叢枝菌根真菌提高黃瓜幼苗抗立枯病作用研究_秦海濱.pdf

華北 農(nóng) 學報 ·2014， 29( 增刊 ) : 98-102收稿 日 期 : 2014 10 12基金項目 : 天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉化與推廣項目 ( 201204020) ; 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系項目 ( CAS-25-C-01) ; 國家星火計劃重大項目( 2012GA600002) ; 農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室資助項目作者簡介 : 秦海濱 ( 1981 ) ， 男 ， 河北蔚縣人 ， 碩士 ， 主要從事設施蔬菜栽培研究 。通訊作者 : 賀超興 ( 1965 ) ， 男 ， 河南洛陽人 ， 研究員 ， 博士 ， 主要從事設施栽培研究 。doi: 107668/hbnxb2014 S1021叢枝菌根真菌提高黃瓜幼苗抗立枯病作用研究秦 海 濱 ， 張 志斌 ， 賀超興( 中國農(nóng)業(yè)科學院 蔬菜花卉研究所 ， 北 京 100081)摘要 : 為研究叢枝菌根真菌對黃瓜苗期立枯病的防治效果和相關生理生化變化 。以黃瓜品種中農(nóng) 16 為材料 ， 播種時接種叢枝菌根真菌 ， 對 20 d 幼苗人工接種立枯絲核菌 。結果表明 ， 接種菌根真菌后能夠顯著提高黃瓜苗期對立枯病的抗性 ， 降低發(fā)病率 。黃瓜苗期人工接種立枯絲核菌后菌根苗和非菌根苗發(fā)病率分別為 16 5% 和 52 0%， 非菌根苗發(fā)病嚴重 ， 病情指數(shù)為 467， 接菌病情指數(shù)為 10， 較非接菌苗下降了 785%， 接種菌根真菌提高黃瓜抗病性與改變相關酶活性有關 ， 在病害發(fā)生前菌根真菌已經(jīng)與寄主植物互利共生 ， 提前啟動了抵抗病害得相關機制 ， 如提高了保護酶活性 ， 促進植株生長 ， 接種菌根真菌后菌根苗地上鮮質量和地上干質量分別比未接菌處理提高 33 10% 和25. 93%。在病害發(fā)生過程中菌根真菌與病原菌互相競爭 ， 抑制病菌對寄主的侵害 ， 減輕細胞膜受損害程度 。關鍵詞 : 叢枝菌根真菌 ; 黃瓜 ; 立枯病 ; 增抗機理中圖分類號 : S4324+4 文獻 標 識碼 : A 文章編號 : 1000 7091( 2014) 增刊 0098 05Study of Tolerance Effects on Blight of Cucumber SeedlingsInduced by Arbuscular Mycorrhizal FungiQIN Hai-bin， ZHANG Zhi-bin， HE Chao-xing( Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China)Abstract: The cucumber strain Zhongnong 16 were used to screen the effect of arbuscular mycorrhizal fungi onseedling blight of cucumber in solar greenhouse， and related physiological and biochemistry changes were studiedThe result indicated that when cucumber seedlings inoculated with mycorrhizal fungi it can significantly enhance theability of cucumber resistance After inoculated rhizoctonia solani incidence rates of AM cucumber seedlings andnon-AM cucumber seedlings were 16 5% and 52 0% The mean disease index of cucumber seedling inoculatedwith AMF was 785% lower than that of the control respectively， moreover， there were most obvious the differencesbetween the treatments and the control Before disease occurrence the sysbiosis of AMF and host plant had formedand the relevant mechanisms of disease resistance had been started The inoculation of AMF enhanced plant grewthand improved the activity of protect enzyme During disease occurred AMF and pathogens compete with each otherAMF inhibited the infection of bacteria against host plant It manifested on activity of eactive-oxygen-scavengingEnzymes insensitive to the inoculation of pathogens Degree of membrane lipids peroxidation depressed the damageof cell membrane was smallerKey words: Arbuscular mycorrhizal fungi; Cucumber seedling; Blight; Tolerance黃瓜是一種全球性的重要蔬菜作物 。近 年 來 由于黃瓜的露地及保護地栽培面積逐年擴大 ， 加之大規(guī)模的南菜北運 ， 使黃瓜成了可以周年供應的重要蔬菜 ， 在人們的日常生活中占有重要地位 。因此 ， 以黃瓜為主的果菜成為設施栽培中的主要品種 ， 在我國蔬菜的周年生產(chǎn)中占有重要地位 。黃瓜在生產(chǎn)過程中要求水分充足 ， 最適生長溫度在 25 左右 ， 因此 ， 設施中環(huán)境的高溫高濕也為病菌的生長提供了適宜的條件 。同時 ， 黃瓜周年生產(chǎn)帶來的連作障礙影響了黃瓜的產(chǎn)量和品質 ， 每年因連作障礙導致植物發(fā)病和死亡率達到 30%40%。黃瓜病害已經(jīng)成為黃瓜設施生產(chǎn)中亟待解決的問題 。增刊 秦 海 濱等 : 叢枝菌根真菌提高黃瓜幼苗抗立枯病作用研究 99立枯 病 是黃瓜苗期的主要土傳病害 ， 各地保護地冬春育苗普遍發(fā)生 ， 立枯病發(fā)病嚴重時幼苗成片死亡甚至全部毀苗 ， 對生產(chǎn)影響很大 。半知菌亞門絲核菌屬真菌 立 枯絲 核菌 ( hizoctonia solani)是引起蔬菜立枯病的主要病原菌 ， 普遍存在于菜地土壤中 ， 具有較強的致病力 1。而對于此類病害 ，生產(chǎn) 上主要采用化學防治 ， 雖然也有一定的效果 2， 但易引 起病原菌對農(nóng)藥的抗性 ， 造成環(huán)境的污染 。因此 ， 研究人員開始尋找更安全高效的防治方法 ， 生物防治作為植物病害防治的一項重要措施 ，已引起人們的高度重視 。近年來 ， 將菌根真菌作為一種極有應用潛力的生防劑使用受到科學家們的日益關注 3 5。大量 研 究表明 ， AM 真菌對番茄晚疫病 6、馬 鈴 薯 菌核病 7、棉 花 黃 萎病 8等 多 種 農(nóng)作物上表現(xiàn)出良好的生防效應 。本試驗在黃瓜菌根苗上采用人工接種病原菌的方式研究了叢枝菌根真菌對黃瓜苗期立枯病的防治效果和相關生理生化變化 ， 明確菌根菌提高黃瓜抗病性的作用規(guī)律 ， 為實現(xiàn)立枯病的生物防治提供理論基礎 。1 材料 和 方法11 試驗 材 料供試菌根真菌 : Glomous mosseae-2( GM) 由匈牙利科學院土壤科學與農(nóng)業(yè)化學研究所 Tunde Takacs博士篩選提供 。供試基質 : 草炭蛭石 ( 11， 不添加任何肥料 ) 。供試病原菌 : 立枯絲核菌 ( hizoctonia solani) 由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所李保聚研究員提供 。黃瓜品種 : 中農(nóng) 16 號 ， 由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所選育 。12 試驗設計本試驗于 2012 年秋季在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所設施栽培溫室進行 ?；|容器為 10 cm×10 cm 營養(yǎng)缽 ， 每缽裝基質 300 g， 接菌處理每缽接種 AMF 菌劑 10 g， 不接菌處理以 10 克滅菌沙土代替 。試驗設計了 4 種不同的處理 : 接種菌根真菌不接種病原菌 ( GM) ; 接種菌根真菌又接種病原菌處理 ( GM + B) ; 不接種菌根真菌只接種病原菌 ( CK + B) ; 不接種菌根真菌也不接種病原菌( CK) 。每個處理重復 3 次 ， 每次重復 25 盆 。13 測試指標與方法待黃瓜出苗 20 d 后接種病原菌 ， 并于接病后 1，3， 5， 8， 11 d 后取樣測定植株根系 SOD、PAL、MDA活性變化 ， 酶活性測定參照李合生編 植物生理生化試驗原理和技術 。接病后 7 d 調查地上部干鮮質量 、株高和莖粗 。接病后 11 d 進行發(fā)病率和發(fā)病級數(shù)調查 。立枯病病原菌接種體的制備 : 在 PDA 培養(yǎng)基上活化立枯絲核菌 3 d， 轉 PDA 液體培養(yǎng)基中放于搖床中培養(yǎng) 3 d， 用雙層紗布濾出菌絲團 ， 將菌絲攪碎 ，用無菌水調制透光率為 18%的菌絲懸液 。病原菌接種方法 : 待黃瓜出苗 20 d 后 ， 用剪刀對黃瓜根系進行輕微傷根處理 ， 在傷口周圍每株接種 10 mL 菌絲懸液 ?；|及種子滅菌 : 育苗基質為草炭蛭石 ( 1 1) ，于烘箱中 160 滅菌 2 h， 自然冷卻后繼續(xù) 160 滅菌 2 h。種子用 70% 酒精浸 5 min 后蒸餾水沖洗 ，28 催芽 。盆缽用 70%酒精擦后晾干備用 。所有數(shù)據(jù)用 SPSS 數(shù)據(jù)處理軟件進行處理 ， 差異顯著性采用 Duncan's 新復極差法測驗分析 。發(fā)病分級標準 發(fā)病情況分級如下 :0 級 生長正常 ， 未發(fā)病 ;1 級 初現(xiàn)病癥 ， 基部莖稈出現(xiàn)水漬狀病斑 ;2 級 病斑擴大 ， 莖基部開始萎縮 ;3 級 病斑繼續(xù)擴大 ， 莖基部完全萎縮 ;4 級 植株死亡 。發(fā)病率 = ( 發(fā)病株數(shù) /調查總數(shù) ) ×100%病情指數(shù) =( 發(fā)病級數(shù) × 發(fā)病株數(shù) ) /調查總株數(shù) × 發(fā)病最重級數(shù) ×100相對防治效果 = ( 對照發(fā)病率 處理發(fā)病率 ) /對照發(fā)病率 ×100%2 結果 與 分析21 接種立枯絲核菌發(fā)病率調查接 種 菌 根真菌后顯著抑制了立枯病的發(fā)生 ， 由表 1 可以看出 ， 人工接種病原菌后接種菌根真菌的處理相對于未接種處理發(fā)病率顯著降低 。未接種菌根真菌的處理接種病原菌后的發(fā)病率是接種菌根真菌的 5 倍 。接種菌根菌的處理的發(fā)病程度也較低 ，表現(xiàn)在病情指數(shù)低于未接菌對照 。未接種病原菌的2 個處理都未發(fā)病 。22 接種立枯絲核菌后黃瓜菌根侵染率變化分別于播種后 27， 29， 31， 33， 34 d 測定黃瓜苗菌根侵染率 ， 對應的接種病原菌天數(shù)分別為 1， 3， 5，8， 11 d。侵染率變化由圖 1 可見 ， 接種病原菌后菌根侵染率迅速降低 ， 接病 1 d 后相比未接病處理侵染率下降 45%， 接病 3 d 后檢測接病處理侵染率降到最低 025%。隨后接病處理侵染率逐漸上升 ， 到接病后第 11 天與未接病處理幾乎相同 。在取樣這100 華 北 農(nóng) 學 報 29 卷段時 間 未接病處理的侵染率變化比較穩(wěn)定 ， 前 8 d 侵染率在 20%左右變化 ， 第 11 天侵染率達到 515%。表 1 菌根真菌對黃瓜幼苗立枯病的防效Tab1 Effect of AMF on the control of Cucumber hizoctonia solani infected with solani處 理Treatments發(fā) 病 率 /%Incidence病情 指 數(shù)Disease index相對 防 治效果 /%elative control effect + + +GM 0 165b 0 10b 0 788CK 0 520a 0 467a 0 注 : 表中 小 寫字母表示 5%水平差異顯著性 ; + 接種立枯絲核菌 ; 未接種立枯絲核菌 。表 2， 3 同 。Notes: Lowercase letter in table show 005 level significant different; + Infected with solani; Noninfected with solani The same as Tab2， 3圖 1 接種立枯絲核菌后菌根侵染率變化Fig1 The change curve of infectingrate after infected with solani23 接種立枯絲核菌后黃瓜菌根苗生長變化大量研究表明接種菌根真菌能夠促進黃瓜幼苗的 生長 ， 從 表 2 中可以看出 ， 接種菌根真菌后地上部鮮質量和干質量分別比對照高出 331%和 2593%。接種菌根真菌同時接種 h s 后接種菌根真菌的植株地上部鮮質量和干質量分別比未接種菌根真菌的處理高 13. 20%和 1670%， 雖然接種菌根真菌的處理向比對照有所增長 ， 但是較未接病相同處理的2593%和 33. 1% 卻有所降低 ， 說明接種病原菌后影響了菌根真菌作用的發(fā)揮 ， 病原菌與菌根真菌之間存在相互作用 。表 2 菌根真菌對接種立枯絲核菌后黃瓜幼苗干 、鮮質 量 的影響Tab2 Effect of AMF on dry weight and fresh weight of Cucumber seedlings infected with solani處理Treatments + +地上 部鮮 質量 /gShoot freshweight比對照增加Higher thanCK地上部鮮質量 /gShoot freshweight比對照增加Higher thanCK地上部干質量 /gShoot dryweight比對照增加Higher thanCK地上部干質量 /gShoot dryweight比對照增加Higher thanCKGM 322a 3310% 228a 1320% 034a 2593% 028a 1670%CK 242b 202a 027b 024a 菌根 真 菌對黃瓜幼苗的促生作用還表現(xiàn)在 ， 與接菌處理相比顯著提高了黃瓜幼苗的植株高度和莖粗 ， 并且接種病原菌后差異依然顯著 ( 表 3) 。表 3 菌根真菌對接種立枯絲核菌后黃瓜株高 、莖粗 的 影響Tab3 Effect of AMF on height and stem diameterof Cucumber infected with solani處理Treatments株高 /cmPlant height莖粗 /mmStem diameter + +GM 2200a 1808a 431a 421aCK 1255b 1172b 320b 336b24 接種立枯絲核菌后黃瓜菌根苗根系 SOD 活性變 化SOD 是植物體內抗氧化傷害的關鍵酶之一 ， 它能催化 O2的歧 化 反應而形成 H2O2， 從而 清 除植物體內的 O2。SOD 活性的強弱表明植株本身在遇到外界刺激后清除活性氧自由能力的強弱 。由 圖 2 可見 ， 接 種 h s 后未接種菌根真菌處理對病原菌侵染反應較敏感 ， 在接種病原菌后第 3 天后 SOD 活性迅速升高 ， 而接種菌根真菌處理的植株對病原菌的侵染反映較遲鈍 ， 在接病后第 8 天 SOD 活性才達到第1 個高峰 。并且相比未接種菌根菌處理 ， 接種菌根真菌后的 SOD 活性始終較低 ， 即使 2 個高峰時期相比后者是前者的 674%( 圖 2) 。25 接種立枯絲核菌后黃瓜菌根苗根系 PAL 活性變化植物本身擁有一套復雜的抵御病原物進攻的防御機制 ， 其中 ， 苯丙烷類代謝途徑的激活是許多植物產(chǎn)生的抗病反應之一 。在該途徑中 ， 苯丙氨酸解氨酶 ( PAL) 是催化產(chǎn)生植物次生代謝產(chǎn)物 ( 木質素 、植保素及黃酮等 ) 的關鍵酶 ， 與植物的抗病性密切相關 。從圖 3 可見 ， 在接種 h s 第 1 天接種 GM 處理的植株 PAL 活性已經(jīng)處于一個相對較高的值 ， 隨著時間增加活性逐漸下降 ， 到第 8 天降到最低 ， 第11 天 PAL 活性又迅速升高 。未接種 GM 植株根系的 PAL 活性的第 1 次高峰出現(xiàn)較晚 ， 在接種立枯絲核菌后的第 3 天 ， 隨后活性逐漸下降 ， 在第 11 天又達到高峰 。而未接病處理 PAL 活性變化不大 ， 接種GM 不接病處理的 PAL 活性變化表現(xiàn)為雙峰曲線 ，增刊 秦 海 濱等 : 叢枝菌根真菌提高黃瓜幼苗抗立枯病作用研究 101對照 PAL 活性在采樣期變化不明顯 。4 個處理綜合比較 ， 接種病原菌兩處理的 PAL 活性較高 ， 說明病原菌侵染后植物的防御系統(tǒng)已經(jīng)開啟 ， 生成了與抗性相關物質 ， 并且接種菌根真菌的處理 PAL 活性始終處于相對較高的水平 。圖 2 AMF 對接種立枯絲核菌后黃瓜根系 SOD 活性變化的影響Fig2 Effect of AMF on SOD activity in cucumber roots infected with solani圖 3 AMF 對接種立枯絲核菌后黃瓜根系 PAL 活性變化的影響Fig3 Effect of AMF on PAL activity in cucumber roots infected with solani26 接種 立 枯絲核菌后黃瓜菌根苗根系 MDA 含量變化丙二醛是膜脂過氧化的產(chǎn)物 ， 能夠嚴重地損傷生物膜并抑制細胞保護酶的活性 ， 其含量高低反應植物受害的程度 。各處理間 MDA 含量在接病后5 d 內相差不大 ， 第 5 天以后接種病原菌的處理 MDA含量迅速上升 ， 但始終處理 CK + B 的 MDA 含量要高于 GM + B。未接病處理的 MDA 含量則一直相對較低 ( 圖 4) 。未接病兩處理相比接種菌根真菌的黃瓜根系 MDA 含量較高 ， 這可能與菌根侵染過程中菌絲侵入細胞時對根系細胞造成傷害有關 。圖 4 AMF 對接種立枯絲核菌后黃瓜根系 MDA 含量 的 影響Fig4 Effect of AMF on MDA content in cucumber roots infected with solani3 討論由于 AMF 菌生存于土壤中 ， 侵染植物的根部 ，因此其對土傳病害的影響最顯著 。Dehne 3和Schonbeck 等 9的研究均發(fā)現(xiàn)有菌根的棉花植株 比無 菌根的棉花植株更能抵抗病原菌根串珠霉( Thielaviopsis basicola) 的感染 。隨后的研究報告指出 ， 棉花根串珠霉的厚垣孢子產(chǎn)量與菌根的侵染程度成反比 10。小林 紀 彥 11研究 發(fā) 現(xiàn)接種 Gjgasporamargarita 可以抑制 Pythium splendens 和 hizoctoniasolani 引起的黃瓜苗立枯病 ， 同時使用菌根真菌和病原的拮抗微生物可以抑制病害的發(fā)生 。本試驗研究了接種菌根真菌對黃瓜苗期立枯病的影響 ， 結果表明 ， 苗期接種 GM 后能夠顯著抑制立枯絲核菌引起的黃瓜苗立枯病的發(fā)生 ， 接種菌根真菌后相比未接種處理發(fā)病率下降 785%， 并且病害的發(fā)病程度也更輕 。目前 ， 能夠解釋 AMF 真菌抑制土傳病原物提高植物抗病性的作用機制主要包括改善植物營養(yǎng) 、改變根系形態(tài)結構 、與病原物競爭光合產(chǎn)物和侵染位點改變菌根圍內微生物區(qū)系組成激活植物防御機制等方面 12。本試 驗 于播種接菌培養(yǎng) 27 d 后對黃瓜幼苗進行接病處理 ， 當時菌根真菌已侵染植物生成叢枝菌根 ， 侵染率達到 20% 以上 ， 菌根的作用已經(jīng)完全可以發(fā)揮 。已有試驗證明 12， 內生菌根真菌誘102 華 北 農(nóng) 學 報 29 卷導植 物 對病原物防御能力的增加或導致植物感病性下降需要在病原物進攻之前就已經(jīng)形成菌根且發(fā)育良好 ， 這可能是因為內生菌根真菌和病原真菌都是在植物根系皮層細胞內和細胞間發(fā)展 ， 因此存在對植物光合產(chǎn)物和生存空間的競爭 。病原菌的侵染影響了菌根真菌和寄主植物的互作 ， 接種病原菌后菌根侵染率下降 ， 后期侵染率上升并達到未接病處理的侵染水平 。這可能是由于病菌侵染植物后初期與菌根真菌競爭侵染位點 ， 而病菌侵染植物根系過程中破壞了植物根系的細胞結構 ， 有利于菌根真菌菌絲侵入細胞 。接種菌根真菌后促進了黃瓜幼苗的生長 ， 增加了黃瓜幼苗的干物重 、株高 、莖粗 ， 使植物更加強壯 ，能夠更好地抵御病原菌對植物的侵染 ， 從而減輕植株病害的發(fā)生 。Fridovich 13， Dhindsa 14等提 出 生物自由基理論解釋膜傷害現(xiàn)象 ， 膜脂的過氧化作用作為自由基對植物膜系統(tǒng)傷害的原初機理已得到普遍認可 。在酶促反應系統(tǒng)中 ， SOD 是最主要的成員之一 ， 能有效地清除氧自由基而對細胞起保護作用 ， 因此是植物體內防御酶系統(tǒng)的關鍵酶之一 15。SOD 是活性氧清除反應過程 中第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶 ， 在抗氧化酶類中處于核心地位 。試驗結果表明 ， 在受到病原菌侵染后未接種菌根真菌的植株的 SOD 活性迅速升高 ， 接種菌根菌處理的 SOD 活性高峰比未接種處理晚 4 5 d， 表明未接種菌根菌處理對病原菌的侵染更敏感 ， 活性變化更迅速 ， 因此 ， 在相同的接種時間下 ， 未接種菌根真菌的處理更容易受到病原菌的侵染 。MDA 作為膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物 ， 它的含量是膜脂過氧化程度的一個重要標志 ， 而且與細胞膜的損害程度直接相關 。試驗結果表明 ， 寄主在受到病原菌侵染后 ， 接種菌根真菌的植株體內 MDA含量比對照的增加比率明顯低于未接種處理 ， 這表明寄主在染病早期 ， 接種菌根真菌細胞受傷害程度低于感病品種 。在病原菌的脅迫下 ， 寄主體內 MDA的含量作為一個抗性指標有重要的參考價值 。PAL 是苯丙烷類代謝途徑中的關鍵酶和限速酶 ， 由于該途徑的中間代謝產(chǎn)物如酚類物質以及終產(chǎn)物如木質素等與植物防御病原菌侵染有關 ， 所以PAL 常被作為植物抗病性的生化指標 15。本試 驗結 果表明 ， 在病原菌侵染初期 ， 接種菌根真菌處理的PAL 活性顯著高于未接種處理 ， 隨著侵染時間的增長 PAL 活性逐漸下降 ， 但始終高于對照 ， 說明接種菌根真菌的處理在病菌侵染初期就具有較高的 PAL活性 ， 這對抵御病原菌的侵染起到了一定的作用 ， 而未接種菌根菌處理 PAL 活性對病原菌的侵染不敏感 ， 在接病后 3 d 才達到活性高峰 。本試驗可以看出 ， 接種菌根真菌后能夠降低黃瓜幼苗立枯病的發(fā)病率 。在病害發(fā)生前菌根真菌已經(jīng)與寄主植物互利共生 ， 提前啟動了抵抗病害得相關機制 ， 如增強植株生長 ， 保護酶活性的提高 。在病害發(fā)生過程中菌根真菌與病原菌互相競爭 ， 抑制病菌對寄主的侵害 ， 表現(xiàn)在活性氧清酶活性對病菌侵染相對不敏感 ， 膜脂過氧化程度較低 ， 細胞膜受損害程度較小 。菌根真菌提高植物抗病性是一個復雜的作用過程 ， 本試驗只從一個方面進行的解釋 ， 其具體作用機理還有待于我們進一步去研究 。參考文獻 : 1 周 而 勛 ， 葉 永武 ， 林如泉 拮抗菌的篩選及其對黃瓜苗期立枯病的防治作用 J 廣東農(nóng)業(yè)科學 ， 2000( 1) :44 46 2 樓兵干 ， 張 炳欣 ， 胡利強 腐霉對甲霜靈抗性測定及其生物防治 J 植物保護學報 ， 2001， 28( 1) : 55 60 3 Dehne H W Interaction between vesicular-arbuscular my-corrhizal fungi and plant pathogens J Phytopathology，1982， 72: 1115 1119 4 Linderman G ole of VAM fungi in biocontrol M / /Pfleger F L， Linderman G APS Press: Mycorrhizae andPlant Health St Paul USA， 1994: 1 26 5 Huang J W， Sun S K 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