利用改良SOE_PCR技術(shù)定點(diǎn)突變TuMVC4_VPg基因_李國亮.pdf

利用改良 SOE-PCR 技術(shù)定點(diǎn)突變 TuMV C4-VPg 基因李國亮 錢 偉 張淑江 李 菲 章時(shí)蕃 張 慧 謝露露 武 劍 王曉武 孫日飛*（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）摘 要 ：蕪菁花葉病毒（ Turnip mosaic virus，TuMV）是白菜類蔬菜生產(chǎn)上的重要病害，其中 TuMV VPg 基因在 TuMV 侵染白菜類蔬菜的過程中起著至關(guān)重要的作用，且不同 TuMV 株系的致病性不同。本試驗(yàn)采用改良的重疊延伸 PCR（SOE-PCR）技術(shù)，以 TuMV C4-VPg 基因序列為模板，定點(diǎn)突變 TuMV C4-VPg 與 TuMV CDN1-VPg 基因間 5 個差異核苷酸位點(diǎn)（決定 5個氨基酸差異）。結(jié)果表明：通過 SOE-PCR 技術(shù)獲得了 5 個 TuMV C4-VPg 基因的單點(diǎn)突變體，即 TuMV C4-VPg-、TuMVC4-VPg-、TuMVC4- VPg-、TuMVC4- VPg-和 TuMVC4- VPg- 。關(guān)鍵詞 ：白菜類蔬菜；蕪菁花葉病毒； VPg 基因；重疊延伸 PCR 技術(shù)；單點(diǎn)突變的互作，但 eIF4E 其他位置的突變對二者的互作沒有影響。由此可知，關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的變化對其功能的表達(dá)具有重要的影響，通過重疊延伸PCR技術(shù)（splicing byoverlapextensionPCR，SOE-PCR），可以快速、高效地獲得單點(diǎn)突變體，為驗(yàn)證關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的功能奠定基礎(chǔ)。重疊延伸PCR技術(shù)利用具有互補(bǔ)末端的特定引物，將兩條PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，在下一輪的擴(kuò)增反應(yīng)中，通過重疊鏈延伸來實(shí)現(xiàn)不同片段的拼接（熊愛生 等，2000；帥勇 等，2009）。該技術(shù)不需要限制性內(nèi)切酶和連接酶的處理（Horton etal.，1989；Senanayake &Brian，1995），也不受突變位置及突變類型的限制，可以在DNA的任何位點(diǎn)插入突變（Urbanetal.，1997；Gangetal.，2011）。重疊延伸PCR技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用。翟玲等（2012）利用重疊延伸PCR技術(shù)，對 LacZ報(bào)告基因的一些位點(diǎn)隨機(jī)插入目標(biāo)內(nèi)含子，再對LacZ 報(bào)告基因的活性進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明該方法與In-Fusion克隆相比有一定的優(yōu)越性；李諾敏等（2013）利用重疊延伸 PCR 技術(shù)，對人 tau 基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得 tau 基因的 6 種同工異構(gòu)體的克隆，進(jìn)而在蛋白水平上驗(yàn)證了 tau 蛋白表達(dá)。該技術(shù)無需利用限制性內(nèi)切酶，可以對基因的多個null李國亮，博士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：li_guo_liang 126.com* 通訊作者（Corresponding author）：孫日飛，研究員，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：sunrifeicaas.cn收稿日期：2017-07-11；接受日期：2017-08-30基金項(xiàng)目 ：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372069），“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD01B04-03），農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目蕪菁花葉病毒（ Turnip mosaic virus，TuMV）屬于馬鈴薯Y病毒科Y病毒屬，是白菜類蔬菜生產(chǎn)上的主要病害之一。TuMV VPg 蛋白是一種多功能蛋白，共價(jià)連接在病毒 RNA 的 5末端，類似帽子結(jié)構(gòu)，在病毒復(fù)制的過程中起重要作用（Miyoshi etal.，2008），可與寄主擬南芥的翻譯起始因子 eIF（ iso） 4E 互作，調(diào)控病毒 RNA 翻譯的起始（Dupratetal.，2002）。Gallois 等（2010）通過酵母雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)寄主翻譯起始因子 eIF（ iso） 4E 可以與VPg 蛋白互作，通過調(diào)控病毒翻譯的起始，從而對病毒的侵染產(chǎn)生干擾（Wittmann etal.，1997），在擬南芥 eIF（ iso） 4E 基因的帽結(jié)合蛋白中，將第46 位和第 92 位氨基酸 Trp 突變?yōu)?Leu 后， eIF（ iso）4E 就不能與病毒 VPg 互作（Miyoshi etal.，2006）；Dinkova 等（2016）發(fā)現(xiàn)辣椒 eIF4E 的第 94 位和第107 位氨基酸突變后，將影響 TuMV VPg 與 eIF4E39新優(yōu)品種栽培管理本期視點(diǎn)產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES2017（10）：39-44位置進(jìn)行剪切和連接，具有很大的靈活性和簡便性。重疊延伸PCR技術(shù)即在體外定點(diǎn)突變基因位點(diǎn)，是一種獲得單點(diǎn)突變基因的技術(shù)。蕪菁花葉病毒（TuMV）侵染白菜類蔬菜后，TuMV VPg 蛋白通過與白菜翻譯起始因子 eIF（ iso） 4E 互作，促進(jìn)病毒自身的增殖。為了進(jìn)一步闡明不同 TuMV 株系間VPg 基因的差異對 TuMV 致病性的影響，本試驗(yàn)采用改良的重疊延伸 PCR 技術(shù)，以 TuMV C4-VPg 基因?yàn)槟０澹c(diǎn)突變核苷酸，克隆了 5 個單點(diǎn)突變基因，以期為揭示特定氨基酸位點(diǎn)對病毒致病機(jī)制的影響奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料試驗(yàn)于 2016 年 9 月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所分子遺傳實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。TuMV C4株系、大腸桿菌 trans5 菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所白菜育種課題保存。質(zhì)粒小提試劑盒、DNAMarker、DNA Polymerase、DNA 回 收 試 劑 盒購自天根生化科技（北京）有限公司；克隆載體pEASY-T1CloningKit 購自全式金（北京）有限公司；卡那霉素購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限 公司。1.2 重疊延伸 PCR 引物設(shè)計(jì)及第 1 輪 PCR 反應(yīng)體系重疊延伸PCR引物設(shè)計(jì)遵循常規(guī)引物設(shè)計(jì)原則，突變堿基位于引物中央偏3端，引物長度 0 bp 左右為佳，引物過短不利于 2 個長片段的融合。在每個差異核苷酸位點(diǎn)處分別設(shè)計(jì)正、反向引物。TuMVC4-VPg 和 TuMV CDN1-VPg 氨基酸序列存在5個差異位點(diǎn)，分別標(biāo)記為、，分別設(shè)計(jì) 5 對引物，即 bioC4-R/F、bioC4-R/F、bioC4-R/F、bioC4-R/F 和 bioC4-R/F（表 1），TuMV C4-VPg 基因的兩端引物分別為bio120213/bio120214。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。第1輪重疊延伸PCR反應(yīng)體系為 50 L，其中包括 10×PCR 緩沖液 5 L，0.8mmol·L-1dNTPs4L，1.0 mol·L-1上、下游引物各 1L，50ng·L-1模板 DNA5L，1U Taq 酶1L，ddH2O 補(bǔ)齊 50 L。PCR 反應(yīng)程序：94 變性 5 min；94 變性 30 s，55 退火 30 s，72 延伸 30 s，35 個循環(huán)。利用 2% 瓊脂糖凝膠電泳對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，利用 TIANGEN 膠回收試劑盒對目標(biāo)長度條帶進(jìn)行切膠回收。表 1 重疊延伸 PCR 引物引物名稱 引物序列（5-3）bio120213 CCCATATGATGGCGAAAGGCAAGAGGCbio120214 CCCCGGGTCACTCGTGGTCCACTGGGAbioC4-R GTTTTTGTGTCCGAGACCACGTGTCCTGCbioC4-F GCAGGACACGTGGTCTCGGACACAAAAACbioC4-R CCAAAGTGCTTTTGCACAAGGGTGATGTCbioC4-F GACATCACCCTTGTGCAAAAGCACTTTGGbioC4- -R GCAAGTTCATTCTTATGTCACCAAAGTGCbioC4- -F GCACTTTGGTGACATAAGAATGAACTTGCbioC4- -R CTCCCCGAGCAAGTCCATTCTTATGTTACCbioC4- -F GGTAACATAAGAATGGACTTGCTCGGGGAGbioC4- -R GTCTTATTCATACGTACTTCATTTGGATCCAGCbioC4- -F CGAGCTGGATCCAAATGAAGTACGTATG1.3 重疊延伸 PCR 技術(shù)過程解析重疊延伸PCR技術(shù)利用變異位點(diǎn)處正、反向引物以及該基因兩端引物進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物形成包含overlap的重疊鏈；在第2輪PCR擴(kuò)增中，通過overlap重疊鏈的延伸，可以將重疊鏈連接起來，如圖1所示。以TuMV C4-VPg質(zhì)粒為模板，進(jìn)行第 1 輪 PCR 擴(kuò)增。TuMV C4-VPg 和 TuMV CDN1-VPg 氨基酸序列存在 5 個差異位點(diǎn)，將 VPg 基因序列分為 6 個片段，分別為 P1、P2、P3、P4、P5、P6，以 TuMVC4- VPg 質(zhì)粒為模板，以 bio120213/bioC4-R 和 bioC4-F/bio120214組合為引物，分別擴(kuò)增短片段 P1和P23456。利用 2% 瓊脂糖凝膠電泳分別對 P1和P23456的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測鑒定，并利用 TIANGEN 膠回收試劑盒回收目標(biāo)條帶DNA，等比例混合。取上述混合 DNA 為模板，以 bio120213/bio120214 為引物，擴(kuò)增包含第 1 個突變位點(diǎn)的 P1-23456片段。第2 輪 PCR 反應(yīng)體系亦為 50L，其中包括 10×PCR緩 沖 液 5 L，0.8 mmol·L-1dNTPs4L，1.0mol·L-1上、下游引物各1 L，兩端片段PCR圖 1 重疊延伸 PCR 擴(kuò)增示意圖40新優(yōu)品種栽培管理本期視點(diǎn)產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES產(chǎn)物都調(diào)至 100 ng·L-1，各取 5 L，1 UTaq 酶 1L，ddH2O 補(bǔ)齊 50 L。PCR 反應(yīng)程序：94 變性 5 min；94 變性 30 s，5065 退火（當(dāng)兩條片段融合時(shí)，通過設(shè)置退火溫度梯度，尋找最合適的退火溫度）30 s，72 延伸 40 s，35 個循環(huán)。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，回收的DNA片段作為目標(biāo)基因與 pEASY-T1 載體重組，均勻涂抹在固體 LB 培養(yǎng)基上，37 過夜培養(yǎng) 12 h。挑取若干單菌落，重懸在 1 mL 液體 LB 培養(yǎng)基中，在 37 、200r·min-1的搖床上搖菌4 h。取3 L菌液為 模板，以 bio120213/bio120214 為引物，進(jìn)行 PCR鑒定?？寺≥d體過程參考全式金（北京）有限公司關(guān)于克隆載體 pEASY-T1CloningKit 的操作指南。2 結(jié)果與分析2.1 TuMV CDN1-VPg 與 TuMV C4-VPg 氨基酸差異位點(diǎn)分析利 用 DNAMAN 5.0 軟 件 對 TuMV C4-VPg 和TuMVCDN1-VPg 氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)二者存在5個差異氨基酸位點(diǎn)，即第52位異亮氨酸I/亮氨酸L，二者同為非極性疏水性氨基酸；第97位谷氨酸E/賴氨酸K，前者為酸性氨基酸，后者為堿性氨基酸；第101位和第105位天冬酰胺N/天冬氨酸 D，前者為極性氨基酸，后者為酸性氨基酸；第 117 位異亮氨酸 I/ 纈氨酸 V，二者都為非極性疏水性氨基酸（圖 2）。圖 2 TuMV CDN1/C4-VPg 氨基酸序列比對結(jié)果2.2 利用改良 SOE-PCR 技術(shù)定點(diǎn)突變 TuMV C4-VPg- 基因經(jīng)過序列比對，TuMVC4-VPg 與 TuMVCDN1-VPg 蛋白間存在 5 個氨基酸差異位點(diǎn)，在這 5 個差異氨基酸位點(diǎn)所對應(yīng)的核苷酸位點(diǎn)處，設(shè)計(jì)正、反向引物（表 1），即 bioC4-R/F、bioC4-R/F、bioC4-R/F、bioC4-R/F 和 bioC4-R/F。第 1 輪 PCR 擴(kuò)增獲得 P1（160bp）和 P23456（448bp），第2輪PCR擴(kuò)增獲得P1-23456，即 C4 VPg- （576 bp）。兩輪 PCR 擴(kuò)增后，將獲得的 PCR 產(chǎn)物通過 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)在退火溫度為53的 PCR 反應(yīng)體系中，可以獲得目標(biāo)片段長度的產(chǎn)物（圖3）。同時(shí)，通過梯度PCR儀，分別找到適于 TuMV C4-VPg 另外4個差異位點(diǎn)的退火溫度，分別為 58、50、55、55。第2輪PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定，采用天根膠回收試劑盒對目標(biāo)長度的條帶進(jìn)行切膠回收純化（由于第 2 輪PCR 反應(yīng)中會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，所以此時(shí)不宜用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，應(yīng)該通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切取目標(biāo)長度的條帶進(jìn)行回收），純化產(chǎn)物連接到 pEASY-T1 載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌trans 5。挑取2個陽性克隆菌液送美吉生物科技有限公司進(jìn)行Sanger測序檢測。通過上述方法，圖 3 P1、 P23456以及 C4 VPg- 目標(biāo)片段電泳檢測結(jié)果M，Mark 。41新優(yōu)品種栽培管理本期視點(diǎn)產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES分別對 TuMV C4/CDN1-VPg 基因序列存在的5個核苷酸差異位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，經(jīng)過Sanger測序檢測，5 個突變位點(diǎn)均達(dá)到預(yù)期要求，獲得 5 個單點(diǎn)突變體即 TuMVC4- VPg-、TuMVC4- VPg- 、TuMVC4-VPg-、TuMV C4-VPg-和 TuMV C4-VPg-（圖 4）。3 結(jié)論與討論Rusholme 等（2007）利用大白菜抗 / 感病親 本，定位克隆了 retr01 與 ConTR01 基因，其中retr01 為隱性抗病基因， ConTR01 為顯性抗病基因，這2個基因分別位于R4和R8染色體上，共同控制 TuMV CDN1 株系；Qian 等（2013）以大白菜感病材料極早春和抗病材料 BP8407 為親本，采用 BSA 法，通過篩選 SSR 和 InDel 標(biāo)記，最終定位克隆 retr02 基因，該基因?yàn)殡[性抗病基因，具有廣譜抗性，尤其對TuMV C4株系表現(xiàn)高度抗性。白菜類蔬菜中不同的抗病毒基因?qū)?TuMV 不同株系的抗性也不一樣，通過探究TuMV CDN1與C4株系間的差異，可以為揭示白菜類蔬菜抗病毒基因的抗病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。李國亮等（2017）通過酵母雙雜交試驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)表明：TuMV-C4 與白菜 eIF（ iso）4E.a 可以相互作用，而與白菜 eIF（ iso） 4E.c 不能相互作用；TuMV-UK1 與白菜 eIF（ iso） 4E.c 可以相互作用，而與白菜 eIF（ iso） 4E.a 不能相互作用，通過對 TuMV-UK1 VPg 與 TuMV-C4 VPg 氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)二者間存在4個氨基酸差異位點(diǎn)，且相對集中，分別是第 89 位（F/L）、第 105 位 （N/D）、第 114 位（P/S）和第 119 位（M/V）氨基酸，因此推測，某個關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的變化可以影響其圖 4 5 個單點(diǎn)突變體基因的測序檢測，TuMVC4- VPg-；，TuMVC4- VPg-；，TuMVC4- VPg-；，TuMVC4- VPg-；，TuMVC4- VPg- 。功能的表達(dá)。重疊延伸PCR技術(shù)可以在體外定點(diǎn)突變核苷酸，制備單點(diǎn)突變體用于其功能研究，該技術(shù)已有很多報(bào)道，但其反應(yīng)體系尚待優(yōu)化。雒麗娜等（2012）采用重疊延伸PCR技術(shù)，以重組的人組織型纖溶酶原激活劑 r PA 基因?yàn)槟０?，成功?shí)現(xiàn) 3 個位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，為 r PA 基因的進(jìn)一步克隆和功能研究奠定了基礎(chǔ)。孟祥平等（2013）通過優(yōu)化中間引物互補(bǔ)長度、SOE-PCR 體系的模板濃度、起始模板的純度以及循環(huán)次數(shù)等條件，成功獲得特異性強(qiáng)和保真度高的 BTRCP-Cyp A 融合基因。常規(guī)獲得一段 DNA 的方法包括限制性內(nèi)切酶直接分離法、文庫篩選法、體外擴(kuò)增法和人工合成法等?；蚬δ艿难芯客杏谄渲械娜舾蓚€堿基變化，重疊延伸PCR技術(shù)對于研究體外基因突變的功能，提供了一種有利的方法。在該技術(shù)過程中經(jīng)常出現(xiàn)擴(kuò)增條帶彌散和非特異性擴(kuò)增等情況，因此需要整理一個優(yōu)化的技術(shù)流程，來快速、準(zhǔn)確地定點(diǎn)突變基因。重疊延伸PCR依據(jù)兩條模板鏈中間的overlap進(jìn)行重疊，互為模板進(jìn)行延伸，因此overlap長度對第2輪PCR擴(kuò)增比較重要，建議中間引物長度為 30 bp 左右，引物過短容易出現(xiàn)擴(kuò)增條帶彌散現(xiàn)象；引物中 GC 含量在 55% 以上，有利于第2輪PCR擴(kuò)增過程中兩段DNA片段融合；第2輪PCR擴(kuò)增前，應(yīng)將第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，避免第1輪PCR擴(kuò)增過程中剩余的中間42新優(yōu)品種栽培管理本期視點(diǎn)產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES引物對第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)生影響；在第2輪PCR擴(kuò)增過程中，模板過多或過少都易產(chǎn)生彌散或非特異擴(kuò)增，應(yīng)將第1輪PCR擴(kuò)增的兩組產(chǎn)物等量混合（各取 500 ng 左右，50 L 擴(kuò)增體系），作為第2輪PCR擴(kuò)增的模板；另外，在第2輪PCR擴(kuò)增過程中，通過設(shè)置退火溫度梯度，可以快速找到擴(kuò)增該位點(diǎn)的適宜退火溫度，節(jié)約時(shí)間。本試驗(yàn)通過梯度 PCR 儀，找到適于 TuMV C4-VPg5 個差異位點(diǎn)的退火溫度，分別為 53、58、50、55、55。隨著植物基因定位、克隆的不斷發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)野生型個體和突變型個體往往只在某個基因上有若干個堿基的變化，最終導(dǎo)致其表型的巨大變化，但目前植物體內(nèi)基因的定點(diǎn)突變技術(shù)受轉(zhuǎn)基因技術(shù)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)的影響，推廣比較困難。重疊延伸 PCR（SOE-PCR）技術(shù)是在植物體外對目標(biāo)基因定點(diǎn)突變，成本低、簡單易操作，可以高效用于驗(yàn)證目標(biāo)氨基酸位點(diǎn)的功能。隨著二代、三代高通量測序的成熟，對目標(biāo)基因上的SNP位點(diǎn)不斷深入挖掘，通過重疊延伸PCR技術(shù)，以SNP位點(diǎn)為橋梁，可以將基因定向轉(zhuǎn)化為單點(diǎn)突變體，為深入研究氨基酸位點(diǎn)的功能奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)李國亮，錢偉，張淑江，李菲，章時(shí)藩，張慧，謝露露，武劍，王曉武，孫日飛2017白菜翻譯起始因子 eIF（ iso） 4E.a/c 與蕪菁花葉病毒TuMV-C4/UK1蛋白互作分析園藝學(xué)報(bào)， 44（7）：1299-1308李諾敏，劉可夫，李靈蕓，何放，顧文彬，董一名，慶宏2013改進(jìn)重疊延伸PCR克隆 tau 基因6種同工異構(gòu)體北京理工大學(xué)學(xué)報(bào)，33（88）：871-875雒麗娜，王盛，王玉炯2012利用重疊延伸PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變研究安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，40（4）：719-722孟祥平，楊建英，喬曉嵐，梁玲霞，席守民2013優(yōu)化重疊延伸PCR條件構(gòu)建 BTRCP-CypA 融合基因生物技術(shù)，23（6）：51-54帥勇，胡興旺，易朵，王成，趙曉蒙，周暢2009重疊延伸 PCR法構(gòu)建小鼠 Sumf1 基因的定點(diǎn)突變真核表達(dá)載體生命科學(xué)研究，13（5）：430-436熊愛生，彭日荷，陳建民，李賢，姚泉洪2000透明顫菌血紅蛋白（ VHb）基因合成及原核生物中的效應(yīng)上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，16（3）：19-24翟玲，董娜，張雅慧，黃勇，周岳華2012不需酶切位點(diǎn)的重疊延伸 PCR 在克隆表達(dá)中的應(yīng)用南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：理科版，36（3）：273-276DinkovaTD，Martinez-Castilla L，Cruz-Espíndola MA2016The diversificationofeIF4EfamilymembersinplantsandtheirroleinthePlant-Virusinteraction/Hernández G，Rosemary JEvolution oftheProteinSynthesisMachineryandItsRegulationS.l.：SpringerInternationalPublishing：187-205DupratA，Caranta C，Revers F，Menand B，Browning KS，RobagliaC2002The Arabidopsiseukaryotic initiation factor（ iso）4E isdispensableforplantgrowthbutrequiredforsusceptibilitytopotyvirusesThePlantJournal，32（6）：927-934GalloisJL，Charron C，Sánchez F，Pagny G，Houvenaghel MC，MorettiA2010Single aminoacidchangesintheTurnip mosaic virusviralgenome-linkedprotein（ VPg）confer virulencetowardsArabidopsis thalianamutantsknockedoutforeukaryoticinitiationfactorseIF（ iso） 4Eand eIF（ iso） 4GJournal ofGeneralVirology，91（1）：288-293GangH，Wen Q，Gao Q，Zhang F，Bai Y2011An efficientandrapidmethodforcDNAcloningfromdifficulttemplatesusingcodonoptimizationandSOE-PCR：with humanRANKandTIMP2geneasexamplesBiotechnologyLetters，33（10）：1939-1947HortonRM，Hunt HD，Ho SN，Pullen JK，Pease LR1989Engineeringhybridgeneswithouttheuseofrestrictionenzymes：genesplicingbyoverlapextensionGene，77（1）：61-68MiyoshiH，SuehiroN，TomooK，MutoS，TakahashiT，TsukamotoT，OhmoriT，Natsuaki T2006Binding analysesfortheinteractionbetweenplantvirusgenome-linkedprotein（VPg）and planttranslationalinitiationfactorsBiochimie，88（3）：329-340MiyoshiH，Okade H，Muto S，Suehiro N，Nakashima H，Tomoo K，Natsuaki T2008 Turnip mosaic virusVPginteractswithArabidopsis thaliana eIF（ iso） 4EandinhibitsinvitrotranslationBiochimie，90（10）：1427-1434QianW，ZhangS，ZhangS，LiF，ZhangH，WuJ，WangX，SunR 2013Mapping andcandidate-genescreeningofthenovelTurnip mosaic virusresistancegeneretr02inChinesecabbage（ Brassica rapaL.）TheoreticalandAppliedGenetics，126（1）：179-188RusholmeRL，Higgins EE，Walsh JA，Lydiate DJ2007Geneticcontrolofbroad-spectrumresistancetoTurnip mosaic virusinBrassica rapa（Chinese cabbage）Journal ofGeneralVirology，88（11）：3177-3186SenanayakeSD，BrianDA1995PreciselargedeletionsbythePCR-basedoverlapextensionmethodMolecularBiotechnology，4（1）：13UrbanA，Neukirchen S，Jaeger KE1997A rapidandefficientmethodforsite-directedmutagenesisusingone-stepoverlapextensionPCRNucleicAcidsResearch，25（11）：2227WittmannS，Chatel H，F(xiàn)ortin MG，Laliberte J1997Interaction oftheviralproteingenomelinkedofTurnip mosaic viruswiththetranslationaleukaryotic initiation Factor（ iso） 4EofArabidopsis thalianausingtheYeastTwo-HybridsystemVirology，234（1）：84-9243新優(yōu)品種栽培管理本期視點(diǎn)產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES辣椒種質(zhì)資源 TMV 抗性的鑒定與評價(jià)秦 蕾 梁 燕*默 寧 張 洋 趙貴葉（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌712100）摘 要 ：對來源于國家蔬菜種質(zhì)資源中期庫的 51 份辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行煙草花葉病毒（TMV）的田間抗性調(diào)查。結(jié)果顯示，各種質(zhì)病情指數(shù)在 17.0475.56 之間，有 14 份種質(zhì)田間表現(xiàn)出了 TMV 抗性。各種質(zhì)抗性分布基本符合正態(tài)分布，略向感病區(qū)域偏離。將篩選出的 14 份抗病材料和 7 份感病材料進(jìn)行 TMV 苗期人工接種抗性鑒定，21 份種質(zhì)的病情指數(shù)在 6.2865.48之間，獲得抗病材料 15 份。相關(guān)分析結(jié)果表明，TMV 田間成株自然發(fā)病病情指數(shù)與苗期人工接種鑒定病情指數(shù)的相關(guān)系數(shù)r=0.789，呈極顯著相關(guān)。結(jié)合田間抗性調(diào)查和人工接種抗性鑒定結(jié)果，利用 12 對與 L 基因連鎖的分子標(biāo)記對 13 份 TMV 抗病種質(zhì)進(jìn)行分子鑒定，6 份材料中共檢測到 6 個抗性分子標(biāo)記?？?TMV 辣椒種質(zhì)的主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)出一定的多樣性。關(guān)鍵詞 ：辣椒；種質(zhì)資源；TMV 抗性；鑒定素，常引起辣椒葉片壞死、枯斑、褪綠，植株矮化，落花、落果，對辣椒生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。目前，世界各地鑒定出侵染辣椒的病毒有 30 余種，其中煙草花葉病毒（ Tobacco mosaic virus，TMV）是威脅辣椒生產(chǎn)的主要病毒。TMV在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，尤其易感染煙草、番茄、辣椒等茄科作物。TMV主要通過植物種子和汁液摩擦傳毒，通過植物的維管組織，迅速侵染植株幼嫩組織，在葉片上產(chǎn)生淺綠或深綠色的秦蕾，女，博士研究生，主要從事辣椒 TMV 抗性基因挖掘與功能研究，E-mail：qinleinwsuaf.edu.cn* 通訊作者（Corresponding author）：梁燕，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事番茄遺傳育種及蔬菜種質(zhì)資源研究，E-mail：liangyannwsuaf. edu.cn收稿日期：2017-03-13；接受日期：2017-08-14基金項(xiàng)目 ：“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD01B04-14）辣椒（ CapsicumannuumL.）為茄科辣椒屬一年生或多年生植物，在全國20多個省、市、自治區(qū)都有栽培。病毒病一直是威脅辣椒生產(chǎn)的重要因Site-directed Mutagenesis of TuMV C4-VPg Gene by Optimized Splicing by Overlap Extension PCRLIGuo-liang，QIAN Wei，ZHANG Shu-jiang，LI Fei，ZHANG Shi-fan，ZHANG Hui，XIE Lu-lu，WUJian，WANGXiao-wu，SUNRi-fei*（ InstituteofVegetablesandFlowers， ChineseAcademyofAgriculturalSciences， Beijing100081， China）Abstract： Turnip mosaic virus（TuMV）was animportantdiseaseforBrassica rapaL.ssp.pekinensisproduction，and theTuMVVPggenehadplayedavitalroleinfectingproductionprocessWhile，the pathogenicityofdifferentTuMVstrainswasdiverseThis experimentadoptedimprovedsplicingbyoverlapextensionPCR（SOE-PCR）technology，took TuMV-C4VPggenesequenceastemplate，carried outsite-directedmutagenesison5differentsingle-nucleotidesbetweenTuMVC4-VPgandTuMVCDN1-VPg genesTheresultsindicatedthat5singlepointmutantsofTuMVC4-VPgwereobtainedbytheoptimizedSOE-PCR，i.e.TuMVC4-VPg- ，TuMVC4- VPg- ，TuMVC4- VPg- ，TuMVC4- VPg- andTuMVC4- VPg- Key words： Brassica rapaL.ssp.pekinensis； Turnip mosaic virus（TuMV）； VPg gene；Splicing byoverlapextensionPCR（SOE-PCR）；Singlepointmutant44新優(yōu)品種栽培管理本期視點(diǎn)產(chǎn)業(yè)市場病蟲防控 研究論文中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2017（10）：44-50