基于萬壽菊轉(zhuǎn)錄組測序的SSR標記開發(fā).pdf
<p>園藝學報， 2018， 45 (1)： 159 167. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0166； http： /www. ahs. ac. cn 159 收稿日期 ： 2017 05 15； 修回日期 ： 2017 12 11 基金項目 ： 國家自然科學基金面上項目（ 31572166） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： zghhzpx163.com） 基于萬壽菊轉(zhuǎn)錄組測序的 SSR 標記開發(fā) 張華麗1，叢日晨1，王茂良1，董愛香1，辛海波1,*，義鳴放2，郭 華3,*（1北京市園林科學研究院，綠化植物育種北京市重點實驗室，北京 100102；2中國農(nóng)業(yè)大學觀賞園藝與園林系，北京 100193；3河南省泌陽縣森林病蟲害防治檢疫站，河南泌陽 463721） 摘 要： 萬壽菊（ Tagetes erecta L.）花蕾轉(zhuǎn)錄組測序共獲得 48 953 條 Unigene，利用 MISA 軟件檢測出 20 666 個 SSR 位點，分布于 13 849 條 Unigene 中，出現(xiàn)頻率為 28.29%，平均分布距離為 2.51 kb。優(yōu)勢重復基序為三核苷酸、四核苷酸，分別占總 SSR 位點的 50.16%和 20.94%。 ATG/ATG 和 AAAC/GTTT分別是三核苷酸、四核苷酸的優(yōu)勢重復基元，占總 SSR 重復類型的 13.82%和 3.66%。隨機選取不同主導重復基元類型并合成 SSR 引物 36 對，以 20 份萬壽菊自交系的基因組 DNA 為模板，對引物有效性和多態(tài)性進行了驗證， 30 對引物可以擴增到清晰穩(wěn)定的目標條帶，有效擴增率為 80.56%；其中 13 對引物具有多態(tài)性，平均 He和 PIC 分別為 0.275 和 0.608。以上結(jié)果表明，萬壽菊轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生的 Unigene 信息可作為開發(fā) SSR 標記的有效來源，獲得的大批量 SSR 標記可為萬壽菊的遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建提供可靠的標記選擇。 關(guān)鍵詞： 萬壽菊； SSR；轉(zhuǎn)錄組 中圖分類號： S 682.1+1 文獻標志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 01-0159-09 Development of SSR Molecular Markers Based on Transcriptome Sequencing of Tagetes erecta ZHANG Huali1， CONG Richen1， WANG Maoliang1， Dong Aixiang1， XIN Haibo1,*， YI Mingfang2，and GUO Hua3,*（1Beijing Institute of Landscape Architecture， Beijing Key Laboratory of Greening Plants Breeding， Beijing 100102，China；2Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture， China Agricultural University， Beijing 100193， China；3Biyang Forest Diseases and Insect Pests Quarantine Station in Henan Province， Biyang， Henan 463721，China） Abstract： A total of 48 953 Unigenes were obtained by transcriptome sequencing of flower buds of Tagetes erecata. MISA found 20 666 SSRs located in 13 849 unigenes with the frequency of 28.29% and a mean distance of 2.51 kb per one. Trinucleotide and tetranucleotide were major types with the percentages of 50.16% and 20.94%， respectively. ATG/ATG and AAAC/GTTT were most frequent motifs in trinucleotide and tetranucleotide repeats， accounting for 13.82% and 3.66%， respectively. Based on different dominant motifs types， 36 primers were chosen randomly and verified with 20 different inbred lines of Tagetes erecta. The results showed that 30 primers were effective with a valid rate of 80.56%， and 13 primers showed polymorphism with He and PIC mean values of 0.275 and 0.608， respectively. These Zhang Huali， Cong Richen， Wang Maoliang， Dong Aixiang， Xin Haibo， Yi Mingfang， Guo Hua. Development of SSR molecular markers based on transcriptome sequencing of Tagetes erecta. 160 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 159 167. data indicated that the Unigenes generated from transcriptome sequencing can be used as an effective source to develop SSR markers， and the large quantities of SSR markers will provide reliable resources for analysis on genetic polymorphism and constructing genetic map in Tagetes erecta. Keywords： Tagetes erecta L.； SSR； transcriptome 簡單重復序列（ Simple sequence repeat， SSR）也叫微衛(wèi)星（ Microsatellites） ，廣泛地存在于真核生物基因組。 SSR 標記數(shù)量豐富、遍布整個基因組、多態(tài)性高，具有擴增位點專一、呈共顯性和多等位性的特點，且操作技術(shù)相對簡便，并且 SSR 位點在屬間和屬內(nèi)種間具有保守性（ Thomas & Scott， 1992） 。 SSR 技術(shù)已經(jīng)被廣泛應用于植物的遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系研究等方面。 萬壽菊（ Tagetes erecta L.）為菊科萬壽菊屬植物，種內(nèi)具有豐富的多樣性，株高、頭狀花序的花形、花色等都有豐富的類型；萬壽菊不僅可以用于園林綠化，還可以提取色素，吸收土壤中的重金屬鎘，提取殺蟲劑等。截至目前，僅見菊花的 EST-SSR 標記在萬壽菊上的可轉(zhuǎn)移性研究（張華麗 等， 2016）。本研究中基于前期工作中對萬壽菊花蕾轉(zhuǎn)錄組測序獲得的數(shù)據(jù)，開發(fā) SSR 標記，為萬壽菊種質(zhì)資源親緣關(guān)系、遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建等研究奠定基礎(chǔ)。 1 材料與方法 本試驗于 2014 年 12 月至 2016 年 6 月在北京市園林科學研究院進行。 1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源 萬壽菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于北京市園林科學研究院萬壽菊課題組 2014 年 12 月對萬壽菊雄性不育系 S-121 花蕾進行 Illumina 高通量深度測序。測序取 3 個發(fā)育時期的花蕾： （ 1）現(xiàn)蕾前，取可見花蕾之前的莖分生組織； （ 2）花序發(fā)育期，取直徑 1.5 mm 的花蕾； （ 3）花器官分化期，取直徑 2 3 mm 的花蕾。委托廣州市銳博生物科技有限公司進行 RNA-seq 轉(zhuǎn)錄組測序，并通過 De novo 方法組裝得到 Unigene，作為背景數(shù)據(jù)。 1.2 植物材料及其 DNA 提取 植物材料為本課題組收集和選育的 20 個表型性狀各異的萬壽菊自交系（表 1） 。花色采用英國皇家園藝學會標準比色卡測定。 基因組 DNA 提取采用天根生物公司植物基因組提取試劑盒（ DP320） ，具體步驟按說明書進行。 1.3 轉(zhuǎn)錄組 SSR 位點鑒別及 SSR 引物設(shè)計 采用 MISA 程序查找 SSR 位點，標準為：二核苷酸（ Dinucleotide） 、三核苷酸（ Trinucleotide） 、四核苷酸（ Tetranucleotide） 、五核苷酸（ Pentanucleotide）和六核苷酸（ Hexanucleotide）的重復次數(shù)分別 7、 5、 4、 4 和 4。 采用 Primer Premier 5.0 設(shè)計引物，標準為：引物長度 18 24 bp， GC 含量 40% 60%，理論退火溫度（ Tm） 55.0 65.0 ，預計產(chǎn)物長度在 150 300 bp 之間。 張華麗，叢日晨，王茂良，董愛香，辛海波，義鳴放，郭 華 . 基于萬壽菊轉(zhuǎn)錄組測序的 SSR 標記開發(fā) . 園藝學報， 2018， 45 (1)： 159 167. 161 表 1 萬壽菊自交系信息 Table 1 Information of marigold（ Tagetes erecta L.） inbred lines 編號 No. 來源 Locality 株高 / cm Height 冠幅 / cm Crown cover 花色（ RHSCC） Flower color 花徑 / cm Flower diameter 播種到開花天數(shù) / d Days from sowing to flowering 1 赤峰 Chifeng 35 40 桔紅 Tangerine（ 23A） 6.0 100 2 赤峰 Chifeng 35 50 桔黃 Orange（ 17A） 6.0 85 3 赤峰 Chifeng 35 35 黃 Yellow（ 7A） 7.0 85 4 赤峰 Chifeng 35 35 黃 Yellow（ 6A） 5.5 95 5 赤峰 Chifeng 30 35 黃 Yellow（ 6A） 3.0 80 6 赤峰 Chifeng 45 45 黃 Yellow（ 6A） 6.0 69 7 赤峰 Chifeng 36 38 黃 Yellow（ 5A） 6.5 82 8 自育 Independent 35 40 黃 Yellow（ 5A） 6.5 82 9 自育 Independent 38 46 金黃 golden（ 9A） 6.5 82 10 自育 Independent 35 40 金黃 golden（ 9A） 6.5 74 11 自育 Independent 40 45 金黃 golden（ 9A） 7.0 82 12 自育 Independent 38 42 黃 Yellow（ 5A） 7.0 82 13 自育 Independent 50 45 金黃 golden（ 7A） 6.5 82 14 自育 Independent 28 36 桔黃 Orange（ 17A） 2.0 74 15 越南 Vietnam 69 66 黃 Yellow（ 5C） 6.0 116 16 越南 Vietnam 66 桔紅 Tangerine（ N25B） 6.0 116 17 赤峰 Chifeng 55 58 桔紅 Tangerine（ N25C） 8.0 87 18 赤峰 Chifeng 120 45 桔紅 Tangerine（ N25B） 8.0 92 19 赤峰 Chifeng 24 31 白色 White（ 2D） 5.0 110 20 北京花仙子園藝公司 Beijing Huaxianzi Gardening Co. LTD 45 40 桔紅 Tangerine（ 21A） 7.0 95 1.4 EST-SSR 引物篩選及數(shù)據(jù)統(tǒng)計 隨機選取 36 對 EST-SSR 引物，以 20 份萬壽菊自交系材料為模板進行 PCR 擴增。 PCR 采用 10 L 反應體系，包括 4.1 L 雙蒸滅菌 H2O， 5 L 2 × Taq PCR MasterMix（天根生化） ， 20 mol L-1的上、下游引物各 0.2 L， DNA 模板 0.5 L。 PCR 反應采用 Biometra Gradient（德國） ，反應條件為： 94 預變性 5 min； 94 變性 30 s，合適的退火溫度下退火 30 s， 72 延伸 45 s， 35 個循環(huán)；72 延伸 5 min。各引物對的最適退火溫度通過梯度 PCR 試驗確定。 用 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠， 150 V 電壓條件下電泳 55 min，對 PCR 產(chǎn)物進行電泳分析。電泳后參照 Bassam 等（ 1991）的方法進行銀染顯色，用 Canon IXUS 相機拍照記錄。 （ 1） SSR 出現(xiàn)頻率 fc（ %） = c/n × 100， c 為搜索到的 SSR 數(shù)量， n 為無冗余 EST 數(shù)量；（ 2）SSR 平均分布距離 fN = N/c， N 為無冗余 EST 數(shù)量的總堿基數(shù)。采用 Popgene 軟件計算各 SSR 位點平均等位基因數(shù)、預期雜合度和理論雜合度；多態(tài)信息含量 計算，其中， Pi為第 i 個基因出現(xiàn)的頻率， n 為等位基因數(shù)。 2 結(jié)果與分析 2.1 轉(zhuǎn)錄組中 SSR 的分布及結(jié)構(gòu)特點 通過對萬壽菊轉(zhuǎn)錄組的 48 953 條 Unigene（序列總長約 51 818 161 kb）序列進行搜索，發(fā)現(xiàn)其中 20 666 條 Unigene 序列中含有 13 849 個 SSR 位點， 其中 4 299 條 Unigene 含有 1 個以上 EST-SSRZhang Huali， Cong Richen， Wang Maoliang， Dong Aixiang， Xin Haibo， Yi Mingfang， Guo Hua. Development of SSR molecular markers based on transcriptome sequencing of Tagetes erecta. 162 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 159 167. 位點。 SSR 發(fā)生頻率為 28.29%，平均每 2.51 kb 存在 1 個 SSR 位點。 萬壽菊花蕾轉(zhuǎn)錄組序列中的 SSR 類型較豐富，二核苷酸至六核苷酸總共 45 個重復類型。其中三核苷酸和四核苷酸重復出現(xiàn)頻率占優(yōu)勢，分別占總 SSR 的 50.16%和 20.94%；二核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復類型數(shù)量較少，分別占總數(shù)的 9.29%、 9.57%和 10.04%（表 2） 。所有 SSR 中，以4 次重復的 SSR 最多， 占 37.83%， 3 次重復的占 32.10%， 5 次和 6 次重復的分別占 12.06%和 10.27%（表 2） 。 萬壽菊轉(zhuǎn)錄組 SSR 重復單元的重復次數(shù)分布在 3 27 次之間，其中 3 10 次重復的 SSR 位點有 20 593 個，占總個數(shù)的 99.65%； 11 20 次重復的有 72 個，占 0.35%； 20 次重復以上的有 1 個。 表 2 萬壽菊 EST-SSR 基元及其重復數(shù)量的變異分析 Table 2 Analyses on repeat motif and its number variation in EST-SSR of Tagetes erecta L. 重復基元長度 Repeat motif length 重復次數(shù) Repeat number 總數(shù) In total 比例 / % Percentage 3 4 5 6 7 8 9 10 > 10 二核苷酸 Dinucleotide 855 501 272 148 81 64 1 921 9.29 三核苷酸 Trinucleotide 6 385 2 249 1 218 486 25 3 10 366 50.16 四核苷酸 Tetranucleotide 3 439 658 186 40 0 3 2 4 328 20.94 五核苷酸 Pentanucleotide 1 469 464 38 1 3 2 1 977 9.57 六核苷酸 Hexanucleotide 1 726 310 19 8 3 4 4 2 074 10.04 總數(shù) In total 6 634 7 817 2 492 2 122 993 306 148 81 73 20 666 100.00 百分比 /% Percentage 32.10 37.83 12.06 10.27 4.80 1.48 0.72 0.39 0.35 2.2 轉(zhuǎn)錄組 SSR 基序重復類型和頻率特征 由表 3 可知，二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸的重復基序類型總計 14 694 個，占 SSR 位點總數(shù)的 71.10%，二核苷酸的重復次數(shù)集中在 6 次以上，三核苷酸重復次數(shù)集中在 4 7 次之間，重復 8 次較少；四核苷酸重復次數(shù)集中在 3 4 次之間，沒有出現(xiàn) 7 次重復，重復 8 次極少。 從萬壽菊轉(zhuǎn)錄組 SSR 核苷酸基序類型來看，其 20 666 個 SSR 位點包含 370 種重復基元，二核苷酸至六核苷酸，重復分別有 3、 10、 32、 86 和 239 種。 從分布頻率來看（表 3），二核苷酸中出現(xiàn)最多 的重復基元是 AG/CT（ 864 個，占 4.18%） ，占二核苷酸重復總數(shù)的 44.98%。 三核苷酸中 出現(xiàn)最多的重復基元是 ATC/ATG（ 2 857 個，占 13.82%），占三核苷酸總數(shù)的27.56%，其次是 AAG/CTT（ 1 960 個，占 9.48%）、 ACC/GGT（ 1 926 個，占 9.32%）和 AAC/GTT（ 1 486 個， 7.19%） ，這 4 種基元占三核苷酸重復總數(shù)的 79.39%，在三核苷酸重復基元中，出現(xiàn)頻率最小的是 CCG/CGG（ 89 個， 0.43%） （表 3）。 在四核苷酸重復基元中，以 AAAC/GTTT、 AAAG/CTTT、 AATC/ATTG 和 ACAT/ATGT 為主（表 3），分別占四核苷酸總數(shù)的 17.47%、 11.62%、 10.37%和 10.19%。 五核苷酸中以 AAAAC/GTTTT 和 AACAC/GTGTT 出現(xiàn)頻率最高，分別占其總數(shù)的 8.19%和8.14%； 六核苷酸中出現(xiàn)頻率最高的是 AAGATG/ATCTTC 和 AAACAC/GTGTTT，分別占其總數(shù)的7.18%和 4.15%。 張華麗，叢日晨，王茂良，董愛香，辛海波，義鳴放，郭 華 . 基于萬壽菊轉(zhuǎn)錄組測序的 SSR 標記開發(fā) . 園藝學報， 2018， 45 (1)： 159 167. 163 表 3 萬壽菊 EST-SSR 中二、三、四堿基重復基元的類型及頻率 Table 3 Dinucleotide,trinucleotide and tetranucleotide EST-SSR repeat motifs and their frequency in ESTs of Tagetes erecta L. 重復基元類型 Repeat motif type 重復次數(shù) Repeat number 總計 Total 頻率 /% Frequency 3 4 5 6 7 8 > 8 AC/GT 318 198 91 42 697 3.37 AG/CT 343 215 130 90 864 4.18 AT/AT 194 88 51 176 360 1.74 AAC/GT 907 344 168 62 5 1 486 7.19 AAG/CTT 1 214 417 218 108 2 1 1 960 9.48 AAT/ATT 374 166 106 24 4 2 676 3.27 ACC/GGT 1 201 417 223 81 4 1 926 9.32 ACG/CGT 94 21 7 1 123 0.60 ACT/AG 66 29 20 4 119 0.58 AGC/CTG 514 181 100 30 5 830 4.02 AGG/CCT 214 49 28 7 2 300 1.45 ATC/ATG 1 735 608 343 168 3 2 857 13.82 CCG/CGG 66 17 5 1 89 0.43 AAAC/GTTT 620 99 28 9 756 3.66 AAAG/CTTT 392 79 27 4 1 503 2.43 AAAT/ATTT 292 35 7 4 338 1.64 AACC/GGTT 124 19 4 1 1 149 0.72 AACG/CGTT 22 1 23 0.11 AACT/AGTT 43 11 7 61 0.30 AAGC/CTTG 80 19 5 1 1 106 0.51 AAGG/CCTT 67 12 79 0.38 AAGT/ACTT 19 9 4 2 34 0.16 AATC/ATTG 350 75 18 6 449 2.17 AATG/ATTC 243 50 13 3 309 1.50 AATT/AATT 113 14 127 0.61 ACAG/CTGT 29 7 1 37 0.18 ACAT/ATGT 298 90 48 5 441 2.13 ACCC/GGGT 48 5 1 54 0.26 ACCG/CGGT 13 13 0.06 ACCT/AGGT 25 7 32 0.15 ACGC/CGTG 5 5 0.02 ACGT/ACGT 29 12 41 0.20 ACTC/AGTG 90 13 6 3 112 0.54 ACTG/AGTC 20 4 2 26 0.13 AGAT/ATCT 101 18 6 1 126 0.61 AGCC/CTGG 16 3 19 0.09 AGCG/CGCT 13 2 1 16 0.08 AGCT/AGCT 93 20 5 118 0.57 AGGC/CCTG 27 18 1 46 0.22 AGGG/CCCT 48 2 50 0.24 ATCC/ATGG 76 11 2 89 0.43 ATCG/ATCG 77 13 90 0.44 ATGC/ATGC 46 10 2 58 0.28 CCCG/CGGG 8 1 9 0.04 CCGG/CCGG 12 12 0.06 總計 Total 3 439 7 043 2 435 1 258 486 28 5 14 694 71.10 頻率 /% Frequency 16.64 34.08 11.78 6.09 2.35 0.14 0.02 71.10 Zhang Huali， Cong Richen， Wang Maoliang， Dong Aixiang， Xin Haibo， Yi Mingfang， Guo Hua. Development of SSR molecular markers based on transcriptome sequencing of Tagetes erecta. 164 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 159 167. 2.3 萬壽菊轉(zhuǎn)錄組 SSR 引物的有效性和多態(tài)性檢測 為了驗證引物的有效性，隨機挑選 36 對 EST-SSR 引物（包括二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸重復基元的 SSR 位點，重復次數(shù)在 5 9 次），以 20 個性狀不同的萬壽菊自交系基因組 DNA 為模板進行了 PCR 擴增。結(jié)果表明，其中編號為 5、 12、 26、 28、 30 和 35 的 6 條引物為無效引物；其余 30 對引物均可以擴增到預期產(chǎn)物。 通過 30 對有效引物擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析表明， 13 對引物呈現(xiàn)出多態(tài)性（圖 1，表 4） ，占有效引物的 43.33%。 圖 1 多態(tài)性標記在 20 個萬壽菊自交系材料中的擴增情況 Fig. 1 Amplification of polymorphic markers using 20 marigold varieties as templates 表 4 13 對萬壽菊多態(tài)性 SSR 引物信息 Table 4 Information of 13 pairs of polymorphic primers developed from T. erecta L. 編號 No. 重復基元 Motifs 引物序列（ 5 3） Primer sequence 退火溫度 / Annealing temperature GC 含量 /% GC content 產(chǎn)物預期大小 /bp Expected size 2 （ TCTC）5F： CCATACACACATCAGCAGAC 52 50 203 R： GAGCAGGTGATTGTGTGTGT 52 50 3 （ AAT）6F： GGAGCATAGGGTATCTGCTT 52 50 177 R： CGAAGCCTCCTCTTCAGATA 52 50 4 （ TTGT）6F： CACAAGAATGCTATCGCCAC 52 50 157 R： ATTGGCTAAAGCACAGACCG 52 50 6 （ GTAGG）5F： TCCATGGGCATACAAGGTGT 52 50 231 R： ACGACCTGCGAAGCATATTC 52 50 7 （ CACACG）7F： ATGCTCTCGATGGTGCCTTT 52 50 213 R： GACCAACTAATAGCTCTGTG 50 45 8 （ TGA）5， （ CAT）5F： CATCATCACCATTGGTCCTG 52 50 234 R： CCGCCTTATCTCGGAATGTA 52 50 10 （ TCC）5， （ GCT）5， （ TA）7F： TGAAGATGGTGAGGAAGAAG R： CAATTGCTAGCTAGATCCAC 50 50 45 45 279 張華麗，叢日晨，王茂良，董愛香，辛海波，義鳴放，郭 華 . 基于萬壽菊轉(zhuǎn)錄組測序的 SSR 標記開發(fā) . 園藝學報， 2018， 45 (1)： 159 167. 165 續(xù)表 4 編號 No. 重復基元 Motifs 引物序列（ 5 3） Primer sequence 退火溫度 / Annealing temperature GC 含量 /% GC content 產(chǎn)物預期大小 /bp Expected size 15 （ GA）8F： AAAGAACCAAGAGGGAGGCT 52 50 111 R： TCTAGTCCATACATCCCATC 50 45 18 （ CA）7： TCGTCGGTTGCTTGGATTTG 52 50 188 R： GAGTATGATTCAAAGCCACC 50 45 21 （ AT）6F： CACACGGTAACAATCCCTAG 52 50 201 R： GCTGAGGATTGTCTGATAAC 50 45 29 （ GTTTA）7F： TCATCCCATGATTTAGGCTC 50 45 242 R： CCAGAACCAGAAGAGAAGCA 52 50 33 （ GATGTA）6F： TGCTGGAACAGGTGAATCAC 52 50 242 R： CTTCTTCAAGCTCGCTTGCA 52 50 36 （ CCATCT）5F： GTAAGTGCACCATCACCATC 52 50 224 R： GAGTTTTGAGATGGAGGAGG 52 50 2.4 多態(tài)性標記位點多樣性分析 使用 13 個多態(tài)性標記對 20 份萬壽菊自交系遺傳多樣分析，擴增到 26 個等位基因；各 SSR 位點之間的有效等位基因數(shù)平均值為 1.477， 變化范圍為 1.051（ SSR7、 SSR8 和 SSR33） 1.980（ SSR10） ；香農(nóng)多樣性指數(shù)平均值為 0.408，變化范圍為 0.117 0.692；觀察雜合度和期望雜合度的平均值分別為 0.342 和 0.275，變化范圍分別為 0 0.900 和 0.05 0.512；各位點多態(tài)信息含量平均值為 0.608，變化范圍為 0.524 0.772（表 5） 。 表 5 13 對多態(tài)性引物多樣性分析 Table 5 Diversity of 13 pairs of polymorphic primers SSR 位點 SSR locus 有效等位基因數(shù) Effective number of alleles 香農(nóng)多樣性指數(shù) Shannons diversity index 觀察雜合度 Observed heterozygosity 期望雜合度 Expected heterozygosity 多態(tài)信息含量 Polymorphism information content SSR2 1.995 0.692 0.850 0.512 0.569 SSR3 1.782 0.631 0.650 0.450 0.772 SSR4 1.923 0.673 0.800 0.492 0.580 SSR6 1.105 0.198 0.100 0.097 0.545 SSR7 1.051 0.117 0.050 0.050 0.524 SSR8 1.051 0.117 0.050 0.050 0.524 SSR10 1.980 0.688 0.900 0.508 0.697 SSR15 1.219 0.325 0.000 0.185 0.590 SSR18 1.956 0.682 0.850 0.501 0.564 SSR21 1.105 0.199 0.100 0.097 0.707 SSR29 1.105 0.198 0.000 0.097 0.569 SSR33 1.051 0.117 0.050 0.050 0.524 SSR36 1.882 0.662 0.050 0.481 0.734 平均值 Average 1.477 0.408 0.342 0.275 0.608 3 討論 菊屬植物 SSR 標記對萬壽菊具有通用性（張華麗 等， 2016） ，但標記的數(shù)量和質(zhì)量遠不能滿足研究需要。轉(zhuǎn)錄組測序成為 SSR 標記開發(fā)的重要途徑（ Dutta et al.， 2011；王麗鴛 等， 2014； Zhai et al.， 2014；李榮華 等， 2016；宗宇 等， 2016） ，但基于轉(zhuǎn)錄組測序的萬壽菊 SSR 標記開發(fā)仍無相關(guān)報道。 已有報道，各類植物間 EST 的 SSR 分布頻率大不相同，頻率較低的種類包括：蝴蝶蘭（ 3.19%）Zhang Huali， Cong Richen， Wang Maoliang， Dong Aixiang， Xin Haibo， Yi Mingfang， Guo Hua. Development of SSR molecular markers based on transcriptome sequencing of Tagetes erecta. 166 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 159 167. （張水明 等， 2012） 、百合（ 5.98%） （楊素麗 等， 2008） 、砂梨（ 7.2%） （ Yue et al.， 2014） 、鷹嘴豆 （ 7.6%） （ Dutta et al.， 2011） 和辣椒 （ 7.83%） （劉峰 等， 2012） ； 頻率較高的種類有： 刺梨 （ 20.37%）（鄢秀芹 等， 2015） 、柑橘（ 21.74%） （ Jiang et al.， 2006）和蘿卜（ 23.79%） （ Wang et al.， 2012） ；處于中等頻率的有：紅掌（ 12.17%） （郁永明 等， 2015） 、蠟梅（ 12.35%） （李響 等， 2013） 、茶樹（ 14.7%） （ Wu et al.， 2013）和中國櫻桃 （ 15.62%） （宗宇 等， 2016） 。本研究中利用萬壽菊雄性不育系 S-121 花蕾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對 48 953 條 Unigene（序列總長約 51 818 161 kb）序列進行分析，發(fā)現(xiàn)有 13 849 個 SSR 位點， SSR 位點頻率為 28.29%，處于較高水平，這種差異可能源于兩個原因： 1）與物種、 SSR 位點搜索標準以及序列大小等有關(guān)（劉峰 等； 2012；鄢秀芹 等， 2015） ； 2）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于特定時期和特定器官，缺乏對物種整個基因組序列特征的代表性。 在各重復類型的 SSR 位點中，三和四核苷酸重復出現(xiàn)頻率占優(yōu)勢，分別占總 SSR 的 50.16%和20.94%； 二核苷</p>
個人主頁