番茄過(guò)表達(dá)SlMYB102對(duì)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響.pdf

園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (8)： 1523 1534. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0001； http： /www. ahs. ac. cn 1523 收稿日期 ： 2018 03 05； 修回日期 ： 2018 05 11 基金項(xiàng)目 ： 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 31672170） ；山東省泰山學(xué)者建設(shè)工程項(xiàng)目（ ts20130932） ；山東省“雙一流”專(zhuān)項(xiàng)建設(shè)基金項(xiàng)目（ SYL2017YSTD06） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： zhrensdau.edu.cn） 番茄過(guò)表達(dá) SlMYB102對(duì)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響 張 旭，陳麗琛，任仲海*（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心 /農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018） 摘 要： 番茄（ Solanum lycopersicum L.）基因組中已鑒定到 121 個(gè) R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子，但其中絕大多數(shù)的生物學(xué)功能仍然未知。為探究 R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因 SlMYB102 的功能，從 Micro-Tom番茄中，利用 PCR 技術(shù)克隆了 SlMYB102 的編碼區(qū)，全長(zhǎng)為 1 089 bp。保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，SlMYB102 蛋白包含兩個(gè)保守的 MYB 結(jié)構(gòu)域，與馬鈴薯的 StMYB34 同源性最高。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，SlMYB102 編碼的蛋白定位于細(xì)胞核中。 SlMYB102 在根、莖、葉、花和未綠熟、紅熟果實(shí)中均有表達(dá)，在莖、葉、花中表達(dá)量較高。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將 35S:SlMYB102 轉(zhuǎn)入番茄，獲得了兩個(gè)過(guò)表達(dá)株系。與野生型相比，過(guò)表達(dá)株系種子萌發(fā)速率明顯升高，而植株高度、葉面積、地上部及地下部的鮮質(zhì)量均顯著降低。顯微觀察結(jié)果表明，與野生型相比，過(guò)表達(dá)株系葉片表皮細(xì)胞面積大小并沒(méi)有變化，推測(cè)過(guò)表達(dá) SlMYB102 是通過(guò)減少細(xì)胞分裂來(lái)抑制番茄植株的生長(zhǎng)。 關(guān)鍵詞： 番茄； SlMYB102；過(guò)表達(dá)；生長(zhǎng)發(fā)育 中圖分類(lèi)號(hào)： S 641.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 08-1523-12 Effects of Overexpression of SlMYB102 on the Tomato Seed Germination and Growth ZHANG Xu， CHEN Lichen， and REN Zhonghai*（ College of Horticultural Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Shandong Collaborative Innovation Center of Fruit Vegetable Quality and Efficient Production， Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops in Huang-Huai Region， Ministry of Agriculture， State Key Laboratory of Corp Biology， Taian，Shandong 271018， China） Abstract： A total of 121 R2R3-MYB transcription factors were identified in the tomato（ Solanum lycopersicum L.） genome. But the biological function for most of these transcription factors was not clear. To explore the function of SlMYB102， its coding region of 1 089 bp was cloned from Micro-Tom tomato（ WT） by PCR. Conserved domain and phylogenetic analysis showed that SlMYB102 included two conserved domanins of MYB and shared the highest similarity with StMYB34. Subcellular localization analysis indicated that the protein encoded by SlMYB102 was located in the nucleus. SlMYB102 was expressed in all tissues， and relatively higher expression level was observed in stem， leaf and flower. Two transgenic tomato lines overexpressing SlMYB102 were obtained through Agrobacterium-mediated Zhang Xu， Chen Lichen， Ren Zhonghai. Effects of overexpression of SlMYB102 on the tomato seed germination and growth. 1524 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (8)： 1523 1534. transformation. The germination rate of the seeds from the transgenic lines was faster than that from WT，while the plant height， leaf area， fresh weight of shoot and root were all decreased. However， the leaf epidermal cell size did not change in the transgenic lines compared with WT. Therefore， the over- expression of SlMYB102 may negatively regulate plant growth by reducing cell division in tomato. Keywords： tomato； SlMYB102； overexpression； development 番茄（ Solanum lycopersicum L.）是在世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要蔬菜作物，同時(shí)也是一種應(yīng)用于科學(xué)研究的模式植物?；蚪M測(cè)序的完成，為番茄功能基因研究提供了廣闊空間（ Tomato Genome Consortium， 2012） 。 R2R3-MYB 作為 MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族中數(shù)量最多的一類(lèi)，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的作用（ Dubos et al.， 2010） 。如在擬南芥中， AtGL1 和 AtMYB23 可以調(diào)控葉表皮毛的形成（ Kirik et al.， 2005） ， AtMYB37/RAX1、 AtMYB38/RAX2/BIT、 AtMYB84/RAX3 可以調(diào)控腋生分生組織形成 （ Keller et al.， 2006； Muller et al.， 2006） ， AtMYB91/AS1 可以調(diào)節(jié)芽和葉的形成 （ Byrne et al.， 2000） ， AtMYB59可以調(diào)控根系的生長(zhǎng)（ Mu et al.， 2009） ， AtMYB38 和 AtMYB18/LAF1 可以調(diào)節(jié)下胚軸的伸長(zhǎng)（ Hong et al.， 2008； Yang et al.， 2009） ，過(guò)表達(dá) AtMYB41 使植株矮化（ Cominelli et al.， 2008） ；在棉花中，GhMYB25 和 GhMYB109 可以調(diào)節(jié)纖維的發(fā)育（ Pu et al.， 2008； Machado et al.， 2009） ；在煙草中，過(guò)表達(dá) NtMYB1、 NtAn2 可以促進(jìn)花青素積累（ Pattanaik et al.， 2010； Meng et al.， 2014） ，將 NbPHAN沉默后影響葉片的發(fā)育（ Huang et al.， 2013） ；在蘋(píng)果中， MdGAMYB 可以調(diào)控花芽發(fā)育（樊勝 等，2017） ；在茄子中， SmMYB 可以正調(diào)控花青素的合成（邵文婷 等， 2013） ；在番茄中， SlMYB12 可以調(diào)控果實(shí)果皮黃酮醇的合成（ Adato et al.， 2009； Fernandez-Moreno et al.， 2016） ，過(guò)表達(dá)SlMYB75/SlAN2 和 SlANT1 促進(jìn)花青素的合成 （ Kiferle et al.， 2015； Meng et al.， 2015） ， SlMYB189/Blind和 SlMYB117/Trifoliate 可以調(diào)控側(cè)生器官的發(fā)育和腋分生組織的形成 （ Schmitz et al.， 2002； Naz et al.，2013） 。 目前，在番茄中已鑒定到 121 個(gè) R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子（ Zhao et al.， 2014）,但是絕大多數(shù)的功能亟待研究。轉(zhuǎn)錄因子 SlMYB102 功能未知，為確定其生物學(xué)功能，本研究中克隆了 SlMYB102，對(duì)比分析其與其他物種 R2R3-MYB 蛋白的同源性，并進(jìn)行亞細(xì)胞定位。通過(guò)轉(zhuǎn)基因分析初步發(fā)現(xiàn)SlMYB102 在調(diào)節(jié)番茄種子萌發(fā)及植株生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，為揭示 R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制提供了理論支持。 1 材料與方法 1.1 植物材料 試驗(yàn)材料為矮生番茄（ Solanum lycopersicum L.） Micro-Tom （野生型， WT）及 SlMYB102 轉(zhuǎn)基因株系 （ OE） 。 2017 年春季， 試驗(yàn)材料在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物生長(zhǎng)室 （光照 18.5 klx，光照時(shí)長(zhǎng) 16 h、晝夜溫度 28 /18 、濕度 80%）中培養(yǎng)。取野生型幼苗的根、莖、葉、開(kāi)花當(dāng)天的花、綠熟期和成熟期的果實(shí)，用液氮速凍保存，用于 RNA 的提取。 1.2 進(jìn)化樹(shù)分析 在番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（ https： /solgenomics.net）中獲得 SlMYB102 的蛋白序列，然后在番茄、張 旭，陳麗琛，任仲海 . 番茄過(guò)表達(dá) SlMYB102 對(duì)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (8)： 1523 1534. 1525 擬南芥、 水稻、 棉花、 馬鈴薯、 柑橘等 6 個(gè)物種基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中用 BLAST 進(jìn)行分析， 參照分類(lèi) （ Zhao et al.， 2014）下載 R2R3-MYBC7 類(lèi)的同源蛋白序列，利用 MEGA6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 1.3 SlMYB102-GFP 融合表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位 測(cè)序正確的質(zhì)粒 pEASY + SlMYB102 用 BamH、 Kpn酶切后，連接到用相同酶酶切的亞細(xì)胞定位載體 pROK上，得到 SlMYB102-GFP 融合表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。以 pEASY-GFP 空載為陽(yáng)性對(duì)照， 將陽(yáng)性對(duì)照及融合表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮,培養(yǎng) 48 h 后制片 （武丹 等， 2017） ，在 BX51 顯微鏡下觀察。 1.4 番茄 RNA 的提取和 SlMYB102 表達(dá)水平分析 利用 Trizol 法提取番茄嫩葉總 RNA，采用 Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（ Thermo 公司，中國(guó)上海）完成反轉(zhuǎn)錄 cDNA 第一鏈的合成。 qRT-PCR 采用 TransStart Tip Green qPCR SuperMix（ +Dye） （全式金生物技術(shù)有限公司，中國(guó)北京） ，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。引物（表 1）的合成及目的基因測(cè)序均由華大基因公司（中國(guó)青島）完成。 表 1 目的基因及熒光定量基因引物序列 Table 1 Primer sequences of target genes for cloning and qRT-PCR 用途 Use 引物名稱(chēng) Primer name 序列（ 5 3） Sequence SlMYB102 的克隆 Amplification of SlMYB102 轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證 PCR confirmation of the OE lines 定量?jī)?nèi)參引物 qRT-PCR primers for inner reference SlMYB102 定量引物 qRT-PCR primers for SlMYB102 SlMYB102-F GGATCCATGGGTAGAGCTCCTTGT SlMYB102-R1TCGACTTACATAAATTCATTAGT 35S-F AGCACGACACACTTGTCT SlMYB102-R2GCACATGGCCTAACAATC Actin-F CTGGATTGGAGGCTCTATActin -R GCATCTCTGGTCCAGTAGG qRT-SlMYB102-F GCTGGGCTTCAAAGATGT qRT-SlMYB102-R CTACCAGGTAAACGTGCA 1.5 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化 在番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（ https： /solgenomics.net）中獲得 SlMYB102（ Solyc02G079280.2）的 CDS序列，利用 Primer5 軟件設(shè)計(jì)引物 SlMYB102-F/R1（表 1） ，并分別加入酶切位點(diǎn) BamH、 Kpn。以 Micro-Tom番茄嫩葉的 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?94 預(yù)變性 5 min，94 變性 30 s， 56 退火 30 s， 72 延伸 70 s， 32 個(gè)循環(huán)； 72 后延伸 10 min。 PCR 產(chǎn)物用 1.2%瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶，連接到克隆載體 pEASY 進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒 pEASY + SlMYB102 用 BamH、 Kpn酶切后，連接到以相同酶酶切的表達(dá)載體 pBI121 上，得到pBI121-SlMYB102 過(guò)表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。 將番茄野生型的種子置于超凈工作臺(tái)上用 75%乙醇消毒 2 min， 4%次氯酸鈉消毒 15 min，滅菌水沖洗 3 4 次，將種子播在組培瓶中，暗培養(yǎng)至子葉長(zhǎng)出后移至光下，培養(yǎng)條件為晝夜溫度 28 / 18 ，光照 16 h，待子葉展開(kāi)時(shí)用于目的基因的轉(zhuǎn)化。參照付超等（ 2013）建立的番茄遺傳再生體系并略有改動(dòng)，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等過(guò)程獲得卡那霉素抗性植株。結(jié)合抗生素篩選、 PCR 和 qRT-PCR 檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平，鑒定過(guò)表達(dá)株系。 Zhang Xu， Chen Lichen， Ren Zhonghai. Effects of overexpression of SlMYB102 on the tomato seed germination and growth. 1526 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (8)： 1523 1534. 圖 1 SlMYB102 的擴(kuò)增 Fig. 1 The amplification of SlMYB102 gene 1.6 轉(zhuǎn)基因番茄葉片顯微結(jié)構(gòu)分析與生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 參照 DIC 顯微分析方法 （ Han et al.， 2018） 并略有改動(dòng)。 選取野生型及轉(zhuǎn)基因株系 （ OE-1、 OE-2）完全展開(kāi)的功能葉，用尖頭鑷子取葉表皮，將樣品用 14%冰醋酸和 84%乙醇的混合液浸泡過(guò)夜，脫色， 然后用 75%乙醇浸泡， 待脫色完全后用三氯水合乙醛溶液 （水合三氯乙醛 200 g， 甘油 15.84 mL，蒸餾水 50 mL）浸泡 30 min，用純水清洗后制片，在微分干涉顯微鏡（ DIC）模式下觀察葉片細(xì)胞并拍照。每個(gè)樣品隨機(jī)選取 3 處視野拍照，使用 Image J 軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞面積。將野生型及轉(zhuǎn)基因純和株系的種子置于超凈工作臺(tái)上用 75%乙醇消毒 2 min， 4%的次氯酸鈉消毒 15 min，最后用滅菌水沖洗 3 4 次，用高溫滅菌鑷子將種子播在只含 MS 的播種板中。每個(gè)播種板中播種 30 粒種子，在28 下暗培養(yǎng)。分別在播種 0、 40、 45、 50、 60 h 統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況（種子露白即認(rèn)為已萌發(fā)） 。分別統(tǒng)計(jì) 6 周齡的株高和第 3 片真葉葉面積以及地上部、地下部的鮮樣質(zhì)量。 上述每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù) 3 次。使用 DPS 軟件進(jìn)行顯著性分析。 2 結(jié)果與分析 2.1 SlMYB102 的克隆及同源性分析 從野生型番茄葉片 cDNA 中利用引物SlMYB102-F 和 SlMYB102-R1克隆 SlMYB102 的編碼區(qū)， 擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為 1 089 bp 的片段 （圖 1） 。測(cè)序結(jié)果與目的序列完全一致。 對(duì) SlMYB102 的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示， SlMYB102 包含 3 個(gè)外顯子， 2 個(gè)內(nèi)含子（圖2） 。 圖 2 番茄 SlMYB102 的結(jié)構(gòu) Fig. 2 Gene structure of SlMYB102 通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)， SlMYB102 與 AtMYB102 的相似度為 57.14%，具有 2 個(gè)保守 MYB結(jié)構(gòu)域（圖 3） 。 將番茄 SlMYB102 蛋白序列與其在番茄、水稻、擬南芥、棉花、馬鈴薯、柑橘等 6 個(gè)物種的同源蛋白進(jìn)行序列分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。可見(jiàn) SlMYB102 與馬鈴薯 StMYB34 同源性最高（圖 4） 。 張 旭，陳麗琛，任仲海 . 番茄過(guò)表達(dá) SlMYB102 對(duì)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (8)： 1523 1534. 1527 圖 3 番茄 SlMYB102 及擬南芥 AtMYB102 的氨基酸序列比對(duì) Fig. 3 Amino acid sequence alignment of SlMYB102 and AtMYB102 圖 4 SlMYB102 及其同源蛋白進(jìn)化樹(shù)分析 Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of SlMYB102 in tomato and its homologies 2.2 SlMYB102 表達(dá)模式分析 將 GFP 和 SlMYB102-GFP 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮，在 MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 48 h，清水洗凈后制片。通過(guò) BX51 顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)， SlMYB102-GFP 融合蛋白特異定位于細(xì)胞核內(nèi)，而對(duì)照中 GFP 蛋白的熒光信號(hào)在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上都存在，說(shuō)明 SlMYB102 是一個(gè)核蛋白（圖 5） 。 Zhang Xu， Chen Lichen， Ren Zhonghai. Effects of overexpression of SlMYB102 on the tomato seed germination and growth. 1528 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (8)： 1523 1534. 圖 5 SlMYB102 轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位 Fig. 5 Subcellular localization of SlMYB102 transcription factor 采用 qRT-PCR 分析 SlMYB102 在 Micro-Tom根、莖、葉、花、果中的表達(dá)情況，其在被檢測(cè)的各組織中均有表達(dá)，在莖和花中的表達(dá)量較高（圖 6） 。 圖 6 SlMYB102 的組織表達(dá)特異性 Fig. 6 Tissue-specific expression profiles of SlMYB102 P < 0.05. 2.3 過(guò)表達(dá)純合株系的鑒定 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化獲得 10 株再生植株。提取其 DNA，利用引物 35S-F、SlMYB102-R2進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證，結(jié)果顯示，共有 6 株擴(kuò)增出長(zhǎng)度均為 894 bp 條帶，與目的條帶大小一致，即獲得 6 株 T1代轉(zhuǎn)基因植株（圖 7， A） 。 為了防止植物組織培養(yǎng)過(guò)程對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的影響以及可能發(fā)生轉(zhuǎn)基因不穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象，利用轉(zhuǎn)基因株系 OE-1（圖 7， B）和 OE-2（圖 7， C）的 T3代純合株系用驗(yàn)證引物（ 35S-F、 SlMYB102-R2）進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證，擴(kuò)增出的條帶長(zhǎng)度均為 894 bp，與目的條帶大小一致，并且后代不發(fā)生分離，表明成功獲得轉(zhuǎn)基因純和株系。 為了進(jìn)一步確定目的基因的表達(dá)水平，通過(guò) qRT-PCR 分析 SlMYB102 在轉(zhuǎn)基因純和株系 OE-1、OE-2 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量均顯著高于野生型，且在 OE-2 中最高（圖 8） 。 張 旭，陳麗琛，任仲海 . 番茄過(guò)表達(dá) SlMYB102 對(duì)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (8)： 1523 1534. 1529 圖 7 轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證 M： Marker（ DL2501） ； N：陰性對(duì)照； P：陽(yáng)性對(duì)照； OE-1、 OE-2：過(guò)表達(dá) SlMYB102 的不同轉(zhuǎn)基因株系； 1 8： OE-1 的 T3代轉(zhuǎn)基因植株； 9 16： OE-2 的 T3代轉(zhuǎn)基因植株。 Fig. 7 PCR confirmation of the OE lines M： Marker（ DL2501） ； N： Negative control； P： Positive control； OE-1， OE-2： The overexpression lines of SlMYB102； 1 8： The T3 transgenic plants of OE-1； 9 16： The T3 transgenic plants of OE-2. 2.4 過(guò)表達(dá) SlMYB102 提高了種子萌發(fā)率 分別將 OE-1、 OE-2 和野生型的種子播種在 MS 培養(yǎng)板上。播種后 40 h 轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系萌發(fā)情況見(jiàn)圖 9，圖 10。播種后 40、 45 和 50 h，過(guò)表達(dá)株系萌發(fā)率都高于野生型，且在播種后50 h 全部萌發(fā)；而 野生型 種子在播種后 60 h 才全部萌發(fā)，說(shuō)明過(guò)表達(dá) SlMYB102 提高了番茄種子萌發(fā)速率。 圖 8 轉(zhuǎn)基因植株（ OE-1 和 OE-2）表達(dá)量檢測(cè) Fig. 8 qRT-PCR confirmation of the OE lines P < 0.05. 圖 9 SlMYB102 過(guò)表達(dá)株系與野生型種子萌發(fā)率比較 Fig. 9 Seed germination rate of the wild type and SlMYB102 overexpression lines P < 0.05. Zhang Xu， Chen Lichen， Ren Zhonghai. Effects of overexpression of SlMYB102 on the tomato seed germination and growth. 1530 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (8)： 1523 1534. 圖 10 轉(zhuǎn)基因株系與野生型種子播種 40 h 萌發(fā)情況 Fig. 10 Seed germination of the wild type and SlMYB102 overexpression lines 2.5 過(guò)表達(dá) SlMYB102 對(duì)植株生長(zhǎng)的影響 在正常條件下觀察了過(guò)表達(dá) SlMYB102 在 6 周齡時(shí)對(duì)植株生長(zhǎng)的影響。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系的株高顯著降低， OE-1、 OE-2 的株高分別下降了 16.45%、 21.01%；同時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系的葉面積也顯著低于野生型，分別下降了 38.35%、 44.21%（圖 11） 。 圖 11 SlMYB102 過(guò)表達(dá)株系與野生型株高及葉面積比較 Fig. 11 Height and leaf area of the SlMYB102 OE lines and wild type P < 0.05. 與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系 OE-1、 OE-2 地上部及地下部的鮮質(zhì)量也顯著降低，地上部鮮質(zhì)量分別下降了 19.59%、 23.65%，地下部鮮質(zhì)量分別下降了 26.78%、 32.72%（圖 12） 。 張 旭，陳麗琛，任仲海 . 番茄過(guò)表達(dá) SlMYB102 對(duì)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (8)： 1523 1534. 1531 圖 12 SlMYB102 過(guò)表達(dá)株系（ OE-1 和 OE-2）與野生型地上部及地下部鮮質(zhì)量比較 Fig. 12 Shoot and root fresh weight of the SlMYB102 OE lines and wild type P < 0.05. 2.6 葉片亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析 與野生型相比， OE-1、 OE-2 的葉片細(xì)胞面積基本沒(méi)有變化（圖 13） 。所以推測(cè)在番茄中過(guò)表達(dá)SlMYB102 是通過(guò)減少細(xì)胞分裂來(lái)負(fù)調(diào)控植株的生長(zhǎng)。 圖 13 SlMYB102 過(guò)表達(dá)株系與野生型葉片細(xì)胞大小顯微分析 Fig. 13 Leaf cell size analysis of SlMYB102 OE lines and wild type P < 0.05. 3 討論 植物基因的組織表達(dá)特性與其功能往往是相聯(lián)系的。 例如， 擬南芥中 AtMYB117/AtLOF1 在節(jié)點(diǎn)、花梗中特異表達(dá)， 可以調(diào)控橫向器官的分離及腋生分生組織形成 （ Lee et al.， 2009） ； 大豆中 Cry1Ac/Ab在根、莖、葉、籽粒中均有表達(dá)，且在葉片中的表達(dá)量最高，與過(guò)表達(dá) Cry1Ac/Ab 增加大豆對(duì)食葉Zhang Xu， Chen Lichen， Ren Zhonghai. Effects of overexpression of SlMYB102 on the tomato seed germination and growth. 1532 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (8)： 1523 1534. 性害蟲(chóng)的表型相一致（錢(qián)雪艷 等， 2016） 。本研究中發(fā)現(xiàn)番茄 SlMYB102 在各組織中均有表達(dá)，且在莖中表達(dá)量相對(duì)較高，與過(guò)表達(dá) SlMYB102 抑制植株生長(zhǎng)的表型一致。 前人對(duì) R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物生長(zhǎng)的研究主要集中在擬南芥、水稻等模式植物，對(duì)番茄植株生長(zhǎng)的報(bào)道較少。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)， SlMYB102 與 AtMYB102、 AtMYB41 具有較高的同源性，說(shuō)明 SlMYB102 可能具有與擬南芥 AtMYB102、 AtMYB41 類(lèi)似的功能。擬南芥中過(guò)表達(dá)AtMYB102 可以響應(yīng)受傷及氧化脅迫，并且提高植株對(duì)蟲(chóng)害的抗性（ Denekamp & Smeekens， 2003；de Vos et al.， 2014） ；擬南芥中過(guò)表達(dá) AtMYB41 可以使細(xì)胞面積變小導(dǎo)致植株矮小、葉面積變小等表型（ Cominelli et al.， 2008） 。本研究中發(fā)現(xiàn)在番茄中過(guò)表達(dá) SlMYB102 可以使植株變矮、葉面積變小，但葉片細(xì)胞面積無(wú)顯著變化，因此推測(cè)過(guò)表達(dá) SlMYB102 導(dǎo)致的葉面積和植株變小與其調(diào)控細(xì)胞分裂有密切關(guān)系。所以， SlMYB102 負(fù)調(diào)控番茄生長(zhǎng)與 AtMYB41 負(fù)調(diào)控?cái)M南芥生長(zhǎng)可能是通過(guò)不同的作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。 早期研究表明有些基因?qū)е碌闹仓臧“殡S著對(duì)干旱和鹽脅迫抗性的提高。如在水稻中突變OsDSS1 以及在短柄草中沉默 BdBRI1 都會(huì)出現(xiàn)植株矮小， 同時(shí)顯著提高了植株的抗旱性 （ Feng et al.，2015； Tamiruet al.， 2015） 。而在擬南芥中過(guò)表達(dá) AtMYB41 以及在番茄中過(guò)表達(dá) SlIPT3、 SlDREB2也觀察到植株矮小和抗鹽性提高的表型（ Cominelli et al.， 2008； Hoang et al.， 2012； Hichriet al.，2015； ikováet al.， 2015） 。本研究中發(fā)現(xiàn)番茄中過(guò)表達(dá) SlMYB102 可以使植株矮小、葉面積減小，但 SlMYB102 具體是否參與對(duì)抗性的調(diào)控仍需進(jìn)一步研究。未來(lái)將進(jìn)行抗性試驗(yàn)，進(jìn)一步研究SlMYB102 的生物學(xué)功能，為探究 R2R3-MYB 調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗性提供理論基礎(chǔ)。 References Adato A， Mandel T， OronS M， Venger I， Levy D， Yativ M， Dom´nguez E， Wang Z H， Vos R C H D， Jetter R， Schreiber L， Heredia A，Rogachev I， Aharoni A. 2009. 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