甜瓜尾孢葉斑病病原分離與鑒定.pdf

<p>49 卷 南 方 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) · 476 · 0 引言 【 研 究 意 義 】 甜 瓜 是 葫 蘆 科 黃 瓜 屬 （Cucumis Linn. ） 一 年 生 蔓 生 草 本 植 物 ， 分 為 薄 皮 甜 瓜 和 厚 皮 甜 瓜 兩 大 類 型 。 厚 皮 甜 瓜 （ 包 括 哈 密 瓜 、 白 蘭 瓜 和 粗 皮 甜 瓜 等 ） 原 產(chǎn) 非 洲 和 亞 洲 熱 帶 地 區(qū) ， 我 國 新 疆 為 厚 皮 甜 瓜 次 生 起 源 中 心 之 一 。 廣 西 引 進(jìn) 厚 皮 甜 瓜 種 植 始 于20 世 紀(jì)90 年 代 中 期 ， 并 于1998 年 開 始 通 過 改 用 大 棚 保 護(hù) 地 避 雨 栽 培 試 種 獲 得 成 功 ， 2003 年 后 種 植 面 積 迅 速 擴(kuò) 大 ， 常 年 種 植 總 面 積 約4000 ha ， 種 植 甜 瓜 已 成 為 廣 西 部 分 瓜 農(nóng) 脫 貧 致 富 的 重 要 途 徑 。 由 于 廣 西 的 氣 候 高 溫 多 雨 ， 大 棚 內(nèi) 濕 度 大 ， 加 上 大 棚 栽 培 難 以 實(shí) 施 輪 作 ， 致 使 大 棚 甜 瓜 生 產(chǎn) 受 到 多 種 病 害 的 威 甜瓜尾孢葉斑病病原分離與鑒 定 葉云峰 1 ， 杜嬋娟 2 ，覃斯華 1* ，柳唐鏡 1 ，洪日新 1 ，付 崗 2* ， 李 桂芬 1 ， 黃金艷 1 （ 1 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所 ， 南寧 530007； 2 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所 ， 南寧 530007 ） 摘要 ： 【 目的 】 明確近 年來引 起廣西 大棚厚 皮甜瓜 葉斑病 的病原 ， 為該病 害的有 效防治 提供參 考依據(jù) 。 【 方法 】 采用 單 孢 分 離 法 直 接 從 罹 病 厚 皮 甜 瓜 葉 片 上 分 離 病 原 菌 ， 以 離 體 葉 片 接 種 法 驗(yàn) 證 病 原 菌 的 致 病 性 。 對(duì) 致 病 菌 的 菌 落 、 產(chǎn) 孢 結(jié) 構(gòu) 、 分 生 孢 子 等 形 態(tài) 特 征 進(jìn) 行 觀 察 ， 同 時(shí) 對(duì) 致 病 菌 的rDNA-ITS 基 因 序 列 進(jìn) 行 同 源 性 比 對(duì) 分 析 。 【 結(jié) 果 】 病 原 菌 形 態(tài) 特 征 與 瓜 類 尾 孢 （Cercospora citrullina ） 基 本 一 致 ， rDNA-ITS 基 因 序 列 與 瓜 類 尾 孢 的 同 源 性 達(dá)99% 。 結(jié) 合 病 原 菌 的 形 態(tài) 學(xué) 和 分 子 生 物 學(xué) 特 征 ， 將 該 病 害 的 病 原 菌 鑒 定 為 瓜 類 尾 孢 。 【 結(jié) 論 】 近 年 在 廣 西 大 棚 厚 皮 甜 瓜 產(chǎn) 區(qū) 嚴(yán) 重 發(fā) 生 的 甜 瓜葉斑病由瓜類尾孢引起 ， 該病是廣西厚皮甜瓜上的一種新病害 。 關(guān)鍵詞： 甜瓜；葉斑病； 病原鑒定 ； 瓜類 尾孢 中圖分類號(hào)：S436.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 ： A 文章編號(hào)： 2095-1191 （2018 ） 03-0476-05 收稿日期 ： 2017-09-19 基 金 項(xiàng) 目 ： 廣 西 創(chuàng) 新 驅(qū) 動(dòng) 發(fā) 展 專 項(xiàng) 資 金 項(xiàng) 目 （ 桂 科AA17204097 ） ； 廣 西 科 學(xué) 研 究 與 技 術(shù) 開 發(fā) 計(jì) 劃 項(xiàng) 目 （ 桂 科 能1598025-47 ） ； 廣 西 農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目 （ 桂農(nóng)科2017JM17 ） ； 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)項(xiàng)目 （2015YT49 ） 作 者 簡 介 ： * 為 通 訊 作 者 ： 覃 斯 華 （1977- ） ， 副 研 究 員 ， 主 要 從 事 西 甜 瓜 育 種 與 栽 培 研 究 工 作 ， E-mail ：nkyqsh163.com ； 付 崗 （1979- ） ， 博 士 ， 副 研 究 員 ， 主 要 從 事 植 物 病 害 防 治 研 究 工 作 ， E-mail ：fug110gxaas.net 。 葉 云 峰 （1978- ） ， 博 士 ， 副 研 究 員， 主要從事西甜瓜病蟲害防治研究工作， E-mail ：yeyunfeng111126.com Isolationandidentificationofpathogencausing Cercospora leafspotofmuskmelon YEYun-feng 1 ，DUChan-juan 2 ，QINSi-hua 1* ，LIUTang-jing 1 ，HONGRi-xin 1 ， FUGang 2* ，LIGui-fen 1 ，HUANGJin-yan 1 （ 1 HorticulturalResearchInstitute ，GuangxiAcademyofAgriculturalSciences ，Nanning 530007 ，China ； 2 Plant ProtectionResearchInstitute ，GuangxiAcademyofAgriculturalSciences ，Nanning 530007 ，China ） Abstract ： 【Objective 】 ThepathogencausingleafspotdiseaseonmuskmeloningreenhouseinGuangxiinrecentyears was clarified to provide reference for the effective control of the disease. 【Method 】 The pathogenic fungi were isolated by single spore isolation method from leaves of diseased muskmelon. The pathogenicity of pathogenic fungi was verified by inoculation of detached leaves. Furthermore ，the colony ，conidiophores and conidia characteristics of the pathogen were observed.HomologyanalysisonrDNA-ITSgenesequencesofthepathogenicfungiwasconducted. 【Result 】 Themorpho- logical characteristics of the pathogen were consistent with Cercospora citrullina. And its rDNA-ITS gene sequences showed 99% similarity with C. citrullina. Based on the morphological and molecular characteristics ，the pathogen was identified as C. citrullina. 【Conclusion 】The serious leaf spot appeared on muskmelon in greenhouse in Guangxi these yearsiscausedbyC.citrullina.ItisanewdiseaseonmuskmeloninGuangxi. Keywords ：muskmelon ；leafspot ；identificationofpathogen ；Cercosporacitrullina 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) JournalofSouthernAgriculture 2018 ， 49 （ 3 ） ： 476 - 480 ISSN 2095 - 1191 ； CODEN NNXAAB http:/www.nfnyxb.com DOI ： 10 . 3969 /j.issn. 2095- 1191 . 2018. 03. 10 3 期 · 477 · 脅 。 本 課 題 組 于20152016 年 在 廣 西 南 寧 、 北 海 和 欽 州 等 厚 皮 甜 瓜 主 產(chǎn) 區(qū) 開 展 甜 瓜 病 害 種 類 調(diào) 查 時(shí) 發(fā) 現(xiàn) 一 種 葉 部 新 病 害 ， 該 病 害 侵 染 北 甜 一 號(hào) 、 好 運(yùn)11 號(hào) 和 新 金 鳳 凰 等 厚 皮 甜 瓜 品 種 ， 其 癥 狀 與 以 往 發(fā) 生 的 甜 瓜 葉 部 病 害 癥 狀 存 在 明 顯 差 異 ， 主 要 表 現(xiàn) 為 在 葉 片 上 形 成 近 圓 形 或 倒 “V ” 字 形 褐 色 大 型 病 斑 。 該 病 在 春 茬 甜 瓜 上 的 發(fā) 病 率 為30%50%， 在 秋 茬 甜 瓜 上 發(fā) 生 更 嚴(yán) 重 ， 多 數(shù) 大 棚 發(fā) 病 率 在80% 以 上 ， 嚴(yán) 重 的 發(fā) 病 率 達(dá)100%， 成 為20152016 年 廣 西 大 棚 甜 瓜 最 嚴(yán) 重 的 葉 部 病 害 之 一 。 該 病 主 要 造 成 甜 瓜 葉 片 大 面 積 枯 死 ， 植 株 早 衰 ， 嚴(yán) 重 影 響 果 實(shí) 后 期 的 營 養(yǎng) 吸 收 ， 降 低 果 實(shí) 品 質(zhì) 和 產(chǎn) 量 ， 造 成20%40% 的 經(jīng) 濟(jì) 損 失 。 目 前 該 病 病 原 菌 的 分 類 地 位 尚 不 明 確 ， 因 此 ， 開 展 該 病 原 的 鑒 定 研 究 ， 對(duì) 有 效 防 治 該 病 害 具 有 重 要 的 指 導(dǎo) 意 義 。 【 前 人 研 究 進(jìn) 展 】 在 我 國 南 方 地 區(qū) 大 棚 甜 瓜 上 常 發(fā) 生 的 病 害 主 要 有 霜 霉 病 、 白 粉 病 、 蔓 枯 病 、 病 毒 病 、 枯 萎 病 、 炭 疽 病 、 猝 倒 病 和 根 結(jié) 線 蟲 病 等 （ 何 毅 等 ， 2005 ； 周 靈 芝 等 ， 2006 ） 。 經(jīng) 比 對(duì) ， 本 課 題 組 調(diào) 查 發(fā) 現(xiàn) 的 甜 瓜 葉 部 新 病 害 癥 狀 與 上 述 常 見 病 害 的 葉 部 癥 狀 存 在 明 顯 差 異 ， 關(guān) 于 這 種 新 病 害 目 前 未 見 相 關(guān) 研 究 報(bào) 道 。 此 外 ， 前 人 對(duì) 植 物 病 害 的 鑒 定 通 常 采 用 病 原 菌 形 態(tài) 學(xué) 和 分 子 生 物 學(xué) 相 結(jié) 合 的 方 法 ， 該 方 法 能 將 病 原 菌 鑒 定 到 種 的 水 平 （ 王 爽 等 ， 2013 ； 冉 雙 飛 等 ， 2016 ； 趙 楊 等 ， 2016 ； 歐 陽 秋 飛 等 ， 2017 ） 。 【 本 研 究 切 入 點(diǎn) 】 對(duì) 于 一 種 新 發(fā) 生 的 病 害 ， 準(zhǔn) 確 鑒 定 其 病 原 菌 是 進(jìn) 行 有 效 防 治 的 基 本 前 提 。 目 前 對(duì) 近 年 來 廣 西 大 棚 甜 瓜 葉 片 上 發(fā) 生 的 新 病 害 尚 無 文 獻(xiàn) 報(bào) 道 。 【 擬 解 決 的 關(guān) 鍵 問 題 】 采 用 單 孢 分 離 法 對(duì) 厚 皮 甜 瓜 上 新 發(fā) 生 的 葉 部 病 害 進(jìn) 行 病 原 菌 分 離 ， 用 離 體 葉 片 接 種 法 進(jìn) 行 致 病 性 測 定 ， 同 時(shí) 對(duì) 病 原 菌 的 形 態(tài) 特 征 進(jìn) 行 顯 微 觀 察 ， 并 對(duì) 其rDNA-ITS 基 因 序 列 進(jìn) 行 同 源 性 比 對(duì) 分 析 ， 結(jié) 合 病 原 菌 的 形 態(tài) 學(xué) 特 征 和 分 子 生 物 學(xué) 分 析 結(jié) 果 進(jìn) 行 鑒 定 ， 以 明 確 該 病 原 菌 的 分 類 地 位 ， 為 該 病 害 的有效防治提供 參考 依據(jù) 。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料 病原 菌分 離和 接種 均采 用厚 皮甜 瓜品 種好 運(yùn)11 號(hào) ， 種 植 于 廣 西 南 寧 市 武 鳴 區(qū) 鑼 圩 鎮(zhèn) 武 帽 農(nóng) 場 。 病 原菌分離采用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基 （PDA ） 。 1.2 病害癥狀觀察 2015 年8 月2016 年12 月 ， 在 南 寧 市 武 鳴 區(qū) 、 青 秀 區(qū) 和 北 海 市 銀 海 區(qū) 等 厚 皮 甜 瓜 主 產(chǎn) 區(qū) ， 于 不 同 發(fā) 病 時(shí)期對(duì)厚皮甜瓜葉斑病進(jìn)行癥狀觀察 、 記錄和拍照 。 1.3 病 原菌鑒定 1. 3. 1 病 原 菌 分 離 從 南 寧 市 武 鳴 區(qū) 鑼 圩 鎮(zhèn) 武 帽 農(nóng) 場5 個(gè) 大 棚 采 集 新 鮮 病 葉 各1 張 ， 分 別 用 滅 菌 水 沖 洗 表 面 ， 置 于28 下 保 濕2 d， 在 超 凈 工 作 臺(tái) 上 進(jìn) 行 病 原 菌 單 孢 分 離 。 用 沾 了 無 菌 水 的 滅 菌 接 種 環(huán) 粘 取 病 斑 處 的 分 生 孢 子 ， 在 水 瓊 脂 塊 表 面 劃 線 ， 置 顯 微 鏡 下 觀 察 ， 挑 取 單 孢 子 移 入 另 一 塊 水 瓊 脂 塊 表 面 ， 再 次 用 顯 微 鏡 觀 察 ， 確 認(rèn) 第2 塊 水 瓊 脂 塊 上 只 含 有1 個(gè) 分 生 孢 子 ， 將 第2 塊 水 瓊 脂 塊 移 到PDA 培 養(yǎng) 基 上 ， 28 下 黑 暗 培 養(yǎng)10 d ， 挑 取 菌 落 邊 緣 的 菌 絲 塊 轉(zhuǎn) 接 至PDA 斜面培養(yǎng)基上 ， 培養(yǎng)10 d 后4 保存?zhèn)溆?。 1. 3. 2 病 原 菌 致 病 性 測 定 從 生 長 健 壯 的 甜 瓜 植 株 中 上 部 剪 取 健 康 葉 片 ， 用 無 菌 水 沖 洗 干 凈 。 用 滅 菌 接 種 針 在 健 康 葉 片 上 的 每 個(gè) 接 種 點(diǎn) 針 刺5 下 ， 在 傷 口 處 滴 半 滴 無 菌 水 。 從28 黑 暗 培 養(yǎng)15 d 的 菌 落 上 切 取 菌 絲 塊 （5 mm×5 mm ） ， 將 長 菌 絲 的 一 面 貼 于 針 刺 傷 口 處 。 每 處 理3 張 葉 片 ， 每 張 葉 片 接 種3 個(gè) 菌 絲 塊 ； 以 針 刺 傷 口 處 貼 放PDA 空 白 培 養(yǎng) 基 塊 為 對(duì) 照 。 將 處 理 和 對(duì) 照 葉 片 置 于28 下 保 濕 培 養(yǎng) ， 定 期 觀 察 各 處 理 葉 片 的 發(fā) 病 情 況 。 發(fā) 病 后 對(duì) 病 斑 上 的 病 原 菌 進(jìn) 行 再 分 離 ， 比 較 分 離 菌 株 與 接 種 菌 株 的 菌 落 和 分 生 孢 子 形 態(tài) 是 否 相 同 ， 如 分 離 菌 株 與 接 種 菌 株 的 菌 落 和 分 生 孢 子 形 態(tài) 相 同 ， 則 說 明 是 同 一 種 真 菌 ， 可 確 認(rèn)為病原菌 。 1. 3. 3 病 原 菌 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定 將 致 病 菌 接 種 到PDA 培 養(yǎng) 基 上 ， 置 于28 下 黑 暗 培 養(yǎng) ， 定 期 觀 察 記 錄 菌 落 的 形 態(tài) 特 征 和 生 長 情 況 。 另 外 ， 用 滅 菌 解 剖 刀 片 從 葉 片 病 斑 上 刮 下 菌 體 ， 置 于 載 玻 片 上 的 半 滴 無 菌 水 中 ， 蓋 上 蓋 玻 片 ， 置 顯 微 鏡 下 觀 察 病 菌 的 產(chǎn) 孢 結(jié) 構(gòu) 和分生孢子形態(tài)特征 ， 并測量大小 。 1. 3. 4 病 原 菌 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 采 用 天 根 生 化 科 技 （ 北 京 ） 有 限 公 司 生 產(chǎn) 的DNA 提 取 試 劑 盒 提 取 病 原 菌 基 因 組DNA 。 以 真 菌 通 用 引 物ITS1 （5&#39;-TCCG- TAGGTGAACCTGCGG-3&#39; ） 和ITS4 （5&#39;-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3&#39; ） （ 朱 迎 迎 等 ， 2016 ） 對(duì) 病 原 菌 的 rDNA-ITS 序 列 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增 。PCR 反 應(yīng) 體 系25.0 µL ： 2.5 mmol/L dNTP 2.0 µL ， 10×Buffer 2.5 µL ， 5 U/µL Ex Taq 0.5 µL ， 10 mol/L ITS1 和ITS4 各1.0 µL ， 模 板 DNA 100 ng， 超 純 水 補(bǔ) 足 至25.0 µL 。 擴(kuò) 增 程 序 ： 95 預(yù) 變 性5 min ； 95 30 s ， 58 30 s ， 72 80 s ， 進(jìn) 行35 個(gè) 循 環(huán) ； 72 延 伸10 min 。PCR 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 經(jīng) 1% 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 后 ， 回 收 目 標(biāo)DNA 條 帶 ， 送 交 金 唯 智 生 物 科 技 （ 北 京 ） 有 限 公 司 進(jìn) 行 序 列 測 定 。 運(yùn) 用 BLAST 將 測 序 結(jié) 果 與GenBank 數(shù) 據(jù) 庫 中 的 基 因 序 列 進(jìn)行同源性比對(duì)分析 。 葉云峰等 ： 甜瓜尾孢葉斑病病原分離與鑒定 49 卷 南 方 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) · 478 · 2 結(jié)果與分析 2.1 病 害癥狀 該 病 害 在 厚 皮 甜 瓜 定 植 后 的 整 個(gè) 生 育 期 均 可 發(fā) 生 ， 苗 期 發(fā) 生 較 輕 微 ， 以 生 長 中 后 期 （ 結(jié) 果 期 至 采 收 期 ） 發(fā) 病 最 重 。 病 害 癥 狀 首 先 在 植 株 下 部 的 葉 片 上 出 現(xiàn) ， 隨 后 向 中 上 部 葉 片 擴(kuò) 展 。 初 期 在 葉 片 上 形 成 灰 白 色 圓 形 小 斑 點(diǎn) ， 后 逐 漸 擴(kuò) 大 成 近 圓 形 褐 色 病 斑 ， 病 斑 中 央 常 為 灰 白 色 ， 外 圍 有 明 顯 黃 色 暈 圈 （ 圖 1-A ） 。 還 可 形 成 不 規(guī) 則 形 或 沿 著 葉 緣 葉 脈 向 葉 片 內(nèi) 部 擴(kuò) 展 呈 倒 “V ” 字 形 的 大 型 病 斑 ， 病 斑 均 為 褐 色 ， 外 圍 有 黃 色 暈 圈 （ 圖1-B ） ， 病 斑 大 小 差 異 較 明 顯 。 病 害 嚴(yán) 重 時(shí) ， 多 個(gè) 病 斑 融 合 在 一 起 ， 致 葉 片 大 面 積 干 枯 死 亡， 造成植株早 衰 。 圖 1 厚皮甜瓜葉斑病自然發(fā)病癥狀 Fig.1 Naturalsymptomsofmuskmelonleafspot A ： 近圓形病斑 ； B ： 不規(guī)則形或倒 “V ” 字形病斑 A ： Semiroundspot ； B ： Irregularshapedorinverted “V ”shapedspots 2.2 病原菌分離和鑒定結(jié)果 2. 2. 1 病 原 菌 分 離 和 致 病 性 測 定 結(jié) 果 對(duì)5 張 來 自 不 同 大 棚 的 甜 瓜 病 葉 進(jìn) 行 病 原 菌 單 孢 分 離 ， 分 離 純 化 得 到 形 態(tài) 特 征 一 致 的 真 菌5 株 。 通 過 針 刺 接 種 法 將5 株 菌 株 的 菌 絲 塊 接 種 到 健 康 的 甜 瓜 葉 片 上 ， 接 種4 d 后 ， 接 種 部 位 均 出 現(xiàn) 明 顯 的 近 圓 形 褐 色 小 病 斑 ， 直 徑810 mm ， 外 圍 有 明 顯 黃 色 暈 圈 （ 圖2-B ） 。 隨 著 時(shí) 間 推 移 ， 病 斑 不 斷 擴(kuò) 大 ， 接 種6 d 后 ， 病 斑 直 徑 達(dá)2530 mm ， 病 斑 癥 狀 與 自 然 發(fā) 病 的 近 圓 形 病 斑 癥 狀 相 似 （ 圖2-C ） 。 對(duì) 照 葉 片 未 發(fā) 病 （ 圖2-A ） 。 從 發(fā) 病 組 織 上 采 用 單 孢 分 離 法 再 分 離 得 到 的 菌 株 ， 其 菌 落 和 分 生 孢 子 形 態(tài) 與 接 種 菌 株 相 同 ， 表 明 再 分 離 獲 得 的 真 菌 菌 株 即 為 病 原 菌 。 選 取 其 中 一 株 菌 株TBD-2 進(jìn) 行培養(yǎng)菌落的形態(tài)特征觀察和分子生物學(xué)鑒定 。 圖 2 菌株TBD-2接種甜瓜葉片后的發(fā)病癥狀 Fig.2 SymptomsaftermuskmelonleafinoculatedwithstrainTBD-2 A ： CK ； B ： 接種4d 后的發(fā)病癥狀 ； C ： 接種6d后的發(fā)病癥狀 A ： CK ； B ： Symptom4dafterinoculation ； B ： Symptom6dafterinoculation 3 期 · 479 · 2. 2. 2 病 原 菌 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定 結(jié) 果 人 工 培 養(yǎng) 的 菌 落 在 PDA 培 養(yǎng) 基 上 生 長 緩 慢 ， 28 下 黑 暗 培 養(yǎng)10 d， 菌 落 直 徑 僅 為3.03.5cm ， 且 不 產(chǎn) 生 分 生 孢 子 。 菌 落 近 圓 形 ， 邊 緣 平 滑 ， 氣 生 菌 絲 致 密 ， 菌 落 正 面 為 白 色 ， 中 央 隆 起 （ 圖3-D ） ， 菌 落 背 面 黑 褐 色 ， 產(chǎn) 生 紅 色 色 素 。 菌 落 生 長 特 征基本與尾孢屬真菌相符 （ 雷玉明和張建文 ， 2006 ） 。 從 葉 片 病 斑 上 觀 察 到 病 菌 子 實(shí) 體 葉 兩 面 生 。 刮 下 菌 體 制 成 臨 時(shí) 玻 片 在 顯 微 鏡 下 觀 察 ， 可 見 子 座 小 或 不 明 顯 。 分 生 孢 子 梗 單 生 或212 根 簇 生 ， 頂 部 淺 褐 色 ， 基 部 深 褐 色 ， 不 分 枝 ， 直 立 或 彎 曲 ， 有17 個(gè) 曲 膝 狀 折 點(diǎn) ， 18 個(gè) 隔 膜 ， 頂 部 圓 錐 形 平 截 ， 孢 痕 疤 明 顯 加 厚 （ 圖3-C ） ， 大 小 為 （52.5245.0 ） m× （4.06.0 ） m 。 分 生 孢 子 針 形 ， 直 或 稍 彎 曲 ， 無 色 ， 單 生 ， 基 部 平 截 ， 頂 端 漸 細(xì) 至 鈍 ， 多 個(gè) 隔 膜 （ 圖3-A 和 圖3-B ） ， 大 小 為 （48.5238.0 ） m× （2.75.4 ） m 。 從 葉 片 病 斑 上 觀 察 到 的 病 原 菌 形 態(tài) 特 征 與 中 國 真 菌 志 第 二 十 四 卷 尾 孢 菌 屬 （ 郭 英 蘭 等 ， 2005 ） 描 述 的 寄 生 在 葫 蘆 科 作 物 上 的 瓜 類 尾 孢 （Cercospora citrullina ） 基 本 一致 。 2. 2. 3 病 原 菌 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 結(jié) 果 用 真 菌 通 用 引 物ITS1 和ITS4 對(duì) 菌 株TBD-2 的rDNA-ITS 基 因 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增 ， 產(chǎn) 物 經(jīng)1% 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 ， 獲 得 長 度 約530 bp 的DNA 片 段 （ 圖4 ） 。 回 收 該DNA 片 段 進(jìn) 行 測 序 ， 得 到538 bp 的 基 因 序 列 （GenBank 登 錄 號(hào) KY824771 ） ， 將 該 序 列 與GenBank 數(shù) 據(jù) 庫 中 已 公 布 的 基 因 序 列 進(jìn) 行BLAST 同 源 比 對(duì) 分 析 ， 結(jié) 果 表 明 ， 該序列與瓜類尾孢的同源性達(dá)99% 。 結(jié) 合 病 原 菌 的 形 態(tài) 學(xué) 和 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 結(jié) 果 ， 將菌株TBD-2 鑒定為瓜類尾孢 （C. citrullina ） 。 3 討論 國 內(nèi) 外 已 報(bào) 道 能 引 起 甜 瓜 葉 斑 病 的 病 原 菌 有 多 種 ， 包 括 瓜 鏈 格 孢 （Alternaria cucumerina ） （Egel and Harmon ， 2007 ） 、 交 鏈 格 孢 （A. alternata ） （Zhou and Everts ， 2008 ； Huang et al. ， 2011 ） 、 多 主 棒 孢 霉 （Corynespora cassiicola ） （ 王 爽 等 ， 2013 ） 和 丁 香 假 單 胞 桿 菌 （Pseudomonas syringae ） （ 李 亞 利 等 ， 2007 ） 等 真 菌 和 細(xì) 菌 ， 由 瓜 類 尾 孢 （C. citrullina ） 引 起 的 甜 瓜 葉 斑 病 未 見 相 關(guān) 文 獻(xiàn) 報(bào) 道 。 瓜 類 尾 孢 主 要 侵 染 葫 蘆 科 的 冬 瓜 、 西 瓜 、 南 瓜 、 西 葫 蘆 、 黃 瓜 、 絲 瓜 和 苦 瓜 等 作 物 （ 郭 英 蘭 等 ， 2005 ） ， 引 起 葉 斑 類 病 害 。 鑒 于 能 引 起 甜 瓜 葉 斑 病 的 病 原 種 類 較 多 ， 為 避 免 混 淆 ， 建 議 將 瓜 類尾孢引起的甜瓜葉斑病定名為甜瓜尾孢葉斑病 。 本 研 究 發(fā) 現(xiàn) 采 用 常 規(guī) 的 組 織 分 離 法 很 難 分 離 到 尾 孢 菌 ， 其 原 因 可 能 是 尾 孢 菌 在 人 工 培 養(yǎng) 基 上 生 長 緩 慢 ， 容 易 被 其 他 生 長 較 快 的 腐 生 真 菌 或 內(nèi) 生 真 菌 覆 蓋 ， 因 此 采 用 組 織 分 離 法 通 常 分 離 到 其 他 真 菌 而 不 是 尾 孢 菌 。 而 采 用 挑 取 單 孢 的 分 離 法 ， 可 有 效 分 離 到 純 的 尾 孢 菌 ， 且 能 減 少 病 菌 分 離 純 化 的 工 作 量 。 劉 慶 奎 等 （2013 ） 、 張 小 飛 等 （2014 ） 也 是 采 用 單 孢分離法對(duì)尾孢屬真菌進(jìn)行分離 。 瓜 類 尾 孢 在 人 工 培 養(yǎng) 基 上 生 長 緩 慢 ， 這 一 特 性 與 其 他 尾 孢 屬 真 菌 相 同 （ 雷 玉 明 和 張 建 文 ， 2006 ） 。 其 生 長 緩 慢 的 特 性 將 影 響 后 續(xù) 的 生 物 學(xué) 特 性 測 定 、 藥 劑 敏 感 性 測 定 等 室 內(nèi) 試 驗(yàn) 的 開 展 ， 因 此 ， 促 進(jìn) 該 病 原 菌 快速生長的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法尚需進(jìn)一步 探 究 。 圖 3 菌株TBD-2的形態(tài)特征 Fig.3 MorphologyofstrainTBD-2 A 和B ： 分生孢子 ； C ： 分生孢子梗和子座 ； D ： 菌落 AandB ： Conidia ； C ： Conidiophoreandstroma ； D ： Colony 圖 4 菌株TBD-2的rDNA-ITS 基因PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果 Fig.4 PCR amplification electrophorogram results for rDNA- ITSgeneofstrainTBD-2 M ： DL2000DNAMaker ； 1 ： TBD-2 菌株StrainTBD-2 M 1 2000bp 1000bp 700bp 500bp 250bp 100bp 葉云峰等 ： 甜瓜尾孢葉斑病病原分離與鑒定 49 卷 南 方 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) · 480 · 4 結(jié)論 結(jié) 合 形 態(tài) 學(xué) 和 分 子 生 物 學(xué) 方 法 ， 對(duì) 近 年 來 在 廣 西 大 棚 厚 皮 甜 瓜 上 嚴(yán) 重 發(fā) 生 的 一 種 葉 部 新 病 害 進(jìn) 行 鑒 定 ， 將 病 原 菌 鑒 定 為 瓜 類 尾 孢 （C. citrullina ） ， 該 病 是廣西厚皮甜瓜上的一種新病害 。 參考文獻(xiàn) ： 郭 英 蘭 ， 劉 錫 琎 ， 謝 文 瑞. 2005. 中 國 真 菌 志 （ 第 二 十 四 卷 尾 孢 菌 屬 ） M . 北 京 ： 科 學(xué) 出 版 社 ： 103-105. Guo Y L ， Liu X J ， Xie W R. 2005. Chinese Fungi （Volume 24， Cer- cospora ） M . Beijing ： Science Press ： 103-105. 何 毅 ， 樊 學(xué) 軍 ， 李 天 艷 ， 洪 日 新 ， 覃 斯 華 ， 李 文 信. 2005. 南 方 厚 皮 甜 瓜 大 棚 栽 培 主 要 病 害 與 綜 合 防 治 J . 中 國 瓜 菜 ， （4 ） ： 51-53. He Y ， Fan X J ， Li T Y ， Hong R X ， Qin S H ， Li W X. 2005. Integrated control of main diseases of muskmelon cultivated in greenhouse in south China J . China Cucurbits and Vegetables ， （4 ） ： 51-53. 雷 玉 明 ， 張 建 文. 2006. 草 本 植 物 三 種 真 菌 新 病 害 J . 草 地 學(xué) 報(bào) ， 14 （3 ） ： 284-286. Lei Y M ， Zhang J W. 2006. Three new fungous disease of forage grasses J . Acta Agrestia Sinica ， 14 （3 ） ： 284-286. 李 亞 利 ， 賈 迎 春 ， 蒲 崇 建 ， 楊 成 德 ， 陳 秀 蓉. 2007. 采 用16S rDNA 鑒 定 甜 瓜 細(xì) 菌 性 葉 斑 病 菌 J . 植 物 保 護(hù) ， 33 （3 ） ： 65-68. Li Y L ， Jia Y C ， Pu C J ， Yang C D ， Chen X R. 2007. Identification of the pathogen of bacterial spot of cucurbits leaves based on 16S rDNA sequences J . Plant Protection ， 33 （3 ） ： 65-68. 劉 慶 奎 ， 秦 子 惠 ， 張 小 利 ， 江 凱 ， 陳 茂 功 ， 武 小 菲 ， 何 月 秋 ， 王 桂 清 ， 晉 齊 鳴 ， 王 曉 鳴. 2013. 中 國 玉 米 灰 斑 病 病 原 菌 的 鑒 定 及 其 基 本 特 征 研 究 J . 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) ， 46 （19 ） ： 4044- 4057. Liu Q K ， Qin Z H ， Zhang X L ， Jiang K ， Chen M G ， Wu X F ， He Y Q ， Wang G Q ， Jin Q M ， Wang X M. 2013. Identification of Cercospora species associated with maize gray leaf spot in China J . Scientia Agricul- tura Sinica ， 46 （19 ） ： 4044-4057 歐 陽 秋 飛 ， 黃 嬌 麗 ， 農(nóng) 艷 豐 ， 李 榮 峰 ， 馬 博 ， 楊 瑞 虎 ， 樊 虹 伶. 2017. 百 色 桑 枯 萎 病 病 原 菌 的 分 離 與 鑒 定 J . 江 西 農(nóng) 業(yè) 學(xué)報(bào) ， 29 （7 ） ： 71-74. Ouyang Q F ， Huang J L ， Nong Y F ， Li R F ， Ma B ， Yang R H ， Fan H L. 2017. Isolation and identification of pathtion causing mulberry wilt disease in Baise Guangxi J . Acta Agriculturae Jiangxi ， 29 （7 ） ： 71-74. 冉 雙 飛 ， 陳 云 ， 姜 于 蘭 ， 劉 洪. 2016. 朱 頂 紅 赤 斑 病 病 原 菌 鑒 定 J . 貴 州 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) ， 44 （1 ） ： 72-74. Ran S F ， Chen Y ， Jiang Y L ， Liu H. 2016. Pathogenic identification of ama- ryllis red spot disease J . Guizhou Agricultural Sciences ， 44 （1 ） ： 72-74. 王 爽 ， 黃 貴 修 ， 李 博 勛 ， 孔 祥 義. 2013. 甜 瓜 棒 孢 葉 斑 病 病 原 菌 鑒 定 及 其 生 物 學(xué) 特 性 研 究 J . 熱 帶 作 物 學(xué) 報(bào) ， 34 （12 ） ： 2446-2452. Wang S ， Huang G X ， Li B X ， Kong X Y 2013. Identification and biological characteristics of Co- rynespora cassiicola causing Corynespora leaf spot on muskmelon J .ChineseJournalofTropicalCrops ， 34 （12 ） ： 2446-2452 張 小 飛 ， 李 曉 ， 崔 麗 娜 ， 鄒 成 佳 ， 楊 曉 蓉. 2014. 西 南 地 區(qū) 玉 米 灰 斑 病 病 原 種 類 分 子 鑒 定 J . 西 南 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) ， 27 （3 ） ： 1079-1081. Zhang X F ， Li X ， Cui L N ， Zou C J ， Yang X R. 2014. Molecular identification of race from maize gray leaf spot in southwest China J . Southwest China Journal ofAgricultural Sciences ， 27 （3 ） ： 1079-1081 趙 楊 ， 米 建 華 ， 李 洪 連 ， 文 才 藝 ， 汪 敏. 2016. 河 南 省 紫 荊 黃 萎 病 菌 的 分 離 和 鑒 定 J . 河 南 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) ， 45 （10 ） ： 89-92. Zhao Y ， Mi J H ， Li H L ， Wen C Y ， Wang M. 2016. Iso- lation and identification of Verticillium dahliae on Chi- nese redbud in Henan J . Journal of Henan Agricultural Sciences ， 45 （10 ） ： 89-92. 周 靈 芝 ， 吳 月 先 ， 李 文. 2006. 甜 瓜 南 方 大 棚 無 土 栽 培 主 要 病 害 及 防 治 技 術(shù) J . 廣 西 農(nóng) 學(xué) 報(bào) ， 21 （6 ） ： 34-35. Zhou L Z ， Wu Y X ， Li W. 2006. Techniques of prevention and control of major pests and no-soil cultivation of sweet gourd in greenhouse in south China J . Journal of Guangxi Agriculture ， 21 （6 ） ： 34-35 朱 迎 迎 ， 李 敏 ， 高 兆 銀 ， 章 武 ， 楊 冬 平 ， 陳 亮 ， 胡 美 姣. 2016. 火 龍 果 炭 疽 病 病 原 菌 的 鑒 定 及 生 物 學(xué) 特 性 研 究 J . 南 方 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) ， 47 （1 ） ： 59-66 Zhu YY ， Li M ， Gao Z Y ， Zhang W ， Yang D P ， Chen L ， Hu M J. 2016. Identification and biological characteristics of anthracnose pathogen</p>