抑制鳶尾果枯病生防細(xì)菌的篩選及條件優(yōu)化.pdf

北 方 園 藝 2 0 2 4 2 3 6 6 7 2 N o r t h e r n H o r t i c u l t u r e 園林花卉 第一作者簡介 朱桐 1 9 9 4 女 碩士研究生 研究方向 為植物病害及生物防治 E m a i l z h u t o n g 0 8 0 3 1 2 6 c o m 責(zé)任作者 刁桂萍 1 9 8 1 女 博士 副教授 現(xiàn)主要從事 植物病害及生物防治等研究工作 E m a i l d p g 2 0 0 3 1 2 6 c o m 基金項(xiàng)目 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目 2 5 7 2 0 2 2 D S 0 7 收稿日期 2 0 2 4 0 5 1 1 d o i 1 0 1 1 9 3 7 b f y y 2 0 2 4 1 9 7 4 朱桐 王宇曦 逯昕明 劉雪峰 王斌 刁桂萍 抑制鳶尾果枯病生防細(xì)菌的篩選及條件優(yōu)化 J 北方園藝 2 0 2 4 2 3 6 6 7 2 抑制鳶尾果枯病生防細(xì)菌的篩選及條件優(yōu)化 朱 桐1 王宇曦1 逯昕明2 劉雪峰1 王 斌3 刁桂萍1 1 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 黑龍江哈爾濱1 5 0 0 4 0 2 黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所 黑龍江哈爾濱1 5 0 0 4 0 3 鄂爾多斯市林業(yè)和草原事業(yè)發(fā)展中心 內(nèi)蒙古鄂爾多斯0 1 7 0 0 0 摘 要 以鳶尾果枯病 Irissanguinef r u i t b l i g h t 病原菌交鏈格孢菌 Alternaria alternata 和幾種植物內(nèi)生細(xì)菌為試材 采用平板對(duì)峙法與單因素試驗(yàn)法 研究了不同內(nèi)生 細(xì)菌對(duì)A alternata的抑制作用以及所篩選出的高效生防細(xì)菌在不同培養(yǎng)條件下的抑菌能 力與穩(wěn)定性 以期為鳶尾果枯病及相關(guān)病害的防治和生防菌劑的開發(fā)提供參考依據(jù) 結(jié)果 表明 枯草芽胞桿菌 Bacillussubtilis 和貝萊斯芽孢桿菌 B velezensis 對(duì)A alternata具 有較強(qiáng)的抑制力 二者最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為在p H 5的L B液體培養(yǎng)基中裝入5 的 種子液 置于3 0 1 8 0 r m i n 1條件下培養(yǎng)1 6 h B subtilis的酸堿 熱 紫外線照射和光 照穩(wěn)定性較好 B velezensis除熱穩(wěn)定性較高外 其他處理下抑菌效果均下降 關(guān)鍵詞 鏈格孢 芽孢桿菌 生防菌 中圖分類號(hào) S 4 3 6 8 S 4 7 6 7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1 0 0 1 0 0 0 9 2 0 2 4 2 3 0 0 6 6 0 7 鳶尾 Irissanguine 花型優(yōu)美 寓意豐富 是 我國園林造景中廣泛栽培的景觀植物之一 植株 部分提取物還可入藥 具有極高的應(yīng)用價(jià)值 1 互隔交鏈格孢菌 A alternata 是一種常見的潛 伏侵染真菌 2 引起的鳶尾果枯病 Irissanguine f r u i t b l i g h t 導(dǎo)致鳶尾果實(shí)表面出現(xiàn)不規(guī)則病斑 最終造成果實(shí)枯萎和壞死 在前期的調(diào)查中發(fā)現(xiàn) 鳶尾果枯病的野外發(fā)病率高達(dá)6 0 嚴(yán)重影響到 鳶尾的觀賞價(jià)值和對(duì)鳶尾果的利用 芽孢桿菌類 Bacilluss p p 微生物分布廣 泛 對(duì)環(huán)境友好 許多菌株被作為生物源農(nóng)藥開發(fā) 利用 3 枯草芽胞桿菌 B subtilis 和貝萊斯芽 孢桿菌 B velezensis 是2種典型的生防細(xì)菌 具 有安全 繁殖快 抗逆性強(qiáng)和易分離培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn) 在促進(jìn)作物生長 產(chǎn)生植物激素 提高植物免疫 力 形成根際生物膜和修復(fù)污染土壤等方面發(fā)揮 重要作用 4 5 B subtilis可顯著降低番茄細(xì)菌性 枯萎病發(fā)病率 還能長期穩(wěn)定的定殖于番茄植株 的根際土壤和組織中 改變與病原物相互作用的 微生物群落 6 鄭世仲等 7 發(fā)現(xiàn)茶樹的內(nèi)生 B subtilis對(duì)茶樹炭疽病病原膠孢炭疽菌 Colle totrichumgloeosporioides 的抑制率達(dá)6 1 6 且發(fā)酵粗提液也具有較好的抑菌作用 B velezensis可產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶來降解病原菌細(xì) 胞壁并導(dǎo)致菌絲變形 從而抑制病原菌的正常生 長 可作為柞樹葉枯病的高效生防菌 8 王飛等 9 研究發(fā)現(xiàn)B velezensis對(duì)丹參根腐病菌層出 腐 皮和尖孢鐮刀菌的抑菌率分別為6 5 5 4 6 8 2 8 和6 6 8 7 接種B velezensis后 丹參 莖葉和根系鮮質(zhì)量較無菌水對(duì)照均有顯著提升 生防菌的發(fā)酵條件是影響生防菌抑菌能力的 重要因素 除菌株自身的拮抗性能外 培養(yǎng)基營養(yǎng) 組成 p H 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等條件也決定著 生防菌活菌量及其抑菌物質(zhì)活性和產(chǎn)量 因此針 對(duì)特定菌株優(yōu)化其發(fā)酵條件非常重要 生防菌有 直接制成活菌制劑使用和提取抑菌活性物質(zhì)深加 工2種途徑 抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性是菌劑制備 和生產(chǎn)的考慮因素之一 抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性 高不僅有利于工業(yè)化的大量生產(chǎn) 也能保證在田 間施用時(shí)達(dá)到良好的防治效果 綜上 明確最佳 發(fā)酵條件與抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性是提高菌株產(chǎn)量和 降低發(fā)酵成本的重要工作環(huán)節(jié) 1 0 1 3 目前對(duì)鏈格孢屬病害的防治還是依賴于化學(xué) 藥劑 尋找綠色安全高效的生防菌與開發(fā)生防菌 劑十分重要 此前 安久春等 1 0 利用帕勒隆尼氏 假單胞菌 Pseudomonaspalleroniana 的M S M 培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)互隔交鏈格孢 A alternata 進(jìn)行試驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)抑制率為3 7 3 7 孫琰 1 4 研究發(fā) 現(xiàn)庫德里亞夫畢赤酵母菌 Pichiakudriavzevii 對(duì)細(xì)極鏈格孢菌 A tenuissma 與云南鐵杉鏈格 孢菌 A dumosa 具有良好的室內(nèi)防治效果 方 圓 1 5 研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉 Trichodermaharzia num 和俄羅斯木霉 T rossicum 對(duì)鏈格孢的抑 制率可達(dá)到7 8 1 7 和9 1 5 3 該研究采用平 板對(duì)峙法明確了枯草芽胞桿菌和貝萊斯芽孢桿菌 對(duì)分離自鳶尾果枯病的互隔交鏈格孢菌的拮抗作 用 并對(duì)2種生防菌的最佳液體培養(yǎng)基組分 最佳 抑菌條件和抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行探究 以 期為鳶尾果枯病的合理防治以及開發(fā)相關(guān)生防菌 劑提供參考依據(jù) 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料 1 1 1 供試菌種 鳶尾果枯病病原菌互隔交鏈格孢菌 Y W 0 0 7 6 從鳶尾果分離出的細(xì)菌Y W 0 0 3 2 Y W 0 0 4 1 從核桃楸葉片分離的細(xì)菌K 1 2 K 2 2 K 2 3 K 4 1 S F 0 5 均保存于東北林業(yè)大學(xué)森林保 護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi) 1 1 2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 P D A 牛肉膏蛋白 胨培養(yǎng)基 B P M 和肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基 L B 1 2 試驗(yàn)方法 1 2 1 拮抗菌分離和發(fā)酵液制備 采用平板劃線法分離細(xì)菌后接種至B P M培 養(yǎng)基上 2 8 培養(yǎng)2 d后挑取單菌落至L B液體 培養(yǎng)基中震蕩暗培養(yǎng)4 8 h 3 0 1 8 0 r m i n 1 得到一級(jí)發(fā)酵液 吸取5 0 L一級(jí)發(fā)酵液均勻涂 布至B M P培養(yǎng)基上 將發(fā)酵液中菌體濃度調(diào)整 為4 1 0 6個(gè) L 1作為種子液備用 將種子液以 L B液體培養(yǎng)基1 的體積分?jǐn)?shù)為接種量接種后 同一級(jí)發(fā)酵液培養(yǎng)條件培養(yǎng)4 8 h后得到最終發(fā) 酵液備用 1 2 2 拮抗菌篩選 生長曲線測定和菌種分子 鑒定 采用劃線對(duì)峙法測定供試細(xì)菌對(duì)鳶尾果枯 病病原菌的拮抗特性 打取病原菌純菌落菌餅置 于P D A培養(yǎng)基中央 在距中心點(diǎn)3 c m的上下左 右4個(gè)方向劃線接種1株拮抗菌 共7株 每個(gè) 處理3次重復(fù)并以單獨(dú)培養(yǎng)病原菌為對(duì)照 測量 病原菌的生長直徑 計(jì)算抑菌率 抑菌率 對(duì)照菌落直徑 處理組菌落 直徑 對(duì)照菌落直徑 1 0 0 將篩選出的拮抗菌的種子液以1 的接種量 接種于L B培養(yǎng)基暗培養(yǎng) 3 0 1 8 0 r m i n 1 每6 h取樣一次用分光光度計(jì)在波長6 0 0 n m處 讀取其吸光度 每組樣品取樣1 2次 每次3次 重復(fù) 提取生防菌D N A基因組 采用引物對(duì)2 7 F 1 4 9 2 R擴(kuò)增1 6 S核糖體基因 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠 電泳檢測后委托生工生物工程 上海 股份有限公 司進(jìn)行純化和測序 1 2 3 抑菌條件優(yōu)化 以L B液體培養(yǎng)基 p H自然 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 以3 0 1 8 0 r m i n 1暗震蕩4 8 h為基礎(chǔ)培養(yǎng)方 法 以培養(yǎng)基體積1 接入種子液為基礎(chǔ)接種量 對(duì)選擇出的高效拮抗菌控制單因素變量分別作以 下8種處理 1 以酵母提取物 葡萄糖 蔗糖 麥芽 糖 可溶性淀粉和無碳源替換L B液體培養(yǎng)基碳 源 2 以胰蛋白胨 蛋白胨 牛肉膏 硫酸銨 硝酸 銨 氯化銨 無氮源替換L B液體培養(yǎng)基氮源 3 以氯化鈉 氯化鈣 氯化鉀 磷酸二氫鉀 硫酸鎂 無無機(jī)鹽替換L B液體培養(yǎng)基無機(jī)鹽源 4 將發(fā)酵 76 第2 3期 朱桐等 抑制鳶尾果枯病生防細(xì)菌的篩選及條件優(yōu)化 液培養(yǎng)溫度設(shè)置1 5 2 5 3 0 3 5 4 0 5個(gè)梯度 5 將 L B液體培養(yǎng)基的p H調(diào)整成5 6 7 8 9 6 將搖 床速度調(diào)整為0 1 2 0 1 5 0 1 8 0 2 0 0 r m i n 1 7 將種子液裝液量調(diào)整為液體培養(yǎng)基體積的 1 2 3 4 5 8 將發(fā)酵液培養(yǎng)時(shí)間以 6 h為間隔設(shè)置1 2個(gè)梯度 即6 7 2 h 把經(jīng)過以上8種處理的發(fā)酵液過濾后按照 1 0 的體積分?jǐn)?shù)混入5 0 左右的P D A培養(yǎng)基中 倒板培養(yǎng)病原菌 每組3次重復(fù) 7 d后測量數(shù)據(jù) 并計(jì)算抑菌率 測定不同碳源 不同氮源 不同無 機(jī)鹽成分的發(fā)酵液培養(yǎng)基與不同溫度 不同p H 不同轉(zhuǎn)速 不同裝液量不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液不 同培養(yǎng)方式對(duì)抑菌率的影響 以選擇出最佳液體 培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)條件 1 2 4 拮抗菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性測定 將選擇出的拮抗菌發(fā)酵液5 0 0 0 r m i n 1離 心1 0 m i n 取上清液過濾后分別控制單因素變量 作以下4種處理 1 先將p H調(diào)節(jié)為1 3 5 7 9 和1 1 1 h后再把p H調(diào)節(jié)至中性 p H 7 2 分 別在4 0 6 0 8 0 1 0 0 下水浴3 0 m i n和1 2 1 下 滅菌3 0 m i n 3 置于無菌培養(yǎng)皿開蓋放置在3 0 W 紫光燈下3 0 c m處照射3 0 6 0 9 0 m i n 4 置于無 菌培養(yǎng)皿開蓋放置在2 0 W白熾燈下3 0 c m處照 射2 4 6 8 1 0 h 將處理后的發(fā)酵液過濾后按照1 0 的體積分 數(shù)混入5 0 左右的P D A培養(yǎng)基中倒板 以未經(jīng)以 上處理的發(fā)酵液平板為對(duì)照培養(yǎng)病原菌 每組3次 重復(fù) 7 d后測量數(shù)據(jù)并計(jì)算抑菌率 研究拮抗菌抑 菌活性物質(zhì)的酸堿度 熱 紫外線和光照穩(wěn)定性 1 3 數(shù)據(jù)分析 采用S P S S 2 2軟件分析數(shù)據(jù) 采用E x c e l 2 0 1 6軟件作圖 2 結(jié)果與分析 2 1 7種拮抗細(xì)菌對(duì)互隔交鏈格孢菌的抑制率 由表1 圖1可知 Y W 0 0 4 1和Y W 0 0 3 2對(duì)病原 菌的防治效果良好 抑菌率分別為6 0 7 8 和 5 8 8 2 且與其他生防菌的抑菌率有顯著性差異 其他5種生防菌中K 2 3的發(fā)抑菌效果最差 抑菌率 為9 6 1 生防菌K 2 2 K 4 1 K 1 2和S F 0 5的抑菌 率依次為2 2 9 4 1 5 4 9 1 4 1 2 和1 3 3 3 表1 7種生防菌對(duì)互隔交鏈格孢菌的抑制率 T a b l e 1 I n h i b i t i o n r a t e o fA alternatab y 7 b i o c o n t r o l b a c t e r i a 菌株來源 S t r a i n s o u r c e 菌株 S t r a i n 抑菌率 I n h i b i t i o n r a t e 鳶尾Y W 0 0 4 1 6 0 7 8 a IrissanguineY W 0 0 3 2 5 8 8 2 a K 2 2 2 2 9 4 b K 4 1 1 5 4 9 b核桃楸 Juglansmandshurica K 1 2 1 4 1 2 b S F 0 5 1 3 3 3 b K 2 3 9 6 1 c 注 不同小寫字母表示不同處理?xiàng)l件間差異顯著 P 0 0 5 下同 N o t e D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s a m o n g t h e d i f f e r e n t t r e a t m e n t c o n d i t i o n s P蔗糖 可溶性淀粉 無碳 源 葡萄糖 麥芽糖 Y W 0 0 4 1為酵母浸粉 無 碳源 可溶性淀粉 葡萄糖 蔗糖 麥芽糖 通過研究培養(yǎng)基氮源對(duì)抑菌效果的影響發(fā)現(xiàn) 氮源為胰蛋白胨 即L B 時(shí) 拮抗菌Y W 0 0 3 2和 Y W 0 0 4 1發(fā)酵液的抑菌效果最佳 抑菌率分別為 圖3 生防菌Y W 0 0 3 2和Y W 0 0 4 1的系統(tǒng)發(fā)育樹 F i g 3 P h y l o g e n e t i c t r e e o f b i o c o n t r o l b a c t e r i a Y W 0 0 3 2 a n d Y W 0 0 4 1 8 0 5 9 和8 8 2 4 不同氮源對(duì)抑菌活性影響的有 利順序 Y W 0 0 3 2為胰蛋白胨 蛋白胨 牛肉膏 硫酸銨 無氮源 氯化銨 Y W 0 0 4 1為胰蛋白胨 牛肉膏 蛋白胨 氯化銨 硫酸銨 無氮源 通過研究培養(yǎng)基無機(jī)鹽對(duì)抑菌效果的影響發(fā) 現(xiàn)無機(jī)鹽為氯化鈉 即L B 時(shí) 拮抗菌Y W 0 0 3 2 和Y W 0 0 4 1發(fā)酵液的抑菌效果最佳 抑菌率分別 為8 0 5 9 和8 8 2 4 不同無機(jī)鹽對(duì)抑菌活性影 響的有利順序 Y W 0 0 3 2為氯化鈉 磷酸二氫鉀 無無機(jī)鹽 氯化鉀 氯化鈣 硫酸鎂 Y W 0 0 4 1 為氯化鈉 磷酸二氫鉀 無無機(jī)鹽 氯化鈣 氯 化鉀 硫酸鎂 通過研究培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌效果的影響發(fā)現(xiàn)在 培養(yǎng)溫度為3 0 時(shí) 拮抗菌Y W 0 0 3 2 Y W 0 0 4 1 發(fā)酵液的抑菌效果最佳 抑菌率分別為8 5 4 9 8 8 2 4 以3 0 為臨界點(diǎn) 隨著溫度升高抑制 效果提高 3 0 時(shí)抑制作用達(dá)到最大值 當(dāng)溫度 繼續(xù)上升時(shí) 抑菌效果緩慢回落 通過研究培養(yǎng)基p H對(duì)抑菌效果的影響發(fā)現(xiàn) 在p H為5時(shí) 拮抗菌Y W 0 0 3 2 Y W 0 0 4 1發(fā)酵液 的抑菌活性最佳 抑菌率分別為8 4 5 1 7 9 4 1 隨p H向堿性調(diào)節(jié) 抑菌活性逐漸下 降 當(dāng)p H 9時(shí) 2株拮抗菌的抑菌活性最差 抑菌 率分別為1 6 6 7 1 2 9 4 96 第2 3期 朱桐等 抑制鳶尾果枯病生防細(xì)菌的篩選及條件優(yōu)化 表3 生防菌在不同抑菌條件下的抑菌率 T a b l e 3 I n h i b i t i o n r a t e o f b i o c o n t r o l b a c t e r i a u n d e r d i f f e r e n t i n h i b i t i o n c o n d i t i o n s 變量 V a r i a n t 設(shè)置條件 C o n d i t i o n Y W 0 0 3 2 Y W 0 0 4 1 抑菌率顯著性抑菌率顯著性 葡萄糖5 3 5 3 d 7 0 5 9 d 蔗糖7 7 8 4 b 7 1 7 6 d 碳源可溶性淀粉7 7 4 5 b 7 6 0 8 c C a r b o n s o u r c e無碳源7 4 9 0 c 8 4 1 2 b 酵母浸粉8 0 5 9 a 8 8 2 4 a 麥芽糖3 6 6 7 e 5 9 8 4 e 牛肉膏6 3 9 2 c 8 5 8 8 b 硫酸銨5 2 1 6 d 4 8 8 2 e 氮源蛋白胨7 1 5 7 b 7 2 9 4 c N i t r o g e n s o u r c e氯化銨3 0 0 0 f 5 9 6 1 d 胰蛋白胨8 0 5 9 a 8 8 2 4 a 無氮源3 6 4 7 e 4 5 4 9 f 無無機(jī)鹽6 9 8 0 c 8 2 3 5 b 氯化鉀6 7 6 5 d 6 8 6 3 d 無機(jī)鹽氯化鈣6 1 7 6 e 7 2 9 4 c I n o r g a n i c s a l t硫酸鎂4 8 8 2 f 6 0 5 9 e 氯化鈉8 0 5 9 a 8 8 2 4 a 磷酸二氫鉀7 8 2 4 b 8 7 2 5 a 1 5 5 0 5 9 d 2 9 8 0 d 2 5 6 4 7 1 c 7 0 9 8 b溫度 T e m p e r a t u r e 3 0 8 5 4 9 a 8 8 2 4 a 3 5 8 6 6 7 a 4 7 8 4 c 4 0 7 3 3 3 b 1 3 5 3 e 5 8 4 5 1 a 7 9 4 1 a 6 8 0 5 9 b 4 8 2 4 b p H 7 8 1 3 7 b 3 6 4 7 c 8 1 6 2 7 c 1 7 2 5 d 9 1 6 6 7 c 1 2 9 4 e 0 8 7 8 4 b 8 8 0 4 a b 1 2 0 8 9 4 1 a 8 6 4 7 b c轉(zhuǎn)速 R o t a t i o n s p e e d r m i n 1 1 6 0 8 9 6 1 a 8 5 6 9 c 1 8 0 8 9 8 0 a 8 9 2 2 a 2 0 0 9 0 0 0 a 8 8 6 3 a 1 8 3 5 3 b 8 8 2 4 a b 2 7 6 0 8 c 8 5 2 9 c裝液量 L i q u i d v o l u m e 3 7 2 9 4 d 8 1 5 7 d 4 7 8 2 4 c 8 7 0 6 b 5 8 8 8 2 a 8 9 4 1 a 6 2 4 3 1 h 2 4 7 1 h 1 2 4 5 1 0 g 4 5 1 0 f 1 8 8 3 7 3 a 8 6 0 8 a 2 4 7 6 4 7 b 6 8 4 3 b 3 0 7 5 2 9 b c 6 0 9 8 c 時(shí)間3 6 7 4 1 2 c d 5 9 6 1 c d T i m e h 4 2 7 4 1 2 d 5 7 2 5 d 4 8 7 3 1 4 d 4 3 9 2 f 5 4 7 2 9 4 d 4 8 4 3 e 6 0 7 2 9 4 e f 3 5 6 9 g 6 6 7 3 1 4 e 3 7 8 4 g 7 2 7 2 9 4 g 3 5 6 9 g 通過研究培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌效果的影響發(fā)現(xiàn)在不 同轉(zhuǎn)速下 拮抗菌發(fā)酵液均具有較高的抑菌活性 Y W 0 0 3 2僅在0 r m i n 1條件下抑菌率顯著低于其 他處理 且隨著轉(zhuǎn)速的提高 抑菌活性也隨之升高 Y W 0 0 4 1在不同轉(zhuǎn)速下的抑菌率不成規(guī)律 其影響 的有利順序分別為1 8 0 r m i n 1 2 0 0 r m i n 1 0 r m i n 1 1 2 0 r m i n 1 1 6 0 r m i n 1 通過研究種子液裝液量對(duì)抑菌效果的影響發(fā) 現(xiàn)在裝液量為5 時(shí) 2種拮抗菌的發(fā)酵液抑菌活 性最佳 抑菌效果最好 發(fā)酵液的抑菌率隨著裝 液量的增加先下降后增長 裝液量為3 時(shí)最低 通過研究發(fā)酵液培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響 發(fā)現(xiàn)在0 6 h內(nèi)拮抗菌Y W 0 0 3 2和Y W 0 0 4 1的 無菌濾液對(duì)病原菌的抑制效果較弱 分別為 2 4 3 1 和2 4 7 1 培養(yǎng)1 8 h時(shí)二者抑菌效果 最佳 分別為8 3 7 3 和8 6 0 8 2 4 7 2 h抑菌 率呈下降趨勢 2 4 拮抗菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性 由表4可知 通過研究酸堿度穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)對(duì) 照 p H自然 Y W 0 0 3 2發(fā)酵液對(duì)鏈格孢的抑菌率 為8 5 4 9 在p H 1 p H 1 1的條件下 抑菌效 果分別下降為7 3 7 3 7 0 0 0 當(dāng)p H為3 9 時(shí)抑菌效果較為穩(wěn)定 對(duì)照Y W 0 0 4 1發(fā)酵液的抑 菌率為8 8 2 4 在p H為1 5時(shí) 抑菌效果極 差 抑菌率在2 0 左右 在p H為7 1 1時(shí) 抑菌 率在5 0 6 0 可以看出Y W 0 0 3 2發(fā)酵液具 有良好的酸堿穩(wěn)定性 通過研究熱穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)對(duì)照 不作熱處理 Y W 0 0 3 2發(fā)酵液的抑菌率為8 5 4 9 4 0 和 6 0 的處理結(jié)果與對(duì)照差異不顯著 在8 0 1 0 0 和1 2 1 處理下抑菌效果減弱 1 2 1 下抑菌效 果最差 僅為3 1 3 7 對(duì)照Y W 0 0 4 1發(fā)酵液的抑 菌率為8 8 2 4 4 0 和6 0 處理結(jié)果與對(duì)照差 異不顯著 在8 0 1 0 0 和1 2 1 的處理下抑菌率 較C K顯著下降 通過研究紫外線穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)對(duì)照 未經(jīng)紫外 燈照射 Y W 0 0 3 2發(fā)酵液的抑菌率為8 5 4 9 發(fā) 酵液被紫外燈照射9 0 m i n后抑菌率略有下降 為 8 4 3 1 對(duì)照Y W 0 0 4 1發(fā)酵液的抑菌率為 8 8 2 4 照射9 0 m i n后抑菌率為5 9 6 1 可 知紫外線照射對(duì)Y W 0 0 3 2的抑菌活性影響不大 而Y W 0 0 4 1具有紫外線不穩(wěn)定性 在照射6 0 m i n 后抑菌活性開始下降 通過研究光照穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)對(duì)照 在未經(jīng)日光 燈照射 Y W 0 0 3 2發(fā)酵液的抑菌率為8 5 4 9 照 射1 0 h時(shí)后抑菌率仍在8 5 2 9 對(duì)照Y W 0 0 4 1 發(fā)酵液的抑菌率為8 8 2 4 其發(fā)酵液光穩(wěn)定性 07北 方 園 藝 1 2月 上 較差 在2 0 W白熾燈照射4 h后抑菌率開始下 降 后抑菌率趨于穩(wěn)定 表4 生防菌在不同穩(wěn)定條件下的抑菌率 T a b l e 4 I n h i b i t i o n r a t e o f b i o c o n t r o l b a c t e r i a u n d e r d i f f e r e n t s t a b i l i z a t i o n c o n d i t i o n s 條件 C o n d i t i o n 處理 T r e a t m e n t Y W 0 0 3 2 Y W 0 0 4 1 抑菌率顯著性抑菌率顯著性 1 7 3 7 3 d 1 8 4 3 e 3 8 5 1 0 b 1 6 8 6 e 5 8 9 6 1 a 2 5 8 8 d p H 7 8 1 1 8 c 5 9 6 1 b 9 8 9 2 2 a 4 9 2 2 c 1 1 7 0 0 0 e 5 1 5 7 c C K 8 5 4 9 a b 8 8 2 4 a 4 0 8 6 6 7 a 8 9 4 1 a 6 0 8 7 4 5 a 8 8 8 2 a溫度 T e m p e r a t u r e 8 0 7 4 7 1 b 3 3 7 3 b 1 0 0 6 7 6 5 c 3 6 0 8 b 1 2 1 3 1 3 7 d 2 0 0 0 c C K 8 5 4 9 a 8 8 2 4 a 3 0 8 5 4 9 a 8 8 2 4 a紫外線照射時(shí)長 D u r a t i o n o f U V e x p o s u r e m i n 6 0 8 4 7 1 a 6 0 3 9 b 9 0 8 4 3 1 a 5 9 6 1 b 2 8 5 4 9 a 8 8 2 4 a 4 8 4 7 1 a 6 0 3 9 b光照時(shí)長 D u r a t i o n o f l i g h t h 6 8 4 3 1 a 5 9 6 1 b c 8 8 4 7 1 a 5 9 4 1 b c 1 0 8 5 2 9 a 5 8 2 4 d 3 討論與結(jié)論 該研究通過平板對(duì)峙法對(duì)7種生防細(xì)菌進(jìn)行 篩選 設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)分析了篩選出的高效生防 細(xì)菌最佳抑菌條件和抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性 結(jié)果 表明 枯草芽胞桿菌 B subtilis 和貝萊斯芽孢桿 菌 B velezensis 對(duì)病原菌抑制效果較好 抑菌率 分別為5 8 8 2 和6 0 7 8 以上2株拮抗菌最佳 液體培養(yǎng)基為L B培養(yǎng)基 成分為酵母浸粉 胰蛋 白胨和氯化鈉 發(fā)酵液最適培養(yǎng)條件為在p H為 5的液體培養(yǎng)基中裝入5 的種子液 置于3 0 1 8 0 r m i n 1搖床培養(yǎng)1 6 h B subtilis的酸堿穩(wěn) 定性 熱穩(wěn)定性 紫外線照射穩(wěn)定性和光照穩(wěn)定性 較好 B velezensis除熱穩(wěn)定性較高 其他3項(xiàng)均 不如B subtilis 各個(gè)處理下抑菌效果明顯下降 馮連榮等 1 6 發(fā)現(xiàn)濃度為1 0 0億芽孢 g 1的 B subtilis對(duì)楊葉枯病病原菌A alternata的相 對(duì)抑菌率在8 8 3 6 9 4 4 0 張永芝等 1 7 研究 表明B subtilis的發(fā)酵液 上清液和菌懸液對(duì) A alternata的抑菌率分別可達(dá)到9 1 9 4 8 6 8 3 和7 0 3 3 穆香軼等 1 8 在研究庫爾勒香 梨黑頭病時(shí)發(fā)現(xiàn)B subtilis對(duì)其致病菌蕓薹生鏈 格孢菌 A brassicicola 的抑制率達(dá)7 0 9 6 B subtilis的無菌濾液造成A brassicicola菌絲扭曲 變形 分枝增加 尖端出現(xiàn)致密結(jié)構(gòu)等異?，F(xiàn)象 該研究發(fā)現(xiàn)鳶尾的內(nèi)生細(xì)菌B subtilis和B velezensis對(duì)A alternata的抑制率分別為 5 8 8 2 和6 0 7 8 最高可達(dá)到9 0 0 0 和 8 9 2 2 可以認(rèn)為是防治鳶尾果枯病的高效生 防菌 培養(yǎng)基的組成對(duì)芽孢桿菌的生長和次生代謝 產(chǎn)物的產(chǎn)生有重要影響 該試驗(yàn)表明菌株 Y W 0 0 3 2 Y W 0 0 4 1偏向于有機(jī)碳和有機(jī)氮 這與 湯永玉等 1 9 優(yōu)化暹羅芽孢桿菌 B siamensis 菌 株氮源試驗(yàn)結(jié)果一致 這可能是由于2種菌株分 離自鳶尾果 對(duì)有機(jī)類碳氮源敏感度更高 有利于 拮抗菌株產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物抑制鏈格孢的生長 適宜的培養(yǎng)條件有利于抑菌物質(zhì)的合成 發(fā)酵條 件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與曹陽等 2 0 研究報(bào)道的枯草芽 孢桿菌最適培養(yǎng)條件接種量為5 發(fā)酵時(shí)間為 1 8 h 溫度為3 0 p H為7 轉(zhuǎn)速為1 8 0 r m i n 1 接種量 時(shí)間 轉(zhuǎn)速 發(fā)酵溫度相同 初始p H相對(duì) 低 張榮嶺 2 1 研究的B subtilis菌株L F 1 1的培 養(yǎng)條件溫度3 5 轉(zhuǎn)速1 5 0 r m i n 1 培養(yǎng)基初 始p H 7 5 溫度相同 轉(zhuǎn)速高 初始p H低 這可 能是不同菌株之間的個(gè)體差異造成的 2株拮抗菌在經(jīng)過1 2 1 處理3 0 m i n后仍 具有一定的抑菌效果 此時(shí)的抑菌率分別為 3 1 3 7 2 0 0 0 說明2株拮抗菌產(chǎn)生的活性物 質(zhì)還包含部分耐高溫成分 這與趙偉芬 2 2 對(duì)菌株 M T 0 0 2 B 7的研究結(jié)果相近 鐘嘯萍等 2 3 在對(duì) 枯草芽孢桿菌a 1的抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的研究 中發(fā)現(xiàn)抑菌活性物質(zhì)光照和中性條件下活性穩(wěn) 定 在溫度高于1 0 0 紫外光照射和堿性條件下 不穩(wěn)定 這與該試驗(yàn)的結(jié)果吻合 該試驗(yàn)從光照 酸堿 熱和紫外線4個(gè)方面的穩(wěn)定性入手 發(fā)現(xiàn) Y W 0 0 3 2菌株的穩(wěn)定性相對(duì)較強(qiáng) 日后在防治鳶 尾果枯病時(shí)可以考慮使用該菌株防治 參考文獻(xiàn) 1 錢崇澍 陳煥鏞 中國植物志 第六十八卷 M 北京 科學(xué) 出版社 1 9 6 3 17 第2 3期 朱桐等 抑制鳶尾果枯病生防細(xì)菌的篩選及條件優(yōu)化 2 郭潤婷 主要蔬菜鏈格孢病原菌的鑒定與新病害研究 D 北京 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2 0 1 8 3 許沛冬 易劍鋒 陳迪 等 貝萊斯芽孢桿菌生防次級(jí)代謝產(chǎn) 物研究進(jìn)展 J 生物技術(shù)通報(bào) 2 0 2 4 4 0 3 7 5 8 8 4 馮爭光 王學(xué)眾 劉曉東 等 解淀粉芽孢桿菌7 T 6的分離鑒 定及對(duì)金銀花白粉病的防治效果 J 北方園藝 2 0 2 2 1 1 1 0 4 1 1 1 5 虞凡楓 趙進(jìn) 孫銘悅 等 黃瓜枯萎病拮抗芽孢桿菌A 7 3 1 4的篩選及鑒定 J 北方園藝 2 0 2 2 3 4 1 4 6 6 S U N Y S U Y M E N G Z e t a l B i o c o n t r o l o f b a c t e r i a l w i l t d i s e a s e i n t o m a t o u s i n gBacillussubtiliss t r a i n R 3 1 J F r o n t i e r s i n M i c r o b i o l o g y 2 0 2 3 1 4 1 2 8 1 3 8 1 7 鄭世仲 周子維 陳曉慧 等 拮抗炭疽病的茶樹內(nèi)生菌篩 選 鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化 J 茶葉科學(xué) 2 0 2 3 4 3 2 2 0 5 2 1 5 8 W O N S J M O O N J H A J U N A H B e t a l B i o l o g i c a l c o n t r o l o f l e a f b l i g h t d i s e a s e c a u s e d b yPestalotiopsismaculansa n d g r o w t h p r o m o t i o n o fQuercusacutissimac a r r u t h c o n t a i n e r s e e d l i n g s u s i n gBacillusvelezensisC E 1 0 0 J I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f M o l e c u l a r S c i e n c e s 2 0 2 1 2 2 2 0 1 1 2 9 6 9 王飛 楊瑾 李紹建 等 丹參根腐病菌拮抗菌株貝萊斯芽胞 桿菌B v 1 4的篩選及盆栽防效 J 中國生物防治學(xué)報(bào) 2 0 2 3 3 9 6 1 3 9 8 1 4 0 7 1 0 安久春 袁青松 高彥平 等 太子參葉斑病生防菌發(fā)酵條件 的優(yōu)化 J 中藥材 2 0 2 4 4 8 2 6 8 3 2 1 1 梅鳳珍 周明超 楊丹 等 生防菌Y 2 6的鑒定 發(fā)酵優(yōu)化及其 殺線蟲活性測定 J 中國生物防治學(xué)報(bào) 2 0 2 4 4 0 2 4 2 4 4 3 4 1 2 石慧敏 葉建仁 王焱 等 響應(yīng)面優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌 Ba cillusvelezensis 菌株Y H 1 8產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 J 南京 林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 自然科學(xué)版 2 0 2 3 4 7 1 2 0 9 2 1 8 1 3 瞿佳 孫曉宇 陳銳 等 核桃黑斑病拮抗放線菌W M F 1 0 6 發(fā)酵條件優(yōu)化和抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性 J 微生物學(xué)通報(bào) 2 0 2 2 4 9 1 8 8 1 0 0 1 4 孫琰 藍(lán)莓鏈格孢菌腐爛病拮抗菌的篩選鑒定及抑菌機(jī)理 研究 D 沈陽 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2 0 2 3 1 5 方圓 新疆野果林木霉分離鑒定及對(duì)野蘋果苗抗菌促生特 性研究 D 哈爾濱 東北林業(yè)大學(xué) 2 0 1 9 1 6 馮連榮 矯麗曼 張妍 等 楊葉枯病病原菌生物學(xué)特性 防 治藥劑篩選及楊樹抗病性評(píng)價(jià) J 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2 0 2 4 5 2 1 1 0 3 1 0 9 1 7 張永芝 袁王俊 劉鵬 等 連翹葉褐斑病生防細(xì)菌的篩選與 鑒定 J 中藥材 2 0 2 2 4 5 1 1 2 5 5 0 2 5 5 5 1 8 穆香軼 張璇 胡有貞 等 庫爾勒香梨黑頭病拮抗菌的篩選 和鑒定 J 微生物學(xué)通報(bào) 2 0 2 0 4 7 6 1 7 9 5 1 8 0 6 1 9 湯永玉 吳國星 朱國淵 等 附子白絹病菌拮抗菌的鑒定 發(fā)酵條件優(yōu)化及抑菌效果 J 微生物學(xué)通報(bào) 2 0 2 3 5 0 7 2 8 9 2 2 9 0 6 2 0 曹陽 孫平平 劉彬 一株枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng) 條件的優(yōu)化 J 綠色科技 2 0 2 2 2 4 2 4 2 3 7 2 4 0 2 5 7 2 1 張榮嶺 枯草芽孢桿菌L F 1 1及其細(xì)菌素的研究 D 濟(jì)南 山東大學(xué) 2 0 2 2 2 2 趙偉芬 一株拮抗細(xì)菌的分離鑒定及其抑菌物質(zhì)的初步研 究 D 西安 西北大學(xué) 2 0 0 8 2 3 鐘嘯萍 熊智強(qiáng) 陳小龍 枯草芽孢桿菌a 1所產(chǎn)抗真菌活性 物質(zhì)的穩(wěn)定性研究 J 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2 0 1 1 5 2 4 8 7 8 8 8 1 S c r e e n i n g a n d O p t i m i z a t i o n o f C o n d i t i o n s f o r t h e I n h i b i t i o n o f IrissanguineF r u i t B l i g h t B i o c o n t r o l B a c t e r i a Z H U T o n g 1 W A N G Y u x i 1 L U X i n m i n g 2 L I U X u e f e n g 1 W A N G B i n 3 D I A O G u i p i n g 1 1 F o r e s t r y S c h o o l N o r t h e a s t F o r e s t r y U n i v e r s i t y H a r b i n H e i l o n g j i a n g 1 5 0 0 4 0 2 I n s t i t u t e o f N a t u r a l R e s o u r c e s a n d E c o l o g y H e i l o n g j i a n g A c a d e m y o f S c i e n c e s H a r b i n H e i l o n g j i a n g 1 5 0 0 4 0 3 O r d o s F o r e s t r y a n d G r a s s l a n d D e v e l o p m e n t C e n t e r O r d o s I n n e r M o n g o l i a 0 1 7 0 0 0 A b s t r a c t T a k i n g t h e p l a t e s t a n d o f f m e t h o d a n d o n e w a y t e s t w i t hIrissanguinef r u i t b l i g h t p a t h o g e n A alternataa n d s e v e r a l p l a n t e n d o p h y t i c b a c t e r i a a s t h e t e s t m a t e r i a l s t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f d i f f e r e n t e n d o p h y t i c b a c t e r i a o nA alternataa s w e l l a s t h e i n h i b i t o r y a b i l i t y a n d s t a b i l i t y o f t h e s c r e e n e d e f f i c i e n t b i o c o n t r o l b a c t e r i a u n d e r d i f f e r e n t c u l t u r e c o n d i t i o n s w e r e s