時熒光RT PCR檢測 取 7 2 中制備的樣品 提取總 RNA 或總核酸 然后進行實時熒光 RT PCR 檢測 并設置陽性對照 陰性對照 空白對照 具體檢測步驟按附錄 C 9 結果判定 樣品經 RT PCR 檢測或實時熒光 RT PCR 檢測為陰性 判定該樣品不攜帶目標類病毒 樣品經 RT PCR和實時熒光 RT PCR檢測均為陽性 或經 RT PCR檢測呈陽性且序列測定比對結果 與目標類病毒具有高度同源性時 判定該樣品攜帶 TASVd 必要時 可通過生物接種等方法進一步鑒定 10 樣品與記錄結果保存 10 1 樣品保存 對檢出 TASVd 的樣品應妥善保存 以備復核 如涉及到貿易糾紛則應保存到糾紛解決完畢 該類 2 SN T 5930 2025 樣品保存期滿后須經高壓滅菌后方可處理 10 2 記錄結果保存 實驗室應保存完整的試驗記錄及相關結果圖片 3 SN T 5930 2025 附 錄 A 資料性 番茄頂縮類病毒基本信息 A 1 寄主范圍 TASVd寄主有番茄 Solanum lycopersicum 辣椒 Capsicum annuum 扭管花 Streptosolen jameso nii 素馨葉白英 Solanum laxum 藍花茄 Lycianthes rantonnetii 夜香樹屬 Cestrum sp 和曼陀羅木屬 Brugmansia sp 等植物 A 2 為害癥狀 TASVd在番茄上的癥狀包括葉片卷曲 植株頂端發(fā)育不良 嚴重矮化 產生壞死病斑 葉片畸形 葉 脈黃化 變脆 果實變小等 圖A 1 受TASVd侵染的觀賞植物不表現癥狀 圖A 1 TASVd侵染番茄的癥狀 引自https gb eppo int A 3 地理分布 歐洲 比利時 克羅地亞 德國 意大利 荷蘭 波蘭 斯洛文尼亞 非洲 科特迪瓦 加納 塞內加爾 突尼斯 亞洲 印度尼西亞 以色列 A 4 傳播方式 TASVd易通過機械接種傳播 能通過種子 花粉 熊蜂 Bombus terrestris 傳播 Antignus 2007 等報 道在番茄 品種Hazera 189 中種傳率高達80 A 5 基因組特性 TASVd為單鏈環(huán)狀RNA 大小為360 nts 364 nts 推測具有廣泛堿基配對特征的棒狀結構 圖A 2 圖A 2 TASVd核苷酸序列及其二級結構 引自Kiefer et al 1983 4 SN T 5930 2025 附 錄 B 規(guī)范性 RT PCR檢測 B 1 試劑 B 1 1 10 PBST緩沖液 pH 7 4 氯化鈉 NaCl 80 0 g 磷酸氫二鈉 Na 2 HPO 4 11 5 g 磷酸二氫鉀 KH 2 PO 4 2 0 g 氯化鉀 KCl 2 0 g 吐溫 20 Tween 20 5 mL 加入900 mL水溶解 用氫氧化鈉 NaOH 或鹽酸 HCl 調節(jié)pH至7 4 然后補 水至1 L 注 也能購買配制好的濃縮液或干粉制劑 稀釋使用 B 1 2 樣品抽提緩沖液 pH 7 4 10 PBST 100 mL 亞硫酸鈉 Na 2 SO 3 1 3 g 聚乙烯吡咯烷酮 PVP MW24 000 40 000 20 0 g 加入800 mL水溶解 用氫氧化鈉 NaOH 或鹽酸 HCl 調節(jié)pH至7 4 然后補水至1 L 4 儲存 注 也能購買配制好的濃縮液或干粉制劑 稀釋使用 B 1 3 核酸提取試劑 Trizol裂解液 三氯甲烷 異丙醇 75 乙醇或直接購買商品化核酸提取試劑盒 B 1 4 RT PCR檢測試劑 一步法RT PCR檢測試劑盒 B 1 5 電泳緩沖液TAE 50 三羥甲基氨基甲烷 Tris 242 g 冰醋酸 C 2 H 4 O 2 52 1 mL 乙二胺四乙酸二鈉 Na 2 EDTA 2H 2 O 37 2 g 加水定容至 1 L 使用時加水稀釋至1 TAE 注 也能購買配制好的濃縮液或干粉制劑 稀釋使用 B 1 6 引物序列 RT PCR檢測引物見表B 1 表 B 1 一步法 RT PCR 檢測引物 引物名稱 上游引物TASVd FOB 下游引物TASVd ROB 引物序列 5 3 GCTTCTCTCTGGAGACTACCCGGT TCCGGGCGAGGGCCGAAGACCT 片段大小 364 bp 5 SN T 5930 2025 B 2 試驗步驟 B 2 1 總RNA提取 使用Trizol法提取總RNA 取7 2中制備的樣品上清液100 L或0 1 g粉末移入滅菌的1 5 mL離心 管中 加入1 mL Trizol試劑 劇烈振蕩搖勻3 min 4 12 000g離心10 min 取上清液 加入0 2 mL三氯 甲烷 上下顛倒混勻 室溫靜置3 min 4 12 000g離心10 min 取上層水相 加等體積的異丙醇 顛倒混 勻 4 12 000g離心10 min 棄上清液 加75 的乙醇洗滌沉淀 4 7 500g離心2 min 棄乙醇 沉淀于 室溫下充分干燥后 溶于30 L無Rnase水中 20 保存?zhèn)溆?注 也能用其他核酸提取方法或商品化核酸提取試劑盒 B 2 2 RT PCR擴增 反應體系見表 B 2 使用其他RT PCR試劑 并參考所用試劑說明書確定各組分實際用量 根據試 驗需要 調整反應體積 各組分用量做相應調整 推薦反應參數為50 30 min 98 2 min 98 20 s 60 20 s 72 30 s 35個循環(huán) 72 7 min 注 也能使用其他一步法 RT PCR 試劑 或兩步法 RT PCR 試劑 并調整相應反應體系及反應參數 表 B 2 RT PCR 反應體系 名稱 RNase Free ddH 2 O 2 1 step buffer 上游引物 下游引物 酶 RNA模板 總體積 工作液濃度 10 mol L 10 mol L 加樣量 L 6 5 12 5 1 0 1 0 1 0 3 0 25 B 2 3 瓊脂糖凝膠電泳 用1 TAE電泳緩沖液配制2 0 的瓊脂糖凝膠 加入GoldView核酸凝膠染料至終濃度為0 1 L mL 也可在電泳后進行染色 將RT PCR產物與上樣緩沖液按比例混合均勻 加入置于1 TAE緩沖液的 瓊脂糖凝膠的加樣孔中 以6 V cm 7 V cm電場強度進行電泳30 min 40 min 電泳結束后 凝膠成像 系統(tǒng)中觀察電泳結果 拍照并記錄結果 注 也能采用其他核酸染料或其他電泳方式 B 3 結果判定 陰性對照和空白對照無特異性擴增 陽性對照出現預期大小的條帶下 結果判定如下 檢測樣品未出現預期大小的條帶 判定RT PCR檢測結果陰性 檢測樣品出現預期大小的條帶 判定RT PCR檢測結果陽性 6 SN T 5930 2025 附 錄 C 規(guī)范性 實時熒光RT PCR檢測 C 1 試劑 RNA提取試劑見B 1 3 Taq Man One Step RT PCR檢測試劑 C 2 引物和探針 實時熒光RT PCR檢測用引物探針信息見表C 1 表 C 1 實時熒光 RT PCR 引物和探針 名稱 TASVd F2 TASVd R2 TASVd P2 注 根據需要標記其他熒光染料 序列 5 3 CKGGTTTCCWTCCTCTCGC CGGGTAGTCTCCAGAGAGAAG FAM TCTTCGGCCCTCGCCCGR BHQ1 C 3 試驗步驟 C 3 1 核酸提取 核酸提取方法按B 2 C 3 2 實時熒光RT PCR 反應體系見表C 2 各組分實際用量按照所用試劑說明書確定 根據試驗需要 調整反應體積 包 括總體積 各組分用量做相應調整 表 C 2 Taq Man 實時熒光 RT PCR 反應體系 RNase Free ddH 2 O 實時熒光RT PCR反應液 引物TASVd F2 引物TASVd R2 探針TASVd P2 酶預混液 Taq HS 2 10 mol L 10 mol L 10 mol L 5 U L 4 6 10 0 6 0 6 0 4 0 4 0 4 試劑 工作濃度 體積 L 7 SN T 5930 2025 RNA模板 總體積 3 20 表 C 2 Taq man 實時熒光 RT PCR 反應體系 續(xù) 試劑 工作濃度 體積 L 反應條件 42 15 min 95 變性3 min 95 變性10 s 60 退火延伸60 s 40個循環(huán) 注 1 本反應條件在 ROCHE LightCycler480 型熒光 PCR 儀上成功運行 根據使用的試劑 儀器類型調整相應的反 應參數 注 2 也能選擇兩步法實時熒光 RT PCR 檢測試劑 并調整相應反應體系及反應參數 C 4 結果判定 在陰性對照和空白對照無擴增曲線 陽性對照有明顯指數擴增情況下 結果判定如下 若待檢樣品出現明顯的擴增曲線 且Ct值小于35 判定檢測結果陽性 若待檢樣品未出現擴增曲線 判定檢測結果陰性 若待檢樣品出現明顯的擴增曲線 但Ct值大于或等于35 應重新檢測 8 SN T 5930 2025 參 考 文 獻 1 Antignus Y Lachman O Pearlsman M The spread of Tomato apical stunt viroid TASVd in greenhouse tomato crops is associated with seed transmission and bumble bee activity J Plant Disease 2007 91 1 47 50 2 Batuman O ift i C Osei MK et al Rasta disease of tomato in Ghana is caused by the pospivi roids Potato spindle tuber viroid and Tomato apical stunt viroid J Plant Disease 2019 103 7 1525 1535 3 ISHI Veg International Seed Federation Method for detection of pospiviroids on tomato seed EB OL https worldseed org wp content uploads 2018 02 Pospiviroids tomato Feb2018 pdf 4 Kiefer MC Owens RA Diener TO Structural similarities between viroids and transposable genet ic elements J Proceedings of the National Academy of Sciences 1983 80 20 6234 6238 5 Matsushita Y Tsuda S Host ranges of Potato spindle tuber viroid Tomato chlorotic dwarf viroid Tomato apical stunt viroid and Columnea latent viroid in horticultural plants J European Journal of Plant Pathology 2015 141 1 193 197 6 Monger W Tomlinson J Boonham N et al Development and inter laboratory evaluation of real time PCR assays for the detection of pospiviroids J Journal of Virological Methods 2010 169 1 207 210 7 Verhoeven JTJ Botermans M Meekes ETM et al Tomato apical stunt viroid in the Nether lands most prevalent pospiviroid in ornamentals and first outbreak in tomatoes J European Journal of Plant Pathology 2012 133 4 803 810 8 Walter B Tomato apical stunt M In The Viroids New York 1987 USA Plenum Press 321 327 9 Walter B Thouvenel JC Fauquet C Les viroses del la Tomate en C te d Ivoire J Annales de Phytopathologie 1980 12 3 259 275 9