提高春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率的方法.pdf

提高春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率 的方法 閔子揚 1，2鄒 甜 1阮萬輝 2孫小武 1* （ 1 湖南農業(yè)大學園藝園林學院，湖南長沙 410128； 2 湖南省蔬菜研究所，湖南長沙 410125） 摘 要：為提高春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導率、加速西瓜單倍體育種進程，以早佳8424西瓜未授粉子房為材料，對 影響春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率的因素進行了研究。結果表明：摘取子房時盡量保留最長果柄，然后將帶果柄子房用 0.02 mg·L -1 的TDZ溶液浸泡10 min，最后將其置于15 恒溫條件下預處理2 d，能夠將春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導 率從3.5%提高到15.9%。 關鍵詞：西瓜；春季；未授粉子房；胚狀體；誘導 織途徑形成的再生植株（Ramsay et al.，2003；趙珺， 2007） 。這提醒我們在進行西瓜未授粉子房離體培 養(yǎng)以創(chuàng)制單倍體植株的過程中，提高胚狀體的誘導 率是一個需要解決的關鍵問題。 TDZ（噻苯?。┦且环N新型植物生長調節(jié)劑， 具有細胞分裂素和生長素的雙重功效，廣泛應用于 誘導植物愈傷組織形成和體細胞胚分化（徐曉峰和 黃學林，2003），已在香蕉（魏岳榮 等，2007）、非 洲紫羅蘭（楊先泉 等，2010） 、南瓜（閔子揚 等， 2016）等作物的體細胞胚誘導中取得了較好效果。 本試驗以TDZ為預處理激素，探討其對西瓜胚狀 體誘導效果的影響。 參照前期研究（閔子揚 等，2016） ，筆者已建 立了一套誘導率較高的西瓜未授粉子房離體培養(yǎng)誘 導胚狀體再生的技術體系，主要技術路線如下：以 開花前一天的西瓜未授粉子房為材料，流水沖洗30 min后在超凈工作臺上用75%酒精消毒30 s，無菌 水沖洗3次，去除子房外表皮后橫切成1 mm左右 的薄片，然后在3%次氯酸鈉溶液中消毒2 min， 無菌水沖洗5次后接種于MS+30 g·L -1 蔗糖+7 g·L -1 瓊脂粉+0.04 mg·L -1TDZ的誘導胚狀體發(fā)生的培 養(yǎng)基上，35 黑暗條件下熱激5 d后轉到組培室培 養(yǎng)，28 d后統(tǒng)計胚狀體誘導率。通過上述技術體系 能夠獲得較高的胚狀體誘導率，但試驗過程中發(fā)現(xiàn) 材料的種植季節(jié)不同其誘導率存在顯著差異，春季 閔子揚，男，博士研究生，研究實習員，專業(yè)方向：瓜類蔬菜遺傳育種， E-mail：minziyang1220163.com *通訊作者（Corresponding author）：孫小武，男，教授，博士生導師， 專業(yè)方向：瓜類蔬菜遺傳育種，E-mail：sunxiaowu2007126.com 收稿日期：2017-11-09；接受日期：2018-02-28 基金項目：湖南省科技廳重點研發(fā)項目（2016NK2193） 西瓜（Citrullus lanatus）是葫蘆科重要的蔬菜 作物之一，具有豐富的營養(yǎng)和保健功能，深受消費 者喜愛。我國作為西瓜的生產和消費大國，其產量 占世界總產量的60%以上，但我國西瓜育種水平 相對滯后，品種類型無法完全滿足市場需求，因此， 提高我國西瓜育種水平、增強西瓜產業(yè)國際競爭力 具有重要意義。 單倍體育種對于加速育種進程、創(chuàng)新種質資 源、構建遺傳圖譜等均具有重要意義（袁素霞 等， 2010；Qiao et al.，2015）。單倍體的獲得方法主要 有離體雄核培養(yǎng)和離體雌核培養(yǎng)，但在葫蘆科作物 上以未授粉子房或胚珠為外植體的離體雌核培養(yǎng)為 主（孫守如 等，2013；趙曉菲，2014）。離體雌核 培養(yǎng)過程中再生植株的產生方式有兩種，一種是誘 導形成愈傷組織后再分化產生芽，最后形成完整再 生植株；另一種是以胚狀體發(fā)育途徑直接形成再生 植株。相關研究表明，愈傷組織途徑形成的再生植 株大部分起源于體細胞，而以胚狀體發(fā)育途徑形成 的再生植株中單倍體植株的比例顯著高于以愈傷組 67 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產業(yè)市場 病蟲防控 67 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（5）：67 - 70 西瓜未授粉子房胚狀體誘導率僅為3.5%，而秋季 誘導率最高可達20.2%，并且這種現(xiàn)象在南瓜、西 葫蘆等瓜類作物上也有報道（謝冰 等，2006；孫 守如 等，2013） 。為提高春季西瓜未授粉子房的胚 狀體誘導率、延長試驗可操作時間、加速西瓜單倍 體育種進程，本試驗在前期已建立的西瓜未授粉子 房離體培養(yǎng)誘導胚狀體再生技術體系的基礎上，以 春季西瓜未授粉子房為研究對象，探索提高春季西 瓜未授粉子房胚狀體誘導率的方法，以期能夠加速 西瓜單倍體育種進程，為我國西瓜種質資源創(chuàng)新、 新品種選育、基因工程相關研究提供幫助。 1 材料與方法 1.1 試驗材料 供試西瓜品種為早佳8424，由湖南省蔬菜研 究所提供。試驗材料于2016年4月10日定植在湖 南省蔬菜研究所高橋科研基地的塑料大棚中，5月 20日第2朵雌花出現(xiàn)時開始取樣接種。以下各處 理每處理接種3瓶，每瓶9個外植體，3次重復。 1.2 試驗方法 1.2.1 果柄長度對胚狀體誘導率的影響 取樣時， 分別以最長果柄、1/2果柄、無果柄3種類型（圖1） 的西瓜未授粉子房為材料，用0.02 mg·L -1 的TDZ 溶液浸泡10 min后置于保濕盒中，15 恒溫條件 下放置2 d，然后按照已建立的技術體系進行接種， 培養(yǎng)28 d后分別統(tǒng)計西瓜未授粉子房胚狀體誘 導率。 胚狀體誘導率=（形成胚狀體總數/膨大胚珠總 數）×100% 1.2.2 激素預處理方式對胚狀體誘導率的影響 以 果柄最長時的西瓜未授粉子房為材料，分別用 0.01、0.02、0.03 mg·L -1 的TDZ溶液浸泡5、10、 15 min后置于保濕盒中，15 恒溫條件下放置2 d， 以不進行激素預處理的材料為對照，然后按照已建 立的技術體系進行接種，培養(yǎng)28 d后分別統(tǒng)計西 瓜未授粉子房胚狀體誘導率。 1.2.3 溫度預處理方式對胚狀體誘導率的影響 以 果柄最長時的西瓜未授粉子房為材料，用0.02 mg·L -1 的TDZ溶液浸泡10 min后置于保濕盒中， 分別在10、15、20 的恒溫條件下處理1、2、3 d， 以不進行溫度預處理的材料為對照，然后按照已建 立的技術體系進行接種，培養(yǎng)28 d后分別統(tǒng)計西 瓜未授粉子房胚狀體誘導率。 1.3 數據分析 采用SPSS軟件對以上各數據進行方差分析和 Duncans多重比較。 2 結果與分析 2.1 不同果柄長度對西瓜胚狀體誘導率的影響 西瓜未授粉子房取樣后有一個預處理的過程， 不會立刻接種，存放過程中需要消耗部分養(yǎng)分，果 柄能夠為子房提供部分營養(yǎng)，因此不同果柄長度會 對存放后子房的生理狀態(tài)產生影響。試驗結果表 明，果柄最長時其胚狀體誘導率最高，達13.8%， 而無果柄子房的胚狀體誘導率僅為2.6%，帶1/2果 柄的胚狀體誘導率為4.4%，說明果柄長度越長， 西瓜胚狀體誘導率越高。 2.2 激素預處理方式對西瓜胚狀體誘導率的影響 由表1可以看出，當TDZ濃度為0時，不同 預處理時間的胚狀體誘導率均處于較低水平，胚 狀體生長狀況一般，總體不利于再生植株的獲得。 TDZ濃度為0.01 mg·L -1 時，相較于不用激素處 理，其胚狀體誘導率顯著提高，當預處理時間達 到15 min時，誘導率可達6.0%。隨著TDZ濃度的 進一步提高，胚狀體誘導率仍有上升的空間。在 TDZ濃度為0.02 mg·L -1 或0.03 mg·L -1 條件下， 預處理時間為10 min或15 min時，各處理之間胚 狀體誘導率差異不顯著且均處于較高水平，最高可 達16.7%?？梢钥闯觯c未使用激素預處理相比， 激素預處理能夠顯著提高胚狀體誘導率。但試驗過 圖 1 不同果柄長度的西瓜未授粉子房 彩色圖版見中國蔬菜網站：www.cnveg.org，下圖同。 68 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產業(yè)市場 病蟲防控 68 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 程中也發(fā)現(xiàn)，TDZ濃度達0.03 mg·L -1 且激素預處 理時間為10、15 min時，雖然胚狀體誘導率較高， 但再生的胚狀體存在嚴重畸形，不利于再生植株的 獲得。 2.3 溫度預處理方式對西瓜胚狀體誘導率的影響 如表2所示，在相同預處理溫度下，不同預處 理時間之間胚狀體誘導率差異顯著并呈現(xiàn)出一定的 趨勢，10 或15 時隨著預處理時間的延長，胚 狀體誘導率呈先上升后下降的趨勢；20 及室內自 然條件下隨著預處理時間的延長，胚狀體誘導率逐 漸下降。預處理時間相同時，隨著預處理溫度的上 升，胚狀體誘導率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在 15 預處理2 d時達到峰值，誘導率高達15.9%， 15 預處理時間達3 d時誘導率急劇下降，這可能 是由于預處理時間過長子房生理狀態(tài)明顯下降造成 的。試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，如果西瓜子房在室內自然 條件下放置一段時間，其胚狀體誘導率顯著下降， 放置時間達到3 d時其誘導率僅為2.8%，并且胚 狀體存在嚴重的畸形現(xiàn)象，說明西瓜未授粉子房的 生理狀態(tài)對胚狀體誘導率影響顯著。綜上認為， 在15 條件下預處理2 d，能夠顯著提高春季西瓜 未授粉子房的胚狀體誘導率，有利于再生植株的 獲得。 3 結論 提高春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率的方 法為：摘取子房時盡量保留最長果柄，然后將帶最 長果柄的西瓜未授粉子房用0.02 mg·L -1 的TDZ溶 液浸泡10 min，最后將其置于15 恒溫條件下預 處理2 d，預處理完成后進行接種培養(yǎng)，能夠顯著 改善春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率低的問題。 通過上述預處理手段，能夠將春季西瓜未授粉子房 的胚狀體誘導率從3.5%（圖2-A）提高到15.9% （圖2-B） ，雖然距秋季西瓜未授粉子房的胚狀 體誘導率20.2%仍有差距，但仍顯著提高了試驗 效率。 表 1 不同激素預處理方式對西瓜胚狀體誘導率的影響 激素預處理方式 胚狀體誘 導率/% 胚狀體生 長狀況 TDZ/mg·L -1 預處理時間/min 0 5 3.6 ef 一般 10 3.7 e 一般 15 3.4 f 一般 0.01 5 4.8 d 一般 10 5.9 c 良好 15 6.0 c 良好 0.02 5 10.8 b 良好 10 15.2 a 很好 15 15.3 a 有畸形 0.03 5 10.8 b 有畸形 10 15.3 a 嚴重畸形 15 16.7 a 嚴重畸形 注：表中同列數據后不同小寫字母表示在5%水平上差異顯 著，下表同。 表 2 不同溫度預處理方式對西瓜胚狀體誘導率的影響 溫度預處理方式 胚狀體誘 導率/% 胚狀體生 長狀況 溫度/ 預處理時間/d 10 1 4.2 f 良好 2 11.9 b 良好 3 5.8 e 有畸形 15 1 11.8 b 良好 2 15.9 a 良好 3 6.2 d 有畸形 20 1 11.7 b 良好 2 8.4 c 良好 3 6.1 d 有畸形 室內自然條件 1 5.9 e 一般 2 4.3 f 有畸形 3 2.8 g 嚴重畸形 圖 2 春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導 A，未經預處理的西瓜未授粉子房的胚狀體誘導；B，經過預處 理的西瓜未授粉子房的胚狀體誘導。 A B 4 討論 相關研究證明TDZ具有細胞分裂素和生長素 的雙重功效，在誘導愈傷組織形成和體細胞胚分化 等一系列過程中均能發(fā)揮作用（徐曉峰和黃學林， 2003）。本試驗使用0.02 mg·L -1 的TDZ對春季西 瓜未授粉子房進行預處理，取得了較好的效果，能 夠顯著提高其胚狀體誘導率且形成的胚狀體畸形率 較低，說明TDZ有利于提高春季西瓜未授粉子房 的胚狀體誘導率。2，4-D是誘導胚狀體發(fā)生的重 69 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產業(yè)市場 病蟲防控 69 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 要因素，許多植物離體胚狀體誘導均使用不同濃度 的2，4-D，但胚狀體形成前后，外植體在含2，4-D 的培養(yǎng)基上誘導時間的長短卻因不同作物而異。筆 者在前期試驗中發(fā)現(xiàn)，2，4-D能夠誘導西瓜胚狀 體的發(fā)生且誘導效果明確，但誘導一段時間后需及 時將外植體轉移到不含2，4-D的培養(yǎng)基上，步驟 相對復雜。TDZ能夠取得與2，4-D相同的誘導效 果且步驟簡單，因此，本試驗只對TDZ的預處理 效果進行了研究，其他激素的誘導效果有待進一步 研究。 倍性育種過程中經常使用溫度預處理來改變 配子體的生理狀態(tài)，提高再生植株的誘導率，這 在西葫蘆（謝冰 等，2006） 、黃瓜（杜勝利 等， 2003） 、甜瓜（韓麗華 等，2005）等作物上已經得 到廣泛證明。小孢子培養(yǎng)過程中一般在4 進行預 處理，能夠取得較好的效果。大孢子培養(yǎng)時接種后 一般在35 進行熱激處理，但處理效果卻有不同 報道。本試驗采用15 進行接種前預處理，取得 了較好的效果，這可能是由于春季西瓜未授粉子房 發(fā)育時所處環(huán)境溫度變化較大，最低氣溫低，從而 影響了子房的生理狀態(tài)，15 恒溫處理2 d，有效 改善了子房的生理狀態(tài)及激素水平，有利于后期誘 導胚狀體形成。 本試驗有效改善了春季西瓜未授粉子房胚狀體 誘導率過低的問題，顯著延長了試驗可操作時間， 加速了西瓜單倍體育種進程，試驗結果可為我國西 瓜種質資源創(chuàng)新、新品種選育、基因工程相關研究 提供幫助。 參考文獻 杜勝利，韓毅科，叢穎，魏愛民，侯鋒，陳啟民2003黃瓜離體 雌核發(fā)育的過程及其早期生化變化研究南開大學學報：自 然科學版，36（2）：27-30 韓麗華，王建設，陳貴林2005AgNO 3 對甜瓜離體胚囊發(fā)育的影 響河北農業(yè)大學學報，28（2）：48-50 閔子揚，李涵，鄒甜，童龍，成娟，孫小武2016南瓜未授粉子 房離體培養(yǎng)及植株再生植物學報，51（1）：74-80 孫守如，章鵬，胡建斌，孫利萍，張曼，孫治強2013南瓜未受 精胚珠的離體培養(yǎng)及植株再生植物學報，48（1）：79-86 魏岳榮，楊護，黃秉智，黃霞，黃學林，邱繼水，許林兵2007 Picloram，ABA和TDZ對香蕉體細胞胚胎發(fā)生的影響園藝學 報，34（1）：81-86 謝冰，王秀峰，樊治成2006西葫蘆離體雌核發(fā)育胚狀體成苗影 響因子分析西北農業(yè)學報，15（5）：182-186 徐曉峰，黃學林2003TDZ：一種有效的植物生長調節(jié)劑植物 學通報，20（2）：227-237 楊先泉，姚麗君，倪蘇，馮麗華2010TDZ對非洲紫羅蘭葉外植 體體細胞胚發(fā)生的效應西南農業(yè)學報，23（6）：2030-2033 袁素霞，劉玉梅，方智遠，楊麗梅，莊木，張揚勇，孫培田2010 結球甘藍和青花菜小孢子胚植株再生植物學報，45（2） ： 226-232 趙珺2007百合未授粉子房離體培養(yǎng)及胚胎學研究碩士論 文沈陽：沈陽農業(yè)大學 趙曉菲2014西葫蘆離體雌核培養(yǎng)誘導胚囊再生植株技術研 究碩士論文楊凌：西北農林科技大學 Ramsay J L，Galitz D S，Lee C W2003Basal medium and sucrose concentration influence regeneration of Easter Lily in ovary culture HortScience，38（3）：404-406 Qiao Y C，Huang H D，Zhang H，Li G G，Zhang Y S，Liu Z Z 2015Preliminary study on tissue culture technique of Brassica campestris L. ssp. chinensis（L ）Makion var. utilisAgricultural Science & Technology，16（10）：2202-2206，2213 Studies on Method for Improving Embryoid Induction Rate of Spring Watermelon Unfertilized Ovary MIN Zi-yang 1，2 ，ZOU Tian 1 ，RUAN Wan-hui 2 ，SUN Xiao-wu 1* （ 1 College of Horticulture and Landscape，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China； 2 Hunan Research Institute of Vegetables，Changsha 410125，Hunan，China） Abstract：In order to improve embryoid induction rate of watermelon unfertilized ovary and accelerate its haploid breeding process，this experiment took unfertilized ovary of watermelon Zaojia8428 as material and studied on the factors affecting induction rate of embryoid grown in springThe results showed that keeping the fruit stalk as long as possible when the ovary was taken，then steeping it in 0.02 mg·L -1TDZ for 10 min and putting it at 15 as pretreatment for 2 days could improve the induction rate of embryoid from 3.5% to 15.9% Key words：Watermelon；Spring；Unfertilized ovary；Embryoid；Induction 70 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點 產業(yè)市場 病蟲防控 70 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES