干制辣椒雄性不育系與保持系間多態(tài)性InDel標記的篩選

北方園藝（）： ·研究論文·第一作者簡介：姜童（），男，碩士研究生，研究方向為蔬菜遺傳育種。：責任作者：林多（），女，博士，教授，研究方向為蔬菜營養(yǎng)生理與品質(zhì)育種。：基金項目：山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新資助項目（）；山 東 省 農(nóng) 業(yè) 良 種 工 程 資 助 項 目（）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用型人才培養(yǎng)特色名校建設(shè)工程教學(xué)研究資助項目（，）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金資助項目（）；山東省自然科學(xué)基金資助項目（）。收稿日期：干制辣椒雄性不育系與保持系間多態(tài)性標記的篩選姜童，王輝，楊 延 杰，林多（青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，青島市遺傳改良與育種重點實驗室，山東 青島）摘要：以對干制辣椒雄性不育系以及相應(yīng)保持系（，；，；，）為試材，采用標記的方法對干制辣椒雄性不育系與保持系間進行檢測，以期篩選出干制辣椒雄性不育與保持系間存在多態(tài)性的標記。結(jié)果表明：在個標記中，僅有一個標記在對不育系和保持系間存在一致的多態(tài)性，該標記在不育系中分別擴增出約為和左右的片段，而在相應(yīng)保持系中均未擴增出相應(yīng)條帶。初步認為，分子標記可用于干制辣椒雄性不育系與保持系間的分子標記輔助鑒定。關(guān)鍵詞：干制辣椒；雄性不育；標記中圖分類號： 文獻標識碼： 文章編號：（）辣椒（ ）屬茄科辣椒屬一年生或有限多年生植物，因其維生素含量高而深受消費者歡迎。辣椒雄性不育是指植物花藥不能產(chǎn)生正常有功能的花粉的現(xiàn)象，通常包括花藥無法產(chǎn)生花粉，花粉敗育以及花藥無法開裂這幾種現(xiàn)象。由于辣椒雜交優(yōu)勢明顯，目前市場上所用的大部分種子是雜交一代，但是隨著國內(nèi)農(nóng)資以及勞動力等價格的提高，雜種一代的生產(chǎn)成本也逐漸增高，而雄性不育是迄今為止能夠降低這一成本的有效途徑之一。即插入缺失，是針對基因組中插入缺失位點而設(shè)計的標記，廣泛分布于基因組，數(shù)目眾多，經(jīng)擴增、電泳分離以及相應(yīng)的染色技術(shù)檢測，得到的多態(tài)性片段即為標記，具有分布廣、重復(fù)性好、檢測方便、呈共顯性 ， ， ：（ ）； ； ； ； 遺傳等優(yōu)點，被廣泛用于植物遺傳多樣性分析、高密度遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、種子純度鑒定和分子標記輔助育種等研究領(lǐng)域。近年來，應(yīng)用標記進行基因定位受到許多學(xué)者關(guān)注，在種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系等領(lǐng)域已有大量研究，但對于干制辣椒標記的研究尚鮮見報道。該研究以對干制辣椒雄性不育系以及相應(yīng)保持系為試料，采用標記的方法對干制辣椒不育系與保持系相關(guān)標記進行篩選，以期篩選出標記，為干制辣椒不育系與保持系相關(guān)分子標記輔助選擇方面提供一定參考。 材料與方法 試驗材料對辣椒材料雄性不育系和相應(yīng)保持系材料（，；，；，；其中和分別表示雄性不育系和保持系）由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院干制辣椒育種課題組提供；分布于辣椒條染色體上的對引物為等開發(fā)的辣椒標記（表），引物由上海生物工程公司合成。 試驗方法 干制辣椒基因組的提取采用改良法和植物基因組提取試劑盒種方法，分別提取干制辣椒材料。改良法具體步驟如下，取樣：新鮮葉片取直徑的小片，加入離心管中。研磨：向離心管中加入液氮用玻璃棒充分研磨至粉末狀。植物基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，按試劑盒說明書步驟，提取干制辣椒葉片基因組。 瓊脂凝膠電泳檢測取樣品與 ×混勻后上樣，瓊脂糖凝膠（含熒光染料）電泳檢測質(zhì)量。電泳條件：電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察照相。 擴增利用干制辣椒引物對份樣品進行擴增。反應(yīng)體系為：模板（約），正反引物各，× ，加至終體積；循環(huán)體系為：預(yù)變性；變性，退火，延伸，共個循環(huán)；總延伸；保存擴增產(chǎn)物，退火溫度不是固定不變的，不同引物有不同的退火溫度，將這對引物按照相近溫度分為類：、。 聚丙烯酰胺凝膠電泳取擴增產(chǎn)物于非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，分子量大小為 的 ，電壓下電泳。電泳結(jié)束后，清水沖洗玻璃板兩面，使凝膠冷卻，然后進行銀染和顯色，置于燈箱上照相。表 試驗所用的引物 編號標記名稱 編號標記名稱 編號標記名稱 編號標記名稱 第期北方園藝 結(jié)果與分析 基因組質(zhì)量檢測將提取的干制辣椒材料基因組進行了瓊脂糖電泳檢測，采用種方法提取的完整性好，而且點樣孔干凈。但采用改良法（圖）提取的純度、質(zhì)量濃度均沒有植物基因組提取試劑盒（圖）的高，該研究采用植物基因組提取試劑盒提取的進行了后續(xù)試驗。 不育系和保持系基因組多態(tài)性引物篩選針對每對不育系和保持系均進行了對引物的檢測，其中，的檢測結(jié)果如圖所示，在這對引物中有對（、）在不育系和保持系間存在多態(tài)性。對其它對材料也進行相同的篩選過程，其中與間有對引物（和）存在多態(tài)性；與間也有對引物（和）存在多態(tài)性。所選對引物在對不育系和保持系間的多態(tài)性比例分別為、和；而且有一對引物在對不育系和保持系間存在一致的多態(tài)性，多態(tài)性比例為。注：為；依次為編號、。下同。：；， ， ， 圖改良法提取辣椒基因組電泳檢測 圖植物基因組提取試劑盒提取辣椒基因組電泳檢測 在對干制辣椒雄性不育系與保持系間的擴增情況通過對對不育系和保持系進行的多態(tài)性引物的篩選可知（圖），標記在對不育系和保持系間均存在一致的多態(tài)性，在份不育系中可同時擴增出條片段，其中條大小約為和的片段是在不育系中所特有的；而在份保持系中均擴增出條條帶。可見該標記在供試的不育系和保持系間表現(xiàn)為顯性標記。北方園藝月（上）注：為；為對引物。：； 圖親本，的聚丙烯酰胺凝膠電泳 ，圖標記在不育系和保持系中的擴增結(jié)果 結(jié)論與討論該研究以對干制辣椒雄性不育系以及保持系為試驗材料，利用均勻分布于辣椒條染色體上的對引物進行了干制辣椒雄性不育系與保持系間的檢測，結(jié)果篩選到對引物在供試的干制辣椒雄性不育系和保持系間存在一致的多態(tài)性。近年來，許多辣椒育種研究者在品種選育、辣椒不育機理探尋和不育基因定位上開展了大量工作。王得元等以辣椒細胞質(zhì)雄性不育系及其保持系為材料開展了標記研究，并獲得了個細胞質(zhì)雄性不育基因相關(guān)的標記和，同時認為標記可能與保持系中的保持基因相關(guān)。 第期北方園藝王述彬等也利用技術(shù)對辣椒細胞質(zhì)雄性不育系與其相應(yīng)保持系的基因組進行了比較分析，并獲得了不育系基因組特異的片段。魏兵強等也利用類似的方法獲得了與不育基因相關(guān)的標記。這些標記對于分子輔助育種有實踐意義和一定的利用價值。該試驗中，利用基因組錨定標記對對干制辣椒不育系和相應(yīng)保持系開展了多態(tài)性引物篩選，并從中篩選到了個穩(wěn)定的多態(tài)性標記。等研究認為該標記在第號染色體上，且目的片段為；該試驗中份材料在目的條帶處均未表現(xiàn)多態(tài)性，但存在左右的多態(tài)性片段，可見該處的擴增片段為非特異性擴增。盡管該標記在對不育系和保持系間存在一致的多態(tài)性，該多態(tài)性用于區(qū)分不育系和保持系。但對于該 標記的應(yīng)用范圍及多態(tài)性片段的序列信息等尚需進一步研究。參考文獻傅鴻妃，柴偉國，呂曉菡，等雄性不育在我國辣椒品種選育中的應(yīng)用及不育基因定位研究進展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，（）：張志剛，趙智中，李巧云，等大白菜標記開發(fā)及其在剩余雜合體鑒定中的應(yīng)用農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，（）：姚國新，黃文超利用水稻秈粳分化標記鑒定育種材料的秈粳屬性雜交水稻，（）：葛敏，蔣璐，張曉林，等利用（）分子標記檢測玉米互交種混雜的原理及應(yīng)用分子植物育種，（）：申璐，沈炎林，柴敏，等采用和標記分析番茄品種基因組 多態(tài)性中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，（）：李斯更，沈鏑，劉博，等基于黃瓜基因組重測序的標記開發(fā)及其應(yīng)用植物遺傳資源學(xué)報，（）： ， ， ， （ ） ，（）：謝立波，郭亞華，孟凡娟，等辣椒擴增體系的建立安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)報，（）：王得元，王鳴，鄭學(xué)勤，等用分析辣椒細胞質(zhì)雄性不育基因核農(nóng)學(xué)報，（）：王述彬，劉金兵，潘寶貴，等辣椒細胞質(zhì)雄性不育系與其保持系基因組的分析上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，（）：魏兵強，王蘭蘭，陳靈芝，等辣椒胞質(zhì)雄性不育基因的分子標記西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，（）：， ， ， ， （ ， ， ）： （，；，；，） ， ， ， ：； ； 北方園藝月（上）