結球甘藍CML家族基因及其在授粉后柱頭中的表達.pdf

園藝學報， 2018， 45 (11)： 2129 2140. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0177； http： /www. ahs. ac. cn 2129 收稿日期 ： 2018 07 07； 修回日期 ： 2018 11 02 基金項目 ： 國家自然科學基金項目( 31572127)；重慶市研究生科研創(chuàng)新項目（ CYS16076） * 同等貢獻者 * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： zhuliquanswu.edu.cn） 結球甘藍 CML 家族基因及其在授粉后柱頭中的表達 蒲 敏1,4,*，羅紹蘭1,*，廉小平2，曾 靜3，張賀翠1，劉倩瑩1，左同鴻1，朱利泉1,*（1西南大學農(nóng)學與生物科技學院，重慶 400715；2重慶市蔬菜重點實驗室，重慶 400715；3長江師范學院生命科學與技術學院，重慶 408100；4涪陵第十四中學校，重慶 408000） 摘 要： 利用 NCBI 和甘藍基因組數(shù)據(jù)庫篩選獲得了 76 個結球甘藍 CML 家族基因，其隨機分布在甘藍的 9 條染色體上，染色體上最多的有 12 個基因，最少有 1 個基因。分析發(fā)現(xiàn)該基因家族編碼蛋白氨基酸殘基長度在 109 365 個之間，分子量大多在 20 kD 左右，為小分子蛋白，且均含有 2 4 個保守的EF-hand 結構域。甘藍的 76 個 CML 基因依據(jù)與擬南芥的 CML 家族的進化關系及序列相似性分為 個亞家族，每個亞家族基因有較高的同源性，進化關系較近。經(jīng)亞細胞預測分析發(fā)現(xiàn)大部分蛋白在質膜和胞外表達，少量在質膜、細胞核內(nèi)和葉綠體等部位表達。數(shù)字表達譜分析發(fā)現(xiàn)在 76 個基因中，有 25個基因在自花和異花授粉后差異表達，其中 BoCML12、 BoCML42、 BoCML44、 BoCML45、 BoCML60、BoCML70、 BoCML71 和 BoCML74 等 8 個基因在自花和異花授粉后表達趨勢有較大差異，表明這 8 個基因以不同的方式參與調控甘藍自花和異花授粉后的反應過程，有可能與甘藍的自交不親和性相關。 關鍵詞： 甘藍； CML 家族基因；生物信息學；表達分析 中圖分類號： S 635.1 文獻標志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 11-2129-12 Bioinformatics and Expression Analysis After Pollination of Stigma of CML Family Genes in Brassica oleracea var. capitata PU Min1,4,*， LUO Shaolan1,*， LIAN Xiaoping2， ZENG Jing3， ZHANG Hecui1， LIU Qianying1， ZUO Tonghong1， and ZHU Liquan1,*（1College of Agronomy and Biotechnology， Southwest University， Chongqing 400715， China；2Key Laboratory in Olericulture of Chongqing， Chongqing 400715， China；3School of Life Science and Biotechnology， Yangtze Normal University， Chongqing 408100， China；4Fuling No. 14 Middle School， Chongqing 408000， China） Abstract： Seventy-six CML family genes in Brassica oleracea var. capitata were identified and characterized through B.oleracea genomics database and NCBI database.They are randomly distributed on 9 chromosomes. There are 12 genes at the most， and at least 1 gene. It was found that the amino acid residues of the family of encoded proteins ranged from 109 to 365， and the molecular weight was mostly about 20 kD. They were small molecular proteins and contained 2 4 conserved EF-hand domains. Pu Min， Luo Shaolan， Lian Xiaoping， Zeng Jing， Zhang Hecui， Liu Qianying， Zuo Tonghong， Zhu Liquan. Bioinformatics and expression analysis after pollination of stigma of CML family genes in Brassica oleracea var. capitata. 2130 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2129 2140. Phylogenetic analysis showed that these CML family genes could be classified into eight groups， combining with Arabidopsis CMLs and each subfamily genes have high homology and close evolutionary relationship. Subcellular predictive analysis showed that most of the proteins were expressed in the plasma membrane and extracellular membrane， and a few in the plasma membrane， nucleus and chloroplast. Among the 76 genes， 25 genes were differentially expressed after self-pollination and cross-pollination. Among them， 8 genes， such as BoCML12， BoCML42， BoCML44， BoCML45， BoCML60， BoCML70，BoCML71and BoCML74， have significant expression differences. The results indicated that these 8 genes were involved in the regulation of self-pollination and cross-pollination of cabbage in different ways and may be related to the self-incompatibility of cabbage. Keywords： Brassica oleracea var. capitata； CML family genes； bioinformatics； expression analysis 在植物細胞中，鈣離子 Ca2+作為第二信使廣泛參與了細胞信號傳導過程，通過它將細胞信號傳遞給下游響應元件，如轉錄因子、轉運蛋白和細胞骨架相關蛋白等，從而調節(jié)細胞代謝、跨膜轉運和基因表達等生物學過程，對調控植物生長發(fā)育和脅迫響應等有重要作用（ DeFalco et al.， 2010；Dodd et al.， 2010； Batisti & Kudla， 2012） 。不同的外界刺激能誘導植物細胞產(chǎn)生特異的 Ca2+信號變化，其中有 4 種常見的鈣信號變化：鈣瞬變、鈣振蕩鈣信號的空間定位和鈣波，這些 Ca2+信號變化來源于胞外 Ca2+和胞內(nèi)鈣庫 （如液泡、 內(nèi)質網(wǎng)等） 通過膜上的轉運蛋白和通道蛋白來完成的 Ca2+輸入和輸出。胞內(nèi)鈣信號的改變首先由鈣感受器接收并解碼，再由鈣感受器互作蛋白將信號傳遞到下游，從而激活下游相關離子通道活性和早期響應基因的表達。其中，鈣感受器對鈣信號的準確感知和解碼是鈣信號轉導途徑中關鍵性的調控步驟（ Kudla et al.， 2010；鄭仲仲 等， 2013） 。 目前研究發(fā)現(xiàn)主要有 3 類鈣感應系統(tǒng)：鈣調素蛋白 /類鈣調素蛋白家族（ CaM/CML） 、鈣依賴性蛋白激酶家族（ CDPK）和鈣調磷酸酶 B 類蛋白家族（ CBL/CIPK） ，它們都含有復雜的 EF 手型結構域（ EF-hand domain） 。 EF-hand 結構域是一種具有鈣結合位點的螺旋環(huán)螺旋結構，能夠高親和力的結合 Ca2+（ Bouché et al.， 2005； McCormack et al.， 2005） 。其中， CML 家族是植物中所特有一種 Ca2+感受器。近年來，在擬南芥、水稻和大豆中分別鑒定出 50、 32 和 68 個 CML 家族基因，它們除了含有中 2 6 個 EF-hand 結構域外， 還沒有發(fā)現(xiàn)其他已被證明的保守結構域 （ Azimzadeh et al.，2009） 。最近的研究表明， CML 基因家族廣泛參與調控植物多個生物學反應過程。擬南芥 CML42功能缺失突變體中表皮毛的分枝數(shù)增加， CML19 和 CML20 能夠與 TON1 蛋白互作，在細胞表層微管組織的形成過程中有重要作用（ Azimzadeh et al.， 2009； Dobney et al.， 2009） 。擬南芥 CML24 功能敲除突變體開花延遲，而功能獲得性突變體開花提前（ Tsai et al.， 2007） ；此外，它還能通過結合ATG4b（在自體吞噬過程中起作用的半胱氨酸蛋白酶）正向調節(jié)細胞的自體吞噬過程（ Wang et al.，2011； Liu & Bassham， 2012； Tsai et al.， 2013） 。 CML21 的過表達抑制了花粉管的伸長并且增加了花粉管的寬度（ Zhou et al.， 2009） 。 CML25 可能通過調節(jié)依賴 Ca2+的 K+流動而在花粉的萌發(fā)和生長中發(fā)揮作用（ Wang et al.， 2015） 。擬南芥 CML24 通過調節(jié)細胞內(nèi)的 Ca2+濃度以及細胞骨架來影響花粉管的萌發(fā)和生長（ Yang et al.， 2014） 。 CML12 與 PINOID（參與調節(jié)生長素輸出載體 PIN1 定位絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶）以 Ca2+依賴的方式互作而負向調節(jié) PINOID 的激酶活性，從而降低頂端生長素的外運（ Benjamins et al.， 2003； Friml et al.， 2004） 。水 稻 CML4 受鹽和干旱誘導，過量表達 CML4增強抗旱性（ Yin et al.， 2015） 。擬南芥 CML24、 CML18、 CML9 等基因都參與植物非生物脅迫響應過程（ Magnan et al.， 2008； Chinpongpanich et al.， 2012； Leba et al.， 2012； Munir et al.， 2016） 。 蒲 敏，羅紹蘭，廉小平，曾 靜，張賀翠，劉倩瑩，左同鴻，朱利泉 . 結球甘藍 CML 家族基因及其在授粉后柱頭中的表達 . 園藝學報， 2018， 45 (11)： 2129 2140. 2131 目前關于甘藍 CML 家族基因研究的報道較少。本研究中通過生物信息學分析方法，利用 NCBI數(shù)據(jù)庫和甘藍基因組數(shù)據(jù)庫等篩選獲得了 76 個結球甘藍 CML 家族基因，并對其序列信息、進化關系和在不同授粉處理后甘藍柱頭中的表達模式等進行了分析，以期為以后甘藍 CML 家族基因的功能研究提供了理論依據(jù)和參考。 1 材料與方法 1.1 材料及處理 以西南大學十字花科蔬菜研究所選育的自交不親和結球甘藍高代自交系 A4 和 F1 為材料。 A4為 S28 單倍型， F1為 S7 單倍型，二者異交親和。于 2016 年 4 月在開花前 1 2 d 將長勢相同的 A4花蕾人工去雄，用新鮮 F1花粉授粉 0、 15、 30 和 60 min 精細處理，簡稱雜交（ CP）組。用新鮮 A4花粉給去雄的 A4柱頭自花授粉 0、 15、 30 和 60 min 精細處理，簡稱自交（ SI）組。處理時間到后，快速掃去柱頭上的花粉，取下整個飽和授粉的花柱，立即放入液氮中，后置于 80 保存?zhèn)溆谩?1.2 甘藍 CML 家族基因鑒定及序列比對與進化分析 在 NCBI 數(shù)據(jù)庫 （ https： /www.ncbi.nlm.nih.gov/） 和甘藍基因組數(shù)據(jù)庫 （ http： /www.ocri-genomics. org/bolbase/index.html）中 通過 Blast 比對，檢索 CML 基因家族的所有成員。利用 ExPASy-ProtParam tool（ http： /www.expasy.org/）分析蛋白的理化性質，用 Smart（ http： /smart.embl-heidelberg.de/） 、Swiss-model（ http： /swissmodel.expasy.org/） 和 InterProScan（ http： /www. ebi.ae.uk/interpro/scan.html）等在線軟件分析預測蛋白質的功能位點和高級結構域， 用 WOLF PSORT（ http： /www.genscript.com/ wolf-psort.html）和 Soft berry（ http： /linux1.softberry.com/berry.phtml）在線預測蛋白的亞細胞定位。 利用 ClustalX2 軟件（ Larkin et al.,2007）對甘藍 CML 基因家族編碼蛋白進行多序列比對，用MEGA5 軟件， 采用鄰接法 （ Neighbor-joining） 構建系統(tǒng)進化樹， 其他參數(shù)為系統(tǒng)默認 （ Tamura et al.，2011） 。 1.3 數(shù)據(jù)表達譜測序分析 參照植物總 RNA 提取試劑盒（ RNAprep Pure Plant Kit， TIANGEN）說明書提取不同甘藍樣品的總 RNA，送北京百邁克生物科技有限公司，在 IlluminaHiSeq2000 平臺進行雙端測序。各樣品的有效數(shù)據(jù)均達到 7.31 Gb， Q30 堿基百分比都在 93.22%以上。經(jīng)過質量控制之后得到的高質量的有效數(shù)據(jù)，利用 TopHat2 將其與參考基因組進行序列比對。同時采用 FPKM（ Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped） 來量化基因的表達水平。 基于 CML 家族基因的 FPKM 結果，采用 Multiple Array Viewer 軟件繪制熱圖，進行表達聚類分析。 1.4 差異基因的熒光定量表達分析 利用熒光定量 PCR 進一步確定從數(shù)據(jù)表達譜篩選出的 8 個表達差異較大的 CML 家族基因在授粉后的表達模式。根據(jù)各基因序列設計特異引物（表 1） ，以同期樣品 RNA 逆轉錄得到的 cDNA 為模板，參照 SYBR®Premix Ex TaqTM說明書，以 Actin3 為內(nèi)參，在 7500 型實時熒光定量 PCR 儀上進行 PCR 擴增。反應體系為 20 L： 2× SYBR® Premix Ex TaqTM10 L，引物各 1 L， cDNA 模板 1 L，加超純水至 20 L。擴增程序為 95 預變性 1 min； 95 15 s， 60 15 s， 72 30 s，共 40 個循環(huán)。 Pu Min， Luo Shaolan， Lian Xiaoping， Zeng Jing， Zhang Hecui， Liu Qianying， Zuo Tonghong， Zhu Liquan. Bioinformatics and expression analysis after pollination of stigma of CML family genes in Brassica oleracea var. capitata. 2132 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2129 2140. 表 1 定量 PCR 引物表 Table 1 Primers used in RT-PCR 基因 Gene 正向引物（ 5 3） Forward primer 反向引物（ 5 3） Reverse primer BoCML12 AGGACGGAGACGGTCGGAT CTTCATCTCCTATCTCATCCTCGTC BoCML42 GAGCGAAAATCCTGAAACCAC CGAATGCTTCTCGGACCTC BoCML44 GATCAGGACAAGAACGGGCTC GTTGTTGCTGTTAGCGAGGGAG BoCML45 GCTCGCATCTTTTTGTCCAG CAAACTTGACATCTCCTTGGAAC BoCML60 CCTGAAGAAGAGACAACGGATAC ATTCTTCAAGGCTTTTGGACTC BoCML70 GCTCGCATCTTTTTATCCACA CACTTCCTCTAAGCTCGCCTC BoCML71 CTTAGGACTTCTCGCCGACTC ATCATTCTCCTGCAGTTCTCAAG BoCML74 GACCACAAGCCGCACAAA CCTGGAAGCAAGTCACGATG Actin3 ATGGAAACATCGTCCTCAGTGGTG AGTGCTGAGGGATGCCAAGATG 2 結果與分析 2.1 甘藍 CML 家族基因鑒定及序列分析 根據(jù)擬南芥 CML 基因家族序列在 NCBI 和甘藍基因組數(shù)據(jù)庫通過同源序列比對，手工去除重復序列后，共得到 76 個 CML 家族基因序列（表 2） 。保守結構域分析發(fā)現(xiàn)該基因家族編碼蛋白氨基酸殘基長度在 109 365 個之間，分子量大多在 20 kD 左右，為小分子蛋白，且均含有 2 4 個保守的 EF-hand 結構域；除 BoCML1 的理論等電點在 8.53 外，其他的等電點（ pI）均在 7 以下，說明構成 BoCML 家族蛋白的氨基酸大部分為酸性氨基酸。 76 個 CML 家族基因隨機分布在甘藍的 9 條染色體上（圖 1） ，其中第 3 條和第 5 條染色體分布最多，各分布有 12 個基因，第 2 條染色體分布最少，只有 1 個基因，第 9 號染色體有 7 個基因，第 1 和第 6 條染色體各有 9 個基因，第 4 和第 7 條染色體各有 8 個基因，第 8 號染色體分布有 10 個基因。 經(jīng)亞細胞預測分析發(fā)現(xiàn)大部分蛋白在質膜和胞外表達，少量在質膜、細胞核內(nèi)和葉綠體等部位有表達。 圖 1 結球甘藍 CML 家族基因在染色體上的分布 Fig. 1 Genomic distribution of CML genes on chromosomes of Brassica oleracea var. capitata 蒲 敏，羅紹蘭，廉小平，曾 靜，張賀翠，劉倩瑩，左同鴻，朱利泉 . 結球甘藍 CML 家族基因及其在授粉后柱頭中的表達 . 園藝學報， 2018， 45 (11)： 2129 2140. 2133 表 2 結球甘藍 CML 基因家族基本信息 Table 2 Basic information of CML gene family of Brassica oleracea var. capitata 編號 No. 基因 Gene 登錄號 Gene ID 編碼區(qū) /bp Coding region CDS/ bp 預測的蛋白 Predicted protein 亞細胞定位 Subcellular localization EF-hand氨基酸 /aaAmino acid分子量 /kD Formula weightpI 1 BoCML1 106315659 688 570 4 189 21.53 8.53 質膜 Plasma membrane 2 BoCML2 106341076 646 459 4 152 17.16 4.35 質膜 Plasma membrane 3 BoCML3 106310180 805 459 4 152 17.25 4.59 質膜 Plasma membrane 4 BoCML4 106333747 506 462 4 153 17.39 4.29 質膜、核 Plasma membrane， nucleus 5 BoCML5 106327736 673 450 4 149 17.00 4.38 質膜 Plasma membrane 6 BoCML6 106293836 876 462 4 153 17.34 4.23 質膜、核 Plasma membrane， nucleus 7 BoCML7 106296877 705 615 4 204 23.32 4.54 核 Nucleus 8 BoCML8 106310600 823 603 4 200 22.71 4.43 核 Nucleus 9 BoCML9 106331793 937 645 4 214 24.25 4.91 核 Nucleus 10 BoCML10 106337204 933 636 4 211 23.70 4.81 核 Nucleus 11 BoCML11 106309401 462 462 3 153 17.59 4.50 質膜、核 Plasma membrane， nucleus 12 BoCML12 106333401 779 465 4 154 17.59 4.55 細胞質 Cytoplasm 13 BoCML13 106315454 809 459 4 152 17.36 4.37 細胞質 Cytoplasm 14 BoCML14 106310861 815 456 4 151 16.99 4.37 液泡 Vacuole 15 BoCML15 106299297 570 456 4 151 17.01 4.09 細胞質 Cytoplasm 16 BoCML16 106310681 690 462 4 153 17.51 3.97 質膜、核 Plasma membrane， nucleus 17 BoCML17 106336819 810 456 4 151 16.97 4.18 細胞質 Cytoplasm 18 BoCML18 106311087 613 330 2 109 12.27 4.20 質膜、核 Plasma membrane， nucleus 19 BoCML19 106332076 709 465 4 154 17.53 3.90 細胞質 Cytoplasm 20 BoCML20 106293446 783 468 4 155 17.65 4.05 細胞質 Cytoplasm 21 BoCML21 106342915 842 543 4 180 20.54 4.16 細胞質 Cytoplasm 22 BoCML22 106309698 803 447 3 148 16.50 4.78 細胞質、質膜 Cytoplasm， plasma membrane23 BoCML23 106292602 792 447 3 148 16.47 4.78 細胞質、核 Cytoplasm， nucleus 24 BoCML24 106320002 791 447 3 148 16.46 4.65 細胞質、質膜 Cytoplasm， plasma membrane25 BoCML25 106311269 572 471 4 156 16.98 4.17 質膜、核 Plasma membrane， nucleus 26 BoCML26 106294278 474 474 4 157 17.14 4.23 質膜、核 Plasma membrane， nucleus 27 BoCML27 106303756 800 489 4 162 17.71 4.45 質膜 Plasma membrane 28 BoCML28 106316270 697 486 4 161 17.54 4.27 質膜 Plasma membrane 29 BoCML29 106293886 1 085 501 4 166 18.64 4.81 質膜 Plasma membrane 30 BoCML30 106342993 722 510 4 169 18.71 4.49 細胞質 Cytoplasm 31 BoCML31 106293459 824 519 4 172 19.76 4.84 質膜、核 Plasma membrane， nucleus 32 BoCML32 106326955 805 510 4 169 19.60 4.81 質膜 Plasma membrane 33 BoCML33 106310973 1 082 678 4 225 25.96 4.44 細胞外、葉綠體、過氧化物酶體 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome34 BoCML34 106306816 1 011 687 4 228 26.51 4.51 細胞外、葉綠體、過氧化物酶體 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome35 BoCML35 106305895 987 693 2 230 26.61 5.07 細胞外、葉綠體、過氧化物酶體 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome36 BoCML36 106311713 1 008 702 2 233 26.67 5.33 細胞外、葉綠體、過氧化物酶體 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome37 BoCML37 106298520 712 462 4 153 17.02 4.45 質膜、核 Plasma membrane， nucleus 38 BoCML38 106337151 776 477 4 158 17.41 4.88 核 Nucleus 39 BoCML39 106293479 914 570 4 189 20.55 4.60 細胞質 Cytoplasm 40 BoCML40 106305118 798 555 4 184 20.22 4.66 細胞質 Cytoplasm 41 BoCML41 106335804 773 552 4 183 20.07 4.74 細胞質 Cytoplasm 42 BoCML42 106298504 756 480 4 159 17.60 4.41 質膜、核 Plasma membrane， nucleus Pu Min， Luo Shaolan， Lian Xiaoping， Zeng Jing， Zhang Hecui， Liu Qianying， Zuo Tonghong， Zhu Liquan. Bioinformatics and expression analysis after pollination of stigma of CML family genes in Brassica oleracea var. capitata. 2134 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2129 2140. 續(xù)表 2 編號 No. 基因 Gene 登錄號 Gene ID 編碼區(qū) /bp Coding region CDS/bp 預測的蛋白 Predicted protein 亞細胞定位 Subcellular localization EF-hand氨基酸 /aa Amino acid分子量 /kD Formula weightpI 43 BoCML43 106427179 902 534 4 177 18.71 4.19 質膜、 線粒體 Plasma membrane， mitochondria44 BoCML44 106307408 776 534 4 177 18.75 4.18 質膜、細胞質 Plasma membrane， cytoplasm45 BoCML45 106301202 762 567 2 188 21.85 4.45 細胞外、 葉綠體 Extracellular fluid， chloroplast46 BoCML46 106292428 399 399 4 132 15.1 4.62 細胞外、過氧化物酶體 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome47 BoCML47 106317509 629 414 4 137 15.88 4.84 細胞外、葉綠體、過氧化物酶體 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome48 BoCML48 106320619 571 432 4 143 16.45 4.44 質膜、核 Plasma membrane， nucleus 49 BoCML49 106341079 432 432 4 143 15.85 4.26 核 Nucleus 50 BoCML50 106294128 514 399 4 132 14.68 4.26 細胞外、葉綠體、過氧化物酶體 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome51 BoCML51 106299518 625 402 4 133 14.87 4.07 核 Nucleus 52 BoCML52 106336975 1 026 642 4 213 23.18 4.63 細胞外、葉綠體、過氧化物酶體 Extracellular fluid,chloroplast， peroxisome53 BoCML53 106336749 1 112 654 4 217 23.47 4.44 細胞外、過氧化物酶體 Extracellular fluid， peroxisome 54 BoCML54 106292802 1 020 657 4 218 23.90 4.53 細胞外、過氧化物酶體 Extracellular fluid， peroxisome 55 BoCML55 106315943 877 555 4 184 20.45 4.63 質膜 Plasma membrane 56 BoCML56 106298973 741 540 4 179 20.47 4.79 細胞外、過氧化物酶體 Extracellular fluid， peroxisome 57 BoCML57 106298447 711 543 4 180 20.57 4.76 質膜 Plasma membrane 58 BoCML58 106299503 638 510 4 169 19.11 4.57 細胞外、過氧化物酶體 Extracellular fluid， peroxisome 59 BoCML59 106295164 852 426 2 141 16.24 4.77 細胞外、過氧化物酶體 Extracellular fluid， peroxisome 60 BoCML60 106333174 628 426 2 141 16.34 4.69 細胞外、過氧化物酶體 Extracellular fluid， peroxisome 61 BoCML61 106303908 834 612 4 203 22.65 5.27 細胞外、過氧化物酶體 Extracellular fluid， peroxisome 62 BoCML62 106333126 743 555 3 184 20.43 4.78 細胞外、過氧化物酶體 Extracellular fluid， peroxisome 63 BoCML63 106321023 820 576 3 191 21.15 4.24 細胞外 Extracellular fluid 64 BoCML64 106303869 951 561 3 186 20.69 4.37 細胞外 Extracellular fluid 65 BoCML65 106325716 733 582 3 193 21.87 4.84 細胞外 Extracellular fluid 66 BoCML66 106304901 667 549 3 182 20.47 4.41 細胞外 Extracellular fluid 67 BoCML67 106292783 908 465 3 154 17.98 4.38 葉綠體 Chloroplast 68 BoCML68 106337738 714 591 2 196 22.57 4.92 細胞外 Extracellular fluid 69 BoCML69 106296834 850 582 2 193 22.49 5.15 細胞外 Extracellular fluid 70 BoCML70 106316925 721 555 2 184 21.42 4.50 細胞外 Extracellular fluid 71 BoCML71 106319711 1 015 597 2 198 22.69 4.79 細胞外 Extracellular fluid 72