解淀粉芽胞桿菌K103對(duì)黃瓜穴盤苗的促生作用.pdf
<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2199 2208. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0114； http： /www. ahs. ac. cn 2199 收稿日期 ： 2018 07 09； 修回日期 ： 2018 11 09 基金項(xiàng)目 ： 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃支持項(xiàng)目（ 2016YED0201003） ；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（ 201303014） ；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（ CARS-23） ；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（ CAAS-ASTIP-IVFCAAS） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： shangqingmaocaas.cn） 解淀粉芽胞桿菌 K103對(duì)黃瓜穴盤苗的促生作用 董春娟1，王玲玲1，李 亮1，秦宇軒2，李平蘭2，尚慶茂1,*（1農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083） 摘 要： 為了探明解淀粉芽胞桿菌（ Bacillus amyloliquefaciens） K103 對(duì)黃瓜穴盤苗的促生效果及作用機(jī)理，以草炭、蛭石、珍珠巖混合物料為基質(zhì)，播種前基質(zhì)接種 K103，測(cè)定黃瓜穴盤苗生長(zhǎng)發(fā)育參數(shù)，并采用 454 焦磷酸測(cè)序技術(shù)分析穴盤苗根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。結(jié)果表明：解淀粉芽胞桿菌 K103 具有較高的固氮和溶解有機(jī)磷活性；基質(zhì)接種 K103 提高了黃瓜穴盤苗根系活力和礦質(zhì)養(yǎng)分吸收積累量，促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)； K103 可在黃瓜穴盤苗根際定殖，并顯著提高了根際食菌蛭弧菌，鞘氨醇單胞菌 CHNTR37、CL01，德氏嗜酸菌，鷹嘴豆中慢生根瘤菌等 9 種細(xì)菌的相對(duì)豐度，這些細(xì)菌對(duì)植物多具有促生潛力。 關(guān)鍵詞： 黃瓜；解淀粉芽胞桿菌 K103；穴盤苗；促生；根際 中圖分類號(hào)： S 642.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 11-2199-10 Growth-Promoting Effects of Bacillus amyloliquefaciens K103 on Cucumber Plug Seedlings DONG Chunjuan1， WANG Lingling1， LI Liang1， QIN Yuxuan2， LI Pinglan2， and SHANG Qingmao1,*（1Key Laboratory of Biological and Genetic Improvement of Horticultural Crops， Ministry of Agriculture； Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China；2College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China） Abstract： To investigate the growth-promoting effects and mechanisms of Bacillus amyloliquefaciens K103 on cucumber plug seedlings， K103 was inoculated into the substrate before sowing， and the growth parameters， mineral elements aborptions were measured. The rhizosphere bacterial diversities were also detected by 454 pyro sequencing. The results showed that K103 showed high nitrogen fixation and phosphorus solubilization capacity. K103 inoculation in substrate could promote the growth and development of cucumber plug seedlings by increasing the mineral absorption and root vigor. The 454 sequencing data suggested that K103 could colonize in the rhizosphere， and increase the relative abundances of nine bacteria species， including Bdellovibrio bacteriovorus， Sphingomonas sp. CHNTR37 and CL01， Acidovorax delafieldii， Mesorhizobium ciceri， etc. Most of these species were plant growth- promoting bacteria. Keywords： cucumber； Bacillus amyloliquefaciens K103； plug seedling； growth-promoting；rhizosphere Dong Chunjuan， Wang Lingling， Li Liang， Qin Yuxuan， Li Pinglan， Shang Qingmao. Growth-promoting effects of Bacillus amyloliquefaciens K103 on cucumber plug seedlings. 2200 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2199 2208. 植物根際促生菌（ Plant growth-promoting rhizobacteria）是定殖于植物根際土壤中的一類可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)，控制植物病害等的有益細(xì)菌的統(tǒng)稱（ Timmusk et al.， 2017） 。植物根際促生菌在植物根際通過(guò)分泌生長(zhǎng)素等植物促生長(zhǎng)類物質(zhì)，或通過(guò)固氮、溶磷、解鉀等改變土壤中某些元素的形態(tài)，使之被植物有效吸收，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，或抑制根際有害病原物的生長(zhǎng)和繁殖，誘導(dǎo)植物自身的系統(tǒng)性防衛(wèi)機(jī)制，降低病害對(duì)植物的危害（ Vejan et al.， 2016） 。植物根際促生菌因環(huán)境友好、功能多樣等諸多優(yōu)點(diǎn)受到廣泛的研究和關(guān)注。目前已報(bào)道的植物根際促生菌菌株種類很多，其中研究比較多的有芽胞桿菌屬（ Bacillus） 、假單胞菌屬（ Pseudomonas） 、類芽胞桿菌屬（ Paenibacillus）等。 芽胞桿菌屬細(xì)菌遺傳類型多樣，對(duì)多種植物病原真菌、細(xì)菌和線蟲(chóng)具有拮抗活性，其營(yíng)養(yǎng)要求相對(duì)簡(jiǎn)單，耐逆性強(qiáng)，易存活、定殖，以其為主劑開(kāi)發(fā)的生防制劑加工制作簡(jiǎn)單、使用方便、耐貯存，是理想的植物促生菌（ Santoyo et al.， 2012；劉慧芹 等， 2014；衛(wèi)甜 等， 2016） 。解淀粉芽胞桿菌（ B. amyloliquefaciens） K103 是一株從檸檬中分離得到的植物生防菌（張寶， 2014；張寶 等，2015） 。平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明 K103 具有廣譜抗菌性，對(duì)瓜果腐霉、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌的抑制率均達(dá)到 50%以上（孔維嘉， 2012） 。 K103 可以產(chǎn)生抗菌脂肽 bacillomycin L，破壞立枯絲核菌的細(xì)胞膜、線粒體、脂質(zhì)體等細(xì)胞器，從而抑制其生長(zhǎng)（ Zhang et al.， 2013a， 2013b） 。 K103 是否具有促生效果，其促生機(jī)理是什么，尚需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)中明確了 K013 的固氮和溶磷活性，并以黃瓜為材料，采用 454 焦磷酸測(cè)序法分析了基質(zhì)接種 K103 后黃瓜穴盤苗根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，測(cè)定了穴盤苗生長(zhǎng)發(fā)育參數(shù)和養(yǎng)分積累情況，旨在為 K103 在黃瓜穴盤育苗中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)菌株與材料 試驗(yàn)菌種解淀粉芽胞桿菌（ B. amyloliquefaciens） K103 和圓褐固氮菌（ Azotobacter chrooccum）ACCC11103，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。 ACCC11103 為固氮微生物肥料生產(chǎn)常用菌種，在本研究中用作固氮陽(yáng)性對(duì)照。 供試黃瓜（ Cucumis sativus L.）選用中農(nóng) 8 號(hào)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育。 試驗(yàn)所需的草炭購(gòu)自北京大漢園景有限公司（ Klasmann，德國(guó)） ， pH 5.5 6.5， EC 值（ 20 ± 5）mS · cm-1， N-P-K 比例為 14-16-18；蛭石和珍珠巖購(gòu)自河北靈壽縣騰達(dá)礦產(chǎn)品加工廠，粒徑分別為 1 3 mm 和 2 6 mm。黃瓜育苗用水溶速效復(fù)合肥為“花多多 20-10-20+TE”，購(gòu)自北京大漢園景公司。 1.2 解淀粉芽胞桿菌 K103 固氮和溶磷活性測(cè)定 1.2.1 固氮能力和固氮酶活性測(cè)定 將斜面保藏的 K103 菌種活化后， 按 1： 100 的接種量接種于改良 ACCC55 培養(yǎng)基 （蔗糖 10 g L-1，K2HPO4 · 3H2O 0.5 g L-1， NaCl 0.2 g L-1， CaCO31 g L-1， MgSO4 · 7H2O 0.2 g L-1， 酵母膏 0.5 g L-1；pH 7.0）中， 30 培養(yǎng) 10 d 后采用凱氏定氮法測(cè)定發(fā)酵液中氮的含量。以不接種菌的空白培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，以接種圓褐固氮菌 ACCC11103 的培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照。 采用乙炔還原法測(cè)定細(xì)菌的固氮酶活性（孫建光 等， 2009） 。將 K103 接種至改良 ACCC55 斜面培養(yǎng)基上， 28 培養(yǎng) 72 h 后換橡膠塞，注入乙炔氣體使終濃度為 10%，繼續(xù)培養(yǎng) 72 h，取 100 L董春娟，王玲玲，李 亮，秦宇軒，李平蘭，尚慶茂 . 解淀粉芽胞桿菌 K103 對(duì)黃瓜穴盤苗的促生作用 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2199 2208. 2201 反應(yīng)氣體用氣相色譜儀測(cè)定乙烯（ C2H4）體積（ L） 。計(jì)算 C2H4生成量（ nmol） = C2H4（ L） × 273 × 氣壓（ mm 汞柱） /22.4 ×（ 273 + 反應(yīng)溫度） × 760。 用 5 mL 生理鹽水沖洗并收集斜面菌體，加入 3 mL 的 0.5 mol L-1NaOH 溶液煮沸 5 min，冷卻至室溫后，加入 3 mL 0.5 mol L-1HCl 溶液，離心取上清液 1 mL，采用考馬斯亮藍(lán)法（ BioRad，美國(guó)）測(cè)定菌體蛋白量（ Bradford， 1976） 。菌株固氮酶活性 = C2H4生成量（ nmol） /反應(yīng)時(shí)間 h × 菌體蛋白量 mg。 1.2.2 溶磷活性測(cè)定 用滅菌牙簽將 K103 菌株分別點(diǎn)接在 Ca3(PO4)2培養(yǎng)基和卵磷脂培養(yǎng)基上， 30 培養(yǎng) 3 d 后，測(cè)量溶磷圈直徑（ D）和菌落直徑（ d） ，計(jì)算二者比值 D/d。 Ca3(PO4)2培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖 10 g L-1，Ca3(PO4)25 g L-1， MgCl25 g L-1， MgSO40.25 g L-1， KCl 0.2 g L-1， (NH4)2SO40.1 g L-1； pH 7.0。卵磷脂 （ EYPC） 培養(yǎng)基配方為： 葡萄糖 10 g L-1， 蛋黃卵磷脂 EYPC 1 g L-1， MgCl25 g L-1、 MgSO40.25 g L-1、 KCl 0.2 g L-1、 (NH4)2SO40.1 g L-1； pH 7.0。 參照胡曉峰等（ 2010）的方法，將 K103 菌株按 1%的接種量分別接入 Ca3(PO4)2和 EYPC 液體培養(yǎng)基中， 30 、 170 r min-1搖床培養(yǎng) 7 d。發(fā)酵液經(jīng) 10 000 × g 離心 10 min，采用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中的含磷量。 1.3 基質(zhì)接種解淀粉芽胞桿菌 K103 的方法及其 pH 和 EC 值測(cè)定 挑取 K103 單菌落接種至 5 mL LB 液體培養(yǎng)基 （酵母提取物 5g · L-1、 胰化蛋白胨 10 g · L-1、 NaCl 10 g · L-1， pH 7.0）中， 37 、 140 r min-1搖床培養(yǎng)至菌液濃度為 109CFU · mL-1，以 1%的接種量接種于 300 mL 的 LB 液體培養(yǎng)基中， 37 、 140 r min-1繼續(xù)培養(yǎng)至菌液濃度約為 1010CFU · mL-1。將所得菌液于室溫下 1 000 × g 離心 20 min，用無(wú)菌 PBS 溶液（ KH2PO40.27 g · L-1、 Na2HPO41.42 g · L-1、 NaCl 8 g · L-1、 KCl 0.2 g · L-1， pH 7.4）清洗 3 遍后，采用 PBS 溶液稀釋至菌液濃度為 1.0 × 109CFU · mL-1。每升基質(zhì)中接種 40 mL 上述 K103 菌懸液，使基質(zhì)中 K103 的終濃度為 4.0 × 1010CFU · L-1，以只添加 40 mL PBS 溶液的基質(zhì)作為對(duì)照。 稱取 10 g 基質(zhì)，放入 200 mL 燒杯內(nèi)，加入 100 mL 去離子水，靜置 30 min，取上清液，分別采用 PHSJ-3F 型 pH 計(jì)（雷磁，上海）和 DDSJ-308A 型電導(dǎo)儀（雷磁，上海）測(cè)定上清液的 pH 值和 EC 值。 1.4 黃瓜穴盤苗的培養(yǎng)及其生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 2016 年 4 6 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所連棟溫室中進(jìn)行育苗。挑選籽粒飽滿的黃瓜種子，清水浸種 6 h 后， 5% NaClO 表面消毒 10 min，無(wú)菌水沖洗 5 遍后， 28 恒溫培養(yǎng)箱中催芽。選擇發(fā)芽一致的種子播種于裝有接種 K103 的育苗基質(zhì)（草炭、蛭石、珍珠巖體積比為 3:1:1）中，以不接種 K103 的基質(zhì)作為對(duì)照。育苗穴盤為 72 孔，每穴孔一粒種子。處理與對(duì)照均設(shè) 3 次重復(fù)，每重復(fù) 4 個(gè)穴盤。播種后覆蓋 1.0 cm 厚的蛭石，并充分澆水，直至穴盤底部排水孔有水滴出現(xiàn)。育苗溫室晝夜平均溫度為（ 25 ± 3） /（ 15 ± 3），自然光照強(qiáng)度（約 350 mol · m-2· s-1）和光周期，平均空氣相對(duì)濕度 75% 95%。待幼苗子葉平展后，每 2 d 使用 1 次“花多多 20-10-20+TE”水溶肥溶液進(jìn)行追肥，施肥氮（ N）濃度為 50 mg · L-1，每穴盤施用量為 1 L，施肥與灌水交替進(jìn)行。播種后 28 d 進(jìn)行各指標(biāo)測(cè)定。 每處理每重復(fù)隨機(jī)選取 10 株幼苗，測(cè)定株高、莖粗、葉面積、根系體積、地上部干質(zhì)量、鮮質(zhì)量以及根干質(zhì)量、鮮質(zhì)量等生長(zhǎng)指標(biāo)，計(jì)算根冠比和壯苗指數(shù)（褚群 等， 2016） ；測(cè)定幼苗葉綠Dong Chunjuan， Wang Lingling， Li Liang， Qin Yuxuan， Li Pinglan， Shang Qingmao. Growth-promoting effects of Bacillus amyloliquefaciens K103 on cucumber plug seedlings. 2202 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2199 2208. 素含量（梁歡， 2014） ；洗凈幼苗根系，采用 TTC 還原法（李欣 等， 2011）測(cè)定根系活力。 每處理每重復(fù)隨機(jī)選取 30 株幼苗， 80 烘干，用凱氏定氮法測(cè)定幼苗中 N 的含量，用原子吸收分光光度法測(cè)定 P、 K、 Ca、 Mg、 Fe、 Mn、 Cu、 Zn 的含量（臺(tái)連麗 等， 2016） ，計(jì)算幼苗礦質(zhì)元素的吸收積累量。 每處理每重復(fù)隨機(jī)選取 15 株幼苗，用于根際基質(zhì)細(xì)菌多樣性分析。根際基質(zhì)樣品收集、細(xì)菌基因組 DNA 提取、 16S rRNA 的 PCR 擴(kuò)增以及 454 焦磷酸測(cè)序分析方法參照董春娟等（ 2017）的報(bào)道。 試驗(yàn)結(jié)果用 3 次重復(fù)的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（ mean ± SD）表示，采用 Students t-檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。 2 結(jié)果與分析 2.1 解淀粉芽胞桿菌 K103 的固氮和溶磷活性 解淀粉芽孢桿菌 K103具有較高的固氮能力， 固氮量和固氮酶活性分別達(dá) 0.55 mg L-1和 129.77 nmol mg-1 h-1，與對(duì)照?qǐng)A褐固氮菌 ACCC11103 相當(dāng)（圖 1） 。 圖 1 解淀粉芽胞桿菌 K103 的固氮活性 Fig. 1 Nitrogen fixation capacity of B. amyloliquefaciens K103 K103 對(duì)有機(jī)磷的溶磷作用顯著，對(duì)卵磷脂 EYPC 的溶磷圈直徑達(dá) 2.70 cm，溶磷量為 82.58 mg L-1，但對(duì)無(wú)機(jī)磷 Ca3(PO4)2沒(méi)有溶磷活性（表 1） 。 表 1 解淀粉芽胞桿菌 K103 溶磷活性 Table 1 Phosphate-solubilization capacity of B. amyloliquefaciens K103 培養(yǎng)基 Culture medium 溶磷圈直徑 D/cm Diameter of phosphate- solubilization ring 菌落直徑 d/cm Diameter of bacteria clone D/d 溶磷量 /（ mg L-1） P-solubilization capacity Ca3(PO4)2培養(yǎng)基 Tricalcium phosphate culture medium 0.13 ± 0.01 卵磷脂培養(yǎng)基 Lecithin culture medium 2.70 ± 0.36 1.05 ± 0.14 2.59 ± 0.38 82.58 ± 0.05 2.2 解淀粉芽胞桿菌 K103 對(duì)黃瓜育苗基質(zhì) pH 和 EC 值的影響 由圖 2 可知，接種 K103 對(duì)黃瓜育苗前后基質(zhì)的 pH 值沒(méi)有顯著影響，均保持在 pH 6.5 左右。接種 K103 對(duì)播種前（ 0 d）基質(zhì) EC 值沒(méi)有顯著影響；播種后 28 d，由于施肥導(dǎo)致基質(zhì)養(yǎng)分積累，董春娟，王玲玲，李 亮，秦宇軒，李平蘭，尚慶茂 . 解淀粉芽胞桿菌 K103 對(duì)黃瓜穴盤苗的促生作用 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2199 2208. 2203 基質(zhì) EC 值升高，接種 K103 的基質(zhì)升高幅度更大，為對(duì)照的 1.26 倍。 圖 2 解淀粉芽胞桿菌 K103 對(duì)黃瓜穴盤苗基質(zhì) pH 和 EC 值的影響 Fig. 2 Effects of B. amyloliquefaciens K103 inoculation on the pH and EC values in substrates of cucumber plug seedlings *P < 0.01. 2.3 基質(zhì)接種 K103 對(duì)黃瓜穴盤苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響 如表 2 所示，基質(zhì)中接種 K103 可以顯著促進(jìn)黃瓜穴盤苗地上部的生長(zhǎng)，其株高、莖粗、葉面積和地上部干質(zhì)量、鮮質(zhì)量顯著升高，穴盤苗壯苗指數(shù)顯著增大，但根系的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。 由圖 3 可知，基質(zhì)中接種 K103 后，黃瓜幼苗葉片中的葉綠素含量顯著提高，較對(duì)照提高了25.85%；接種 K103 還可以顯著提高幼苗根系活力，是對(duì)照幼苗根系活力的 1.70 倍。 表 2 基質(zhì)接種解淀粉芽胞桿菌 K103 對(duì)黃瓜穴盤苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響 Table 2 Effects of B. amyloliquefaciens K103 inoculation on growth and development of cucumber plug seedlings 處理 Treatment 株高 /cm Shoot height 莖粗 /mm Stem diameter 葉面積 /cm2Leaf area 地上部鮮質(zhì)量 /g Shoot fresh weight地上部干質(zhì) 量 /mg Shoot dry weight 根體積 /mLRoot Vo l u m e 根鮮質(zhì)量 /g Root fresh weight 根干質(zhì)量 /mg Root dry weight 壯苗指數(shù) Seedling index 對(duì)照 Control 11.86 ± 0.70 3.33 ± 0.07 48.66 ± 2.29 2.74 ± 0.09 267.22 ± 15.12 1.14 ± 0.16 1.14 ± 0.14 45.56 ± 5.36 86.82 ± 4.28K103 16.17 ± 0.69*3.90 ± 0.15 *62.73 ± 1.39*4.05 ± 0.07 *336.67 ± 36.09*1.18 ± 0.09 1.19 ± 0.06 49.33 ± 6.01 93.32 ± 3.09 * P < 0.05， * P < 0.01. 圖 3 基質(zhì)接種解淀粉芽胞桿菌 K103 對(duì)黃瓜穴盤苗葉綠素含量和根系活力的影響 Fig. 3 Effects of B. amyloliquefaciens K103 inoculation on chlorophyll contents and root vigor of cucumber plug seedlings * P < 0.05， * P < 0.01. 2.4 解淀粉芽胞桿菌 K103 對(duì)黃瓜穴盤苗礦質(zhì)養(yǎng)分積累的影響 由表 3 可知，基質(zhì)中接種 K103 促進(jìn)了黃瓜穴盤苗對(duì)礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收積累，單株大量元素（ N、Dong Chunjuan， Wang Lingling， Li Liang， Qin Yuxuan， Li Pinglan， Shang Qingmao. Growth-promoting effects of Bacillus amyloliquefaciens K103 on cucumber plug seedlings. 2204 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2199 2208. P、 K）的吸收量較對(duì)照提高了 25% 30%，中量元素（ Ca、 Mg）和微量元素（ Fe、 Mn、 Cu、 Zn）提高幅度更大，達(dá) 40% 66%。 表 3 解淀粉芽胞桿菌 K103 對(duì)黃瓜穴盤苗單株礦質(zhì)養(yǎng)分積累的影響 Table 3 Effects of B. amyloliquefaciens K103 inoculation on the contents of mineral nutrients in cucumber plug seedlings 處理Treatment N/mg P/mg K/mg Ca/mg Mg/mg Fe/g Mn/g Cu/g Zn/g 對(duì)照 Control 5.21 ± 0.22 1.60 ± 0.081 6.19 ± 0.046 4.21 ± 0.17 1.50 ± 0.06 60.01 ± 7.25 6.03 ± 0.26 1.45 ± 0.04 14.36 ± 1.13K103 6.55 ± 0.15*2.07 ± 0.03*7.84 ± 0.24*6.84 ± 0.62*2.11 ± 0.10*81.28 ± 8.31*10.01 ± 0.52*2.38 ± 0.39*19.71 ± 1.83* P < 0.05， * P < 0.01. 2.5 解淀粉芽胞桿菌 K103 對(duì)黃瓜穴盤苗根際基質(zhì)細(xì)菌多樣性的影響 采用 454 焦磷酸測(cè)序法分析接種 K103 對(duì)黃瓜穴盤苗基質(zhì)細(xì)菌多樣性的影響，每個(gè)樣品各獲得16 000 17 000 條有效序列，按照質(zhì)量控制原則對(duì)有效序列進(jìn)行篩選，每個(gè)樣品的優(yōu)化序列約為12 000 條，將上述序列與 Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，在 97%相似度水平，各樣品中 OTU 數(shù)量約為 2 200 條。 將各樣品測(cè)序獲得的優(yōu)質(zhì)序列用于評(píng)價(jià)基質(zhì)細(xì)菌多樣性（表 4） ，接種 K103 的基質(zhì)中，反映物種豐富度的 Ace 指數(shù)降低（ P < 0.05） ， Chao 指數(shù)未發(fā)生顯著變化；反映細(xì)菌群落多樣性的 Shannon和 Simpson 指數(shù)均未發(fā)生顯著變化。表明 K103 可以使黃瓜穴盤苗基質(zhì)中細(xì)菌群落豐富度降低，而對(duì)群落多樣性沒(méi)有顯著影響。 表 4 解淀粉芽胞桿菌 K103 對(duì)黃瓜穴盤苗基質(zhì)樣品細(xì)菌多樣性的影響 Table 4 Effects of B. amyloliquefaciens K103 inoculation on the alpha-diversity of rhizosphere bacterial communities of cucumber plug seedlings 處理 Treatment 豐富度指數(shù) Richness index 多樣性指數(shù) Diversity index 覆蓋率 /% Coverage Ace Chao Shannon Simpson 對(duì)照 Control 5 787 ± 202 4 142 ± 325 6.38 ± 0.13 0.00705 ± 0.00120 89.80 K103 5 160 ± 109*3 970 ± 129 6.34 ± 0.17 0.00725 ± 0.00231 90.99 * P < 0.05. 比較接種 K103 后黃瓜穴盤苗根際細(xì)菌的群落變化，相對(duì)豐度升高的細(xì)菌屬有 11 個(gè)（表 5） ，其中倍數(shù)最大的是芽孢桿菌屬，是對(duì)照的 7.64 倍；其次是金黃桿菌屬 Chryseobacterium，其相對(duì)豐度是對(duì)照的 7.00 倍。此外， 7 個(gè)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度顯著降低，其中尤以 Pelomonas 和纖維弧菌屬Cellvibrio 的降低幅度最大，分別只有對(duì)照的 8.06%和 0.37%。 將得到的 OTU 進(jìn)一步鑒定到種， 相對(duì)豐度大于 0.1%的已知細(xì)菌共鑒定到 38 種， 接種 K103 后，相對(duì)豐度發(fā)生顯著變化（ P < 0.05）的細(xì)菌有 19 種（表 6）。解淀粉芽胞桿菌 K103 的相對(duì)豐度為0.40%，而在對(duì)照樣品中檢測(cè)不到該細(xì)菌，表明 K103 接種后，可以在黃瓜穴盤苗的根際定殖。此外，食菌蛭弧菌 Bdellovibrio bacteriovorus、鞘氨醇單胞菌 Sphingomonas sp. CHNTR37、德氏嗜酸菌Acidovorax delafieldii、含羞草伯克霍爾德菌 Burkholderia mimosarum、鷹嘴豆中慢生根瘤菌Mesorhizobium ciceri、鞘氨醇單胞菌 Sphingomonas sp. CL01、 Acidimicrobidae bacterium Ellin7143、Rhodanobacter fulvus、鞘氨醇桿菌 Sphingobacterium sp. P-7 等 9 種細(xì)菌的相對(duì)豐度也有顯著升高，其中食菌蛭弧菌的相對(duì)豐度變化最大，其相對(duì)豐度是對(duì)照的 5.08 倍。 接種 K103 后， Alkanibacter difficilis、 Rubrobacterineae bacterium BR7-21、 Fluviicola taffensis、副氧化微桿菌 Microbacterium paraoxydans、 Paenibacillus chondroitinus、 桔橙指孢囊菌 Dactylosporangium aurantiacum、路德維希腸桿菌 Enterobacter ludwigii 等的相對(duì)豐度較對(duì)照顯著降低。 董春娟，王玲玲，李 亮，秦宇軒，李平蘭，尚慶茂 . 解淀粉芽胞桿菌 K103 對(duì)黃瓜穴盤苗的促生作用 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2199 2208. 2205 表 5 接種解淀粉芽胞桿菌 K103 后黃瓜穴盤苗根際細(xì)菌發(fā)生顯著變化（ P < 0.05）的細(xì)菌屬 Table 5 The bacterial genera changed significantly（ P < 0.05） in the rhizospheric substrates of cucumber plug seedlings inoculated with B. amyloliquefaciens K103 屬 Genus 相對(duì)豐度 /% Relative abundance 變化倍數(shù) Fold 對(duì)照 Control K103 芽胞桿菌屬 Bacillus 0.11 0.84 7.64 金黃桿菌屬 Chryseobacterium 0.12 0. 7.00 伯克氏菌屬 Burkholderia 1.31 3.31 2.53 Rhodanobacter 0.62 1.56 2.52 嗜酸菌屬 Acidovorax 1.92 4.45 2.32 芽單胞菌屬 Gemmatimonas 0.45 1.02 2.27 假單胞菌屬 Pseudomonas 39 0.78 2.00 亞硝化螺菌屬 Nitrosospira 0. 0. 2.弗蘭克氏菌屬 Frankia 38 0.71 1.87 蛭弧菌屬 Bdellovibrio 0.94 1.66 1.77 鞘氨醇單胞菌屬 Sphingomonas 1.39 2.10 1.51 Dokdonella 4.25 2.81 0.66 類芽孢桿菌屬 Paenibacillus 0.71 0.39 0.55 豐佑菌屬 Opitutus 1.52 0.82 0.54 纖維菌屬 Cellulomonas 1.40 0.74 0.53 微桿菌屬 Microbacterium 0.82 0.15 0.18 Pelomonas 5.83 0.47 0.081 纖維弧菌屬 Cellvibrio 5.35 0.02 0.0037 表 6 接種解淀粉芽胞桿菌 K103 后黃瓜穴盤苗基質(zhì)中發(fā)生顯著變化（ P < 0.05）的細(xì)菌種類 Table 6 The bacterial species changed significantly（ P < 0.05） in the rhizospheric substrates of cucumber plug seedlings inoculated with B. amyloliquefaciens K103 種 Species 相對(duì)豐度 /% Relative abundance 變化倍數(shù) Fold 對(duì)照 Control K103 解淀粉芽胞桿菌 K103 Bacillus amyloliquefaciens K103 0 0.40 - 食菌蛭弧菌 Bdellovibrio bacteriovorus 0.12 0.61 5.08 鞘氨醇單胞菌 CHNTR37 Sphingomonas sp. CHNTR37 0.16 0.48 3.00 德氏嗜酸菌 Acidovorax delafieldii 0.23 0.67 2.91 含羞草伯克霍爾德菌 Burkholderia mimosarum 0.47 1.28 2.72 鷹嘴豆中慢生根瘤菌 Mesorhizobium ciceri 0.27 0.64 2.37 鞘氨醇單胞菌 CL01 Sphingomonas sp. CL01 0.09 0.21 2.33 Acidimicrobidae bacterium Ellin7143 0.10 0.22 2.20 Rhodanobacter fulvus 0.11 0.24 2.18 鞘氨醇桿菌 P-7 Sphingobacterium sp. P-7 0.17 0.29 1.71 Alkanibacter difficilis 0.29 0.13 0.45 Rubrobacterineae bacterium BR7-21 0.20 0.08 0.40 Chitinophaga arvensicola 0.25 0.07 0.28 Fluviicola taffensis 0.33 0.09 0.27 Mesorhizobium plurifarium 0.25 0.06 0.24 副氧化微桿菌 Microbacterium paraoxydans 0.61 0.07 0.11 Paenibacillus chondroitinus 0.33 0.03 0.09 桔橙指孢囊菌 Dactylosporangium aurantiacum 0.33 0.01 0.03 路德維希腸桿菌 Enterobacter ludwigii 0.22 0.00 3 討論 解淀粉芽胞桿菌是一類重要的植物促生菌，不僅對(duì)植物病害有較好的防治作用，其對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的促進(jìn)作用也有廣泛報(bào)道（ Santoyo et al.， 2012） 。有研究表明，在番茄育苗中施用解淀粉芽胞桿菌 B1619 可以促進(jìn)種子的萌發(fā)，促進(jìn)幼苗光合作用，提高葉片中葉綠素、類胡蘿卜素含量，提高幼苗根系活力（喬俊卿 等， 2013；楊曉云 等， 2016） 。解淀粉芽胞桿菌 FZB42 對(duì)玉米、小麥、番茄等也具有良好的促生效果，且因其無(wú)生物侵害性和殘留等特點(diǎn)，已被德國(guó) ABiTEP GmbH 公司成功開(kāi)發(fā)為商品化菌劑（李紅曉 等， 2016） 。本試驗(yàn)結(jié)果表明， K103 對(duì)黃瓜穴盤苗具有良好的促生效Dong Chunjuan， Wang Lingling， Li Liang， Qin Yuxuan， Li Pinglan， Shang Qingmao. Growth-promoting</p>
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