東方百合‘演員’DXS基因的克隆與表達(dá)分析_張浩宇.pdf

<p>西北 植 物學(xué)報 ，（）： 文章編 號 ：（） &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ：收稿 日 期 ：；修改稿收到日期 ：基金 項 目 ：山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目 （）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動項目 （）；山西省研究生教育改 革研究課題 （）作者簡 介 ：張浩宇 （），女 ，在讀碩士研究生 ，主要從事百合花香研究 。：通信作 者 ：杜方 ，博士 ，教授 ，主要從事花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新與育種研究 。：東方 百 合演員基因的克隆與表達(dá)分析張浩 宇 ，樊 俊苗 ，王婷 ，杜方（山西 農(nóng) 業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院 ，山西太谷）摘要 ：以東 方 百合 演員 花瓣為試驗材料 ，采用 技術(shù) ，克隆 得到百合 脫氧 木 酮糖磷酸合成酶基因的 全長，命名 為（登錄號 為 ）。序列分 析表明 ，基 因 序列全長 ，其中開放閱讀框包含 ，編碼個氨基 酸，相對分子量大小約為，等電點(diǎn) 為，化學(xué)式為 。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示 ，與獼猴桃和萬壽菊 聚為一 類，屬于型 ，是功能較保守的一類 。實 時熒光定量 結(jié) 果分 析表明 ，基因在不同品種百合花瓣中均有表達(dá) ，且濃 香 型百合 基因表達(dá)量比淡香型和無香型百合高 。該研究結(jié)果為百合 生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ) ，同時 也 為百合花香育種提供了理論依據(jù) 。關(guān)鍵詞 ：百合 ；脫氧木 酮糖磷酸合 成酶 ；表 達(dá)特 征中圖分類號 ：； 文獻(xiàn)標(biāo) 志碼 ： ， ， ， （ ， ， ，）： （） ， （ ） ， ， ， ， ， ：； （）； 萜類物 質(zhì)廣泛存在于自然界生物體內(nèi) ，大約有 種 ，構(gòu)成了 最大的天然產(chǎn)物家族。在高等植 物中 ，有些萜類物質(zhì)參與生理代謝活動 ，如光合作用 、呼吸作用和細(xì)胞周期控制等，有些萜 類化合物如丹參中的丹參酮類具有藥理活性，有些萜 類化合物為食品工業(yè)和化妝品工業(yè)的重要原料，同時低分子 量的萜類也是百合花香成分中的重要物質(zhì)。萜類物 質(zhì)合成途徑有位于質(zhì)體的甲基赤 藻 糖 醇磷 酸 （ ，）和位于 胞質(zhì)的甲羥戊酸 （，）兩條途 徑。脫氧木 酮糖磷酸合成 酶 （ ，）是途徑中 的關(guān)鍵酶，并且已 有研究表明其在擬南芥中發(fā)揮著限速酶作用，是萜類 次生代謝物質(zhì)等下游產(chǎn)物的一個關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn) 。百合作為主要的切花和盆花材料 ，在國內(nèi)外花卉市場占有重要地位。百合不 僅具有艷麗的色彩 ，還有豐富的香型 ，有墨香 、濃香 、甜香 、淡香以及無香。近年來 ，百合花香是學(xué)者研 究的一大熱點(diǎn) 。從揭 示 花 香 成 分、釋 放 器 官、散 發(fā) 規(guī)律到代謝 通路的挖掘以及相 關(guān)基因 、調(diào)控基因的克隆和原核 生物表達(dá)驗證，都取得 了突破性的進(jìn)展 。通常亞洲百合無香味 ，而東方百合香味濃烈 ，嚴(yán)重影響消費(fèi)者的購買欲 。因此 ，改良花香是育種家孜孜以求的育種目標(biāo) 。已有研究表明 ，與有香百合相比 ，無香百合中單萜類化合物的釋放量很低或根本檢測不到。因此 ，研究 百合單萜類花香物質(zhì)的代謝通路及其關(guān)鍵基因?qū)τ诮沂净ㄏ悴町惐举|(zhì)原因具有重要意義 。本研究采用技術(shù)從東 方百合 演員 （ ）花瓣中 克隆得到的全長 ，并對其 在不同香型百合品種間表達(dá)特征進(jìn)行了研究 ，為今后通過基因工程改良百合花香提供了理論依據(jù) 。 材料 和 方法 材料試 驗材 料 （表）種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院園藝站百合圃 。年月陸續(xù) 取不同品種百合盛開期花瓣 ，經(jīng)液氮速凍 ，保存 ，備用 。 方法 提取與第一鏈 合成使 用公 司 裂 解 液 ，采 用法 提 取 百 合 總。使 用生 物光度計檢測的 濃度 和純度 ，用瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量 ，按照試劑盒 說明反轉(zhuǎn)錄成。 基因的 克隆從核酸數(shù) 據(jù)庫中查詢獲得條百合序列信 息 ，登錄號為。分別設(shè) 計和引物 （表），以 演員 為模板 ，利 用表 引物 序 列 引 物 名 稱 引物序 列 （） &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;表 試驗用材料基本信息 編號 品種名 雜種系 香型 特 里昂 菲特 麝東百 合 甜香 完美 喇叭百 合 墨香 演員 東方百 合 濃香 八 點(diǎn)后 東方百 合 濃香 白夢 東方百 合 濃香 羅賓娜 東喇百 合 濃香 黃 色風(fēng) 暴 東喇百 合 濃香 金石 麝亞百 合 淡香 布林迪 西 麝亞百 合 淡香 佩 維亞 麝亞百 合 淡香 朱麗葉 新鐵炮 百合 淡香 羅馬廣 場 亞洲百 合 無香 小 珍珠 亞洲百 合 無香 西北植物學(xué)報卷公司試劑盒 進(jìn)行擴(kuò) 增 。反應(yīng)總 體系為，其中 ，×引物，（）引物， ，× ， 。擴(kuò)增條 件為 ：，個循環(huán) ；，個循環(huán) ，個循環(huán) 。瓊脂糖凝膠電泳檢測 ，切膠回收目的片段 ，加反應(yīng)按照天根加試劑的方法標(biāo)準(zhǔn)操作 。加后 ，連接 載 體（），轉(zhuǎn) 化 感 受態(tài) 細(xì)胞 （全式金 ），菌液驗 證后送 生工生物工程 （上海 ）股份有限公司測序 。利用軟件拼 接測序結(jié)果 ，得到編碼序列 。 生物信 息學(xué)分析利用（：）預(yù) 測分子 量 和 理 論 等 電 點(diǎn)。用在 線 軟 件（：）預(yù)測蛋白結(jié) 構(gòu)域。通過（：）在線軟 件進(jìn)行信號肽預(yù)測。用在線 軟件（：）分 析 蛋 白 質(zhì) 親 水 性 疏 水性 ；用 （：）在線軟 件對進(jìn) 行 跨 膜 性 分 析。用（： ）預(yù)測蛋 白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。用 軟件進(jìn) 行序列比對及翻譯 ，用軟件構(gòu) 建系統(tǒng)進(jìn)化樹。 實時熒 光定量分 析根據(jù) 已克隆的百合的序列分 析結(jié)果 ，設(shè)計熒光定量引物 ，比對確 定引物特異性 。分別以不同品種盛開期花瓣的為模板 ，以基因作 為內(nèi)參基因 ，反應(yīng)引物、見表。參照 杜方等的步驟 進(jìn)行熒光定量，研 究不 同品種百合基因表 達(dá)差異 ，每個試驗進(jìn)行次重復(fù) 。所得數(shù)據(jù)采用進(jìn)行平 均數(shù)統(tǒng)計 ，法計算相 對表達(dá)量 ，以 軟件進(jìn)行 方差分析 ，多 重比 較 ，利用 繪圖 。 結(jié) 果 與 分析 基因全 長的克隆通 過法 ，以東方 百合 演員 花瓣為模板 ，分 別進(jìn)行和擴(kuò)增 、克隆和測 序分析 ，獲得末端序列長度 ，獲得末端序列 長度 （圖），與預(yù)期 結(jié)果一致 。命名該基因為，登錄號 為。該基因 全長 ，其中包 含 ， 和開放 閱讀框 ，編碼個氨基酸 。通 過軟件翻 譯獲得基因編碼的氨基酸序列 （圖）。 蛋白結(jié) 構(gòu)分析預(yù)測氨 基酸序列中含有個功能結(jié)構(gòu)域 ，分別是端合 成結(jié) 構(gòu)域 、結(jié) 合結(jié) 構(gòu)域和轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域 （圖）。分析該 蛋白相對分子量為，理論等 電點(diǎn)為，化學(xué)式為，原子量。信號肽 結(jié)果分 析 表 明 ，不 屬 于 分 泌 蛋 白 。（ ）值為負(fù)值 ，表 明蛋白屬于親水性蛋白 。蛋白跨膜性分析顯示無跨膜區(qū)域 ，不屬于膜蛋白 。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示 ，其氨基酸組成螺旋 （）為個 （），延伸鏈 （）為個 （），轉(zhuǎn)角 （）為個（），無規(guī)則 卷曲為個 （）。 多序列比對與聚類分 析百合 演員 中克隆的基因分 別與已分離獲得的基因、序列一 致性都高達(dá)（圖），與無油 樟 （ ）、蔓花生 （ ）、黃芪 （ ）的 一 致 性 分 別 達(dá)、。用軟件對種可以產(chǎn)生萜類化合物的植物進(jìn)行聚 類分 析 ，結(jié)果表明所獲得的百合基因?qū)儆诘谝活惢?，是 較為保守的管家基因 （圖）。 百 合基因在品種間的表達(dá) 模式采用方 法檢 測在個百合品 種的表達(dá)情況 。由圖可知 ，在不同 品種中均有表達(dá) ，在濃香型東方百合 白夢 中表達(dá)量最高 ，在無香的亞洲百合 小珍珠 中最低 ；濃香型百合圖 基因 片 段 電泳圖 期張浩宇 ，等 ：東 方百合 演員 基因的克隆與表達(dá)分析為 起始 密碼子；為 終止 密碼子；粉色 、藍(lán)色和綠色箭頭分別表示 端 合 成結(jié) 構(gòu)域 （）、結(jié)合結(jié)構(gòu) 域 （）和轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域 （）在氨基酸序列中的起止位置圖 百 合 基因的核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列 ； ； ， ， ， （） （） 表達(dá)量 與淡香型和無香型之間差異顯著 ，但淡香型和無香型百合基因表達(dá)差異不顯著 ；同一香型百合之間基因表達(dá)差異也不盡相同 ，濃香型百合之間存在顯著差異 。在百合不同品種間的 表達(dá)量表明 ，不同品種百合花香的差異與基因表達(dá) 有關(guān) 。 討論萜類物 質(zhì)在植物生長調(diào)節(jié) 、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和自身防御等方面發(fā)揮重要作用。張輝秀 等研究表 明濃香型百合萜烯類釋放量最高 ，在淡香類中沒有檢測到 ，并且認(rèn)為其中兩種單萜成分是百合花致香的關(guān)鍵成分 。基因是 萜類物質(zhì)合成途 徑的第 一個關(guān)鍵酶基因 ，萜類含量與的表達(dá) 水平密切相關(guān)，目前已 在種植物中分離和克隆?；蜻^ 表達(dá)或干擾表達(dá)均能夠改變次生代 謝 物 質(zhì) 合 成 ，在 擬 南 芥 （ ）、胡 蘿 卜 （ ）、寬 葉 薰 衣 草（ ）和 獼 猴 桃 （）等植物 中都已進(jìn)行了初步功能驗證 。不同物種基因家 族成員數(shù)不同 ，以前的研究認(rèn)為酶 由個基 因編碼 ，基于測序的研 究表明 ，胡蘿卜和煙草 （ ）有中分 別有個和個 ，對于百合基因研究 甚少 ，目前 ，已知的百合家族成 員至少有個 ，前人只在 中獲得 部分序列，張騰旬 在東方百合 西伯利亞 品種中也克隆得 到個基 因全 長 ，屬 于型，但序列 信息尚未公布 。本研究通過技術(shù) ，克隆 了百合基因全長 ，并利 用生物信息學(xué)手段分析研究其編碼的蛋白特性 ，該蛋白具有親水性特點(diǎn) ，不屬于分泌蛋白 ，由此推測它只在質(zhì)體中發(fā)揮功能 。通過對基因的表達(dá)規(guī)律研究 ，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與器官 、花 、果實發(fā)育程度 、晝夜節(jié)律 、品種等有關(guān) 。研究表明在夜香 樹 （ ）葉片中 的表達(dá)量總體高于花器官。隨著花 朵開放級數(shù)和果實成熟 ，玫瑰花瓣和獼猴 桃果實中基因表達(dá)量逐級增加 。茉莉花 瓣中基因的 表達(dá)具有晝夜節(jié)律性。課題組 之前的研究表明 ，在百合 索 邦 花和鱗片中顯著高表達(dá) ，但只在 朱麗葉 花中顯著高表達(dá)。本研究發(fā) 現(xiàn) ，基因的表達(dá)水平與花香的 釋放呈現(xiàn)一定的規(guī)律 ，濃香型百合基因表達(dá)量顯著高于淡香型西北植物學(xué)報卷紅 色 部 分為 個序列不完全一致位點(diǎn) ；黑色方框中 為 起始 密碼子 ，方框中 為 終止 密碼子圖 百合 基因多序列比對 ； ， 圖 與其他 植物 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹 和無香 型百合 。的研究 結(jié)果表明 ，濃香型百合 比淡香 型 基因表達(dá) 量高，與本研 究結(jié)果一致 。本試驗主要從百合中分離獲得一個基因品種 名 稱同表 ；不同小寫字母代表不同品種的差異顯著性 （）圖 在不同品種百合的相對表達(dá)量 ； （） 期張浩宇 ，等 ：東 方百合 演員 基因的克隆與表達(dá)分析全長 ，對其 進(jìn)行了初步研究 ，發(fā)現(xiàn)屬于，是 功能 較為保守的一類 ，分析了該基因在不同品種中的表達(dá)模式 ，推測在百合 花香萜類化合物合成途徑中起重要作用 ，后期需進(jìn)一步對百合基因家 族成員數(shù)目 、分類和功能以及在百合花香代謝調(diào)控中的作用機(jī)制進(jìn)行研究 ，對于明確花香差異的本質(zhì)原因 ，以及利用現(xiàn)代生物育種技術(shù)改良百合花香具有一定的意義 。參考文獻(xiàn) ： ， ， ， ： ，（）：趙恒偉 ，葛鋒 ，孫穎 ，等 植物萜類物質(zhì) 生物合成的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用前景 中草藥 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： 馬 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) ，龐 瀟卿 ，諶容 ，等 萜類化合物生物合成途徑中關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展 杭州師范大學(xué)學(xué)報 （自然科學(xué)版 ），（）： ， ， ， （ ），（）：唐彪 ，胡增輝 ，冷 平生 ，等 濃香型和淡香型百合單萜合酶基因差異表達(dá) 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ， ，（）： ， ， ， ， ， ，： ， ，： ， ， ， ，（）： 陳莉 ，辛海波 ，李 曉艷 ，等 百合 基因的克隆與表達(dá)分析 林 業(yè)科學(xué) ，（）： ， ， ， ，（）：杜方 百合引種栽培及分 子研究 北京 ：中國林業(yè)出版社 ，：范燕萍 ，范 麗琨 不同類型百合花瓣揮發(fā)性香氣成分分析中 國園 藝學(xué)會觀賞園藝專業(yè)委員會年學(xué)術(shù) 年會 張輝秀 ，胡 增輝 ，冷平生 ，等 不同品種百合花揮發(fā)性成分定性與定量分析 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ： ，： ， ， ， ，（）：張 輝秀 ，冷 平生 ，胡增輝 ，等 西伯利亞 百合花香隨開花進(jìn)程變化及日變化規(guī)律 園藝學(xué)報 ，（）： ， ， ， ，（）：孔瀅 ，孫明 ，潘會堂 ，等 花香代謝與調(diào)控研究進(jìn)展 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報 ，（）： ， ， ， ，（）：李 路路 ，王歡 ，孫明 ，等 岷江百合單萜合酶基因克 隆與表達(dá)分析 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報 （自然科學(xué)版 ），（）： ， ， ， （ ），（）：王歡 百合苯甲酸甲酯代謝相關(guān) 基因 的 克隆與分析 北京 ：北京林業(yè)大學(xué) ，李紹翠 ，姜 新強(qiáng) ，丁愛琴 ，等 月季 基因的 克隆及表西北植物學(xué)報卷達(dá)特 征 分析 華北農(nóng)學(xué)報 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ： ， ，（ ）： ， ， ， ： ，（）：徐麗 ，陳新 ，宗曉娟 ，等 甜 櫻桃砧木 基 因 的 克隆與分析 核農(nóng)學(xué)報 ，（）： ， ， ， ，（）：董慧霞 ，理 永霞 ，賈秀貞 ，等 楊樹 基因的克隆與分析西北 農(nóng) 林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版 ），（）：， ， ， ， （ ），（）：，趙佳 ，劉榮 ，等 月季花青素苷相關(guān) 蛋 白基 因的克隆和表達(dá)分析 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）： ， ， ，（）： 杜方 ，樊 俊苗 ，王婷 ，等 百合品種和器官中花香和抗性基因 的表達(dá)模式 分子植物育種 ，（）： ， ， ， </p>