青浦地區(qū)生菜腐爛病原分離鑒定及致病性測定.pdf

<p>&nbsp;年第卷第期 l &nbsp;收稿日期： - - 基金項目： 上海市青浦區(qū) 年度財政預(yù)算專項 作者簡介： 劉彬 （）， 男， 農(nóng)藝師， 碩士， 從事蔬菜植保技術(shù)研究和推廣工作， &nbsp;- &nbsp; &nbsp; ： &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; . &nbsp; &nbsp;。 通信作者： 王桂英 （）， 女， 高級農(nóng)藝師， 本科， 從事蔬菜生產(chǎn)管理和種植技術(shù)推廣工作 ， &nbsp;- &nbsp; &nbsp; ： &nbsp; &nbsp; &nbsp; . &nbsp; &nbsp;。 注： 感謝重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所商靖博士對病菌分離鑒定提供的支持和幫助！ 文獻(xiàn)著錄格式： 劉彬， 王桂英， 陸鋆赟青浦地區(qū)生菜腐爛病原分離鑒定及致病性測定 &nbsp;浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)， ， （）： - &nbsp; ： . . &nbsp; &nbsp; . - . 青浦地區(qū)生菜腐爛病原分離鑒定及致病性測定 劉彬，王桂英 * ，陸鋆赟 （上海市青浦區(qū)蔬菜技術(shù)推廣站， 上海青浦 ） &nbsp;：對青浦區(qū)生菜腐爛病原，通過病原菌分離、 致病性測定、 形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定， 明確了為害青 浦生菜腐爛為真菌病害，未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和其他致病菌復(fù)合侵染， 確定該病菌為小菌核菌， 為該病害后期防治方法 的篩選提供了理論依據(jù)。 &nbsp; &nbsp;：生菜腐爛??；分離；鑒定；致病性 &nbsp; &nbsp; &nbsp;： &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;： &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;： - （）- - 生菜 （ &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ）， 又名葉用萵苣， 是 世界范圍內(nèi)廣泛種植的綠葉蔬菜之一 。 上海為 我國生菜生產(chǎn)和消費最多的地區(qū)之一， 年種 植面積在 &nbsp; 左右， 近年來上海青浦地區(qū)生 菜種植面積一直維持在 &nbsp; 。在種植過程中， 生菜莖基部腐爛情況發(fā)生較重，發(fā)病后期莖基部分 離。春秋冬三季均有發(fā)生，尤以春季發(fā)病最重，其 發(fā)病癥狀與軟腐病等不易區(qū)分。為此由請重慶市農(nóng) 業(yè)科學(xué)院茶葉研究所對青浦地區(qū)生菜腐爛病害，進(jìn) 行病原菌分離、致病性測定、形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒 定，以明確青浦地區(qū)生菜腐爛的病原，為病原診斷 和后期防治提供理論依據(jù)。 材料與方法 &nbsp;. &nbsp; &nbsp; &nbsp;于年月在青浦區(qū)重固鎮(zhèn)上海春昌蔬果 專業(yè)合作社設(shè)施大棚地采集具有典型腐爛癥狀的生 菜病株，并收集種植品種種子回實驗室育苗作為陰 性對照。 &nbsp;. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 參照文獻(xiàn) 。 取典型帶病株， 無菌刀片切 取病健交界處小塊組織， 用 &nbsp; &nbsp; &nbsp;表面消毒 &nbsp; &nbsp;，滅菌水沖洗次， 分別置于馬鈴薯葡萄糖 瓊脂培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中， 每皿 塊，置 恒溫箱中培養(yǎng)觀察。 同時將生菜種子 按相同方法處理后觀察培養(yǎng)情況。菌絲萌發(fā)后，選 典型菌落轉(zhuǎn)入新皿繼續(xù)培養(yǎng)、純化、保存。 &nbsp;. &nbsp; &nbsp; &nbsp; 采用注射法接種分生孢子，用注射器向健康生 菜葉片和生菜莖基部注入含有分生孢子的懸浮液 （濃度為. × 個· &nbsp; ） &nbsp;， 用無菌紗布 覆蓋保濕，接種株，并用無菌水做對照。接種后 在氣候箱內(nèi)保持相對濕度以上， &nbsp;光照 &nbsp;黑暗 培養(yǎng)。 &nbsp;. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 在解剖鏡和顯微鏡下觀察病原菌形態(tài)并測量大 小。按文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行形態(tài)鑒定 。 &nbsp;. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; . . 菌絲體的培養(yǎng)與收集 選取典型菌株 &nbsp; &nbsp; - 進(jìn)行分子檢測。將斜面 保存的菌株接種在 &nbsp; &nbsp;培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。將活化 后的菌株接種到液體 &nbsp; &nbsp;培養(yǎng)基，每皿均勻接種個 菌絲塊，每個試管接種 個，于 培養(yǎng) &nbsp;后， 用滅菌接種針挑取菌絲，置于 保存?zhèn)溆谩?. . 基因組 &nbsp; &nbsp;的提取 基因組 &nbsp; &nbsp;的提取和純化采用試劑盒方法。 . . &nbsp; &nbsp;擴增 用真核生物核糖體 &nbsp; &nbsp;通用引物 &nbsp; &nbsp;和 &nbsp; &nbsp; 進(jìn)行 &nbsp; &nbsp;擴增 。 其序列為 &nbsp; &nbsp;： - &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ， &nbsp; &nbsp;： - &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; l &nbsp; 年第卷第期 &nbsp; &nbsp; - 。 . . &nbsp; &nbsp;反應(yīng)條件 &nbsp; &nbsp;反應(yīng)體系總體積為 &nbsp;， 反應(yīng)液組分 為： × &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;. &nbsp;， &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;， &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;， &nbsp;· &nbsp; &nbsp; &nbsp;酶 . &nbsp;， 模板 &nbsp; &nbsp; &nbsp;， 引物 &nbsp; &nbsp;和 &nbsp; &nbsp; （ &nbsp; &nbsp;· &nbsp; ） 各 . &nbsp;， &nbsp; &nbsp; &nbsp;. &nbsp;， 在 &nbsp; &nbsp;- &nbsp; &nbsp;擴增儀上擴增。 擴增條件。 預(yù)變性 &nbsp; &nbsp;； 變性 &nbsp; &nbsp;， 退火 &nbsp; &nbsp;， 延伸 &nbsp; &nbsp;， 共 個循環(huán)；最后 延伸 &nbsp; &nbsp;。 &nbsp; &nbsp;產(chǎn)物委托上 海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化和測序 。 結(jié)果與分析 &nbsp;. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 通過馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，僅發(fā) 現(xiàn)種菌絲，經(jīng)轉(zhuǎn)管培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)該真菌 &nbsp;就可 在培養(yǎng)基上產(chǎn)生肉眼可見的菌核。該病菌經(jīng)顯微鏡 觀察， 菌核相對較小， 似油菜籽狀， 大小 . &nbsp; ，子囊孢子橢圓形， 大小 （ ） &nbsp;× （ ） &nbsp;。 通過牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離， 未 發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌侵染。 &nbsp;. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 通過注射法接種分生孢子后，健康生菜莖基部 在第天產(chǎn)生腐爛， 并有白色菌絲附著 （圖 ）， 清水對照無任何癥狀；到第天時，生菜莖基部產(chǎn) 生. &nbsp; 大小的黑色菌核 （圖），生菜已基本腐 爛，輕輕一提就可與根部分離。對第天和第天 的接種生菜采用 . 方法進(jìn)行分離， 得到 種病 菌，培養(yǎng)和鏡檢結(jié)果與. 結(jié)果一致，所以該病菌 為青浦地區(qū)生菜腐爛的致病菌。 圖 致病性測定第天結(jié)果 圖 致病性測定第天結(jié)果 &nbsp;. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;對 &nbsp; &nbsp;產(chǎn)物進(jìn)行測序， 得到 &nbsp; 序列， 經(jīng) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 比對， 與小菌核菌 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 比對 結(jié)果一致，與 &nbsp; . 相似度達(dá)到， 小結(jié)與討論 王曉青等 研究表明， 生菜菌核病病原菌以 核盤菌和小菌核菌為主，均屬子囊菌亞門核盤菌科 真菌。病菌在發(fā)病后期形成菌核，以休眠體形式長 期存活于土壤中。 本文的研究結(jié)果與前者基本一 致， 青浦地區(qū)生菜菌核病致病菌為小菌核菌 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 為主。 通過對病株和種子分離培 養(yǎng)，在種子中未發(fā)現(xiàn)該病菌， 結(jié)合田間發(fā)生癥狀， 該病為土壤中帶菌，不是種子帶菌。 青浦地區(qū)的生菜腐爛由菌核病菌引起，該病主 要發(fā)生時期在月至翌年月間發(fā)生較重， 該時 期為油菜菌核病發(fā)生重點時期，青浦地區(qū)油菜多種 植在溝渠邊， 油菜菌核病和生菜菌核病是否有關(guān) 系，后期將結(jié)合生物學(xué)特性和理化分析對該病菌進(jìn) 行分析，為后期防治研究提供參考。 &nbsp; &nbsp; ： 楊曉， 魏仕偉， 郭斗斗， 等上海生菜產(chǎn)銷現(xiàn)狀與技術(shù)關(guān) 鍵點分析 &nbsp;長江蔬菜， （）： - 方中達(dá)植病研究方法 &nbsp;版北京： 中國農(nóng)業(yè)出版 社， 莊文穎中國真菌志 &nbsp;北京： 科學(xué)出版社， 段維軍， 郭立新基于 &nbsp; &nbsp;技術(shù)的植物病原真菌檢測技術(shù) 研究進(jìn)展 &nbsp;植物檢疫， （）： - 張祥林， 劉彬， 王翀， 等向日葵黑莖病菌分離鑒定及其 &nbsp; &nbsp; 分析 &nbsp;新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， ， （）： - 王曉青， 金紅云， 孫艷艷， 等辣根素水乳劑土壤處 理防治生菜菌核病效果研究 &nbsp; 中國植物病理學(xué)會 年學(xué)術(shù)年會論文集， （ &nbsp; &nbsp; ：張瑞麟）</p>