番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、潰瘍病菌、青枯病菌和瘡痂病菌的四重PCR檢測(cè)方法.pdf
<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2254 2264. Acta Horticulturae Sinica 2254 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0153； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2018 04 25； 修回日期 ： 2018 11 20 基金項(xiàng)目 ： 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（ 2017YFD0200603） ；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（ CAAS-ASTIP-IVFCAAS） ；農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： chaialicaas.cn； libaojucaas.cn） 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、潰瘍病菌、青枯病菌和瘡痂病菌的四重 PCR 檢測(cè)方法 康華軍1,2，柴阿麗1,*，石延霞1，謝學(xué)文1，袁軍海2，李寶聚1,*（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2河北北方學(xué)院，河北張家口 075061） 摘 要： 針對(duì)引起番茄細(xì)菌性病害的細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌（ Pseudomonas syringae pv. tomato， Pst）、潰瘍病菌（ Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Cmm）、青枯病菌（ Ralstonia solanacearum， Rs）以及瘡痂病菌（ Xanthomonas campestris pv. vesicatoria， Xcv），建立了四重 PCR 檢測(cè)技術(shù)，為病害的快速、準(zhǔn)確診斷提供技術(shù)支持。根據(jù) gap1 基因設(shè)計(jì) Pst 特異性引物 BW-F/BW-R，經(jīng) PCR 條件優(yōu)化，擴(kuò)增出了 375 bp 的特異性片段。將設(shè)計(jì)的引物與已報(bào)道的 3 種細(xì)菌特異性引物組合，通過設(shè)定不同的退火溫度、引物濃度、循環(huán)次數(shù)以及延伸時(shí)間，探索影響四重 PCR 擴(kuò)增的因素，優(yōu)化了其反應(yīng)體系。四重 PCR反應(yīng)體系中的引物對(duì) BW-F/BW-R、 Fan1/Fan2、 RS-1-F/RS-3-R 和 XCVF/XCVR 可分別擴(kuò)增出細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、潰瘍病菌、青枯病菌和瘡痂病菌長(zhǎng)度為 375、 146、 716 和 517 bp 的特異性目的片段，反應(yīng)體系退火溫度為 57.1 ， 4 對(duì)引物的終濃度分別為 0.24、 0.16、 0.16 和 0.08 mol · L-1，延伸時(shí)間 45 s， 35 個(gè)循環(huán)。該四重 PCR 反應(yīng)體系可快速檢測(cè)田間番茄發(fā)病植株中的細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、潰瘍病菌、青枯病菌和瘡痂病菌，靈敏度達(dá)到 10-1 ng · L-1。 關(guān)鍵詞： 番茄；細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌；潰瘍病菌；青枯病菌；瘡痂病菌；四重 PCR 中圖分類號(hào)： S 641.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 11-2254-11 Quadruple PCR Detection of Pseudomonas syringae pv. tomato， Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in Infected Tomato Tissues KANG Huajun1,2， CHAI Ali1,*， SHI Yanxia1， XIE Xuewen1， YUAN Junhai2， and LI Baoju1,*（1Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Science， Beijing 100081， China；2Hebei North University， Zhangjiakou， Hebei 075061， China） Abstract： In order to establish a rapid and specific detection method for tomato diseases， a quadruple PCR assay was designed for identifing the pathogens including Pseudomonas syringae pv. tomato（ Pst），Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis（ Cmm） ， Ralstonia solanacearum（ Rs） and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria（ Xcv） . The specific primers（ BW-F/BW-R） of Pst were designed based on the gap1 gene sequence， which can amplify 375 bp specific fragment by optimizing the PCR conditions. Besides， three pairs of specific primers of Cmm（ Fan1/Fan2）， Rs（ RS-1-F/RS-3-R）， and Xcv（ XCVF/ 康華軍，柴阿麗，石延霞，謝學(xué)文，袁軍海，李寶聚 . 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、潰瘍病菌、青枯病菌和瘡痂病菌的四重 PCR 檢測(cè)方法 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2254 2264. 2255 XCVR） used in this study were referenced previous studies. The primer concentration， the annealing temperature， amplification cycles， and the extension time were optimized to obtain the best ratio of primers and amplification conditions. Then， the rapid quadruple PCR detection of pathogens in tomato was established. The annealing temperature was 57.1 ， the extension time was 45 s and the number of cycles was 35. The final concentrations of BW-F/BW-R primers， Fan1/Fan2 primers， RS-1-F/RS-3-R primers and XCVF/XCVR primers were 0.24， 0.16， 0.16 and 0.08 mol · L-1， respectively. The expected sizes of amplification bands were 375， 146， 716 and 517 bp for BW-F/BW-R， Fan1/Fan2， RS-1-F/RS-3-R and XCVF/XCVR， respectively. The quadruple PCR can simultaneously detect Pst， Cmm， Rs and Xcv in infected plants tissue， with the detection limits of 0.1ng · L-1gDNA. This study indicated that quadruple PCR might be a useful tool for rapid and sensitive diagnosis and provided an effective technical support for pathogenic identification Keywords ： tomato ； Pseudomonas syringae pv. tomato ； Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis； Ralstonia solanacearum； Xanthomonas campestris pv. vesicatoria； quadruple PCR 番茄生產(chǎn)上重要的細(xì)菌性病害主要有由丁香假單胞菌番茄致病變種（ Pseudomonas syringae pv. tomato， Pst）引起的細(xì)菌性斑點(diǎn)??；由茄科雷爾氏菌（ Ralstonia solanacearum， Rs）引起的青枯??；由密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種（ Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Cmm）引起的潰瘍??；由黃單胞菌屬（ Xanthomonas ssp）多個(gè)種（ X. campestris pv. vesicatoria， Xcv； X. euvesicatoria，Xe； X. axonopodis pv. vesicatoria， Xav； Xanthomonas perforans， Xp； X. gardneri， Xg） 侵染引起 （ Jones et al.， 2004）的瘡痂病。這 4 種病害的病原菌都可以通過傷口侵入、雨水傳播，在田間或棚內(nèi)濕度大時(shí)極易擴(kuò)展蔓延。細(xì)菌性斑點(diǎn)病與瘡痂病在發(fā)病初期時(shí)癥狀較為相似，均可形成圓形或不規(guī)則形褐色小斑點(diǎn)，病斑周圍產(chǎn)生黃色暈圈；潰瘍病與青枯病均屬于系統(tǒng)性病害，可導(dǎo)致維管束變褐腐爛，植株萎蔫，發(fā)病初期難以區(qū)分。以上 4 種病原菌均可侵染番茄葉片、莖和果實(shí)，引起產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)的下降。因此，迫切需要一種能夠在番茄發(fā)病初期及時(shí)將病原菌檢測(cè)出來的技術(shù)，以及時(shí)控制病害的蔓延。 傳統(tǒng)的對(duì)植物細(xì)菌性病害的診斷方法主要有田間癥狀觀察、病菌分離培養(yǎng)、致病性測(cè)定等，但存在診斷周期長(zhǎng)、病原菌培養(yǎng)過程易污染、需要較豐富的植物病害診斷知識(shí)等問題；運(yùn)用生理生化試驗(yàn)以及免疫學(xué)等方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，也存在著穩(wěn)定性低、易出現(xiàn)假陽性結(jié)果、不能直接檢測(cè)植物材料中的病原菌等缺點(diǎn) （尹燕妮 等， 2006） 。 目前， 分子檢測(cè)方法如普通 PCR、 巢氏 PCR、 RT-PCR以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（ LAMP）技術(shù)已經(jīng)較為廣泛的應(yīng)用于番茄病原細(xì)菌快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。Zaccardelli 等（ 2005）根據(jù) hrpZpst基因設(shè)計(jì)細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌 Pst 的特異性引物并成功建立 PCR 檢測(cè)技術(shù)，可從自然發(fā)病番茄的葉片、種子和果實(shí)中將 Pst 準(zhǔn)確檢測(cè)出來；夏明星等（ 2006）針對(duì)潰瘍病菌 Cmm 建立了 RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)， 可以較快速地從發(fā)病植株以及種子中將 Cmm 檢測(cè)出來； Pizano等（ 2016）建立了利用巢氏 PCR 檢測(cè)植物組織和種子中 Cmm 的技術(shù)； Singh 等（ 2014）根據(jù) hrp基因設(shè)計(jì)青枯病菌 Rs 的特異性引物，建立了基于 Bio-PCR 的檢測(cè)技術(shù)，可將 Rs 從植物材料、灌溉水以及土壤中檢測(cè)出來；黃雯等（ 2016）基于 lpxC 基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了 LAMP 檢測(cè)技術(shù)，可檢測(cè)番茄發(fā)病組織中的 Rs； Park 等（ 2009）利用常規(guī) PCR 技術(shù)擴(kuò)增 rhs 基因家族特異性片段檢測(cè)瘡痂病菌 Xcv。 多重 PCR 是在普通 PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)，可一次性對(duì)多個(gè)病原菌（包括真菌、Kang Huajun， Chai Ali， Shi Yanxia， Xie Xuewen， Yuan Junhai， Li Baoju. Quadruple PCR detection of Pseudomonas syringae pv. tomato， Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in infected tomato tissues. 2256 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2255 2264. 細(xì)菌和病毒）進(jìn)行檢測(cè)。 Chen 等（ 2015）建立了小麥稈銹病菌、葉銹病菌以及白粉病菌的多重 PCR檢測(cè)技術(shù)；羅文彬等（ 2015）應(yīng)用多重 PCR 技術(shù)檢測(cè)侵染馬鈴薯的 5 種病毒。目前，已有部分學(xué)者針對(duì)番茄病原細(xì)菌建立了多重 PCR 檢測(cè)技術(shù)。 Ozdemir（ 2005）利用雙重 PCR 技術(shù)檢測(cè)潰瘍病菌Cmm 與瘡痂病菌 Xav； Umesha 和 Avinash（ 2015）開發(fā)了可用于檢測(cè)植物材料、種子以及土壤中的青枯病菌 Rs 和瘡痂病菌 Xp 的雙重 PCR 技術(shù)。在田間，細(xì)菌性病害發(fā)生條件比較相似，并且可能存在多種細(xì)菌同時(shí)侵染番茄的情況。而目前針對(duì)番茄病害的檢測(cè)多為一個(gè)或兩個(gè)的病原細(xì)菌，工作量大，成本高，難以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)病害的快速診斷。 本研究中擬以 4 種番茄細(xì)菌性病害病原菌為研究對(duì)象， 首先設(shè)計(jì) Pst 的特異性引物， 并與 Cmm、Rs 和 Xcv 的特異性檢測(cè)引物組合，篩選并優(yōu)化四重 PCR 反應(yīng)檢測(cè)體系，開發(fā)出同時(shí)檢測(cè)番茄 4 種病原細(xì)菌的多重 PCR 檢測(cè)方法，大大提高病原菌檢測(cè)效率，為病害的早期準(zhǔn)確診斷提供技術(shù)支撐。 1 材料與方法 1.1 供試菌株及其基因組 DNA 的提取 供試菌株的種名，來源及數(shù)量見表 1。 挑取番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、潰瘍病菌、青枯病菌以及瘡痂病菌單菌落于 NA 液體培養(yǎng)基中，28 、 180 r · min-1振蕩培養(yǎng) 18 h。分別參照細(xì)菌基因組試劑盒和植物基因組試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明書進(jìn)行基因組 DNA 的提取。提取出的 DNA 于 20 保存。 表 1 供試菌株 Table 1 Isolates used for selection of specific primers in this study 種名 Species 引物 Amplification with primers BW-F/BW-R RS-1-F/RS-3-R Fan 1/Fan 2 XCVF/XCVR丁香假單胞菌番茄致病變種 Pseudomonas syringae pv. tomato， Pst + - - - 密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Cmm - - + - 茄科雷爾氏菌 Ralstonia solanacearum， Rs - + 野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)致病變種 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria， Xcv - - - + 胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum， Pcc - - - - 菊苣假單胞 Pseudomonas cichorii， Pc丁香假單胞菌黃瓜致病變種 Pseudomonas syringae pv. lachrymans， Psl - - - - 胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種 Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense， Pcb - - - - 野油菜黃單胞菌油菜致病變種 Xanthomonas campestris pv. campestris， Xcc - - - - 西瓜嗜酸菌 Acidovorax citrulli， Ac - - - - 胡蘿卜軟腐果膠桿菌氣味亞種 Pectobacterium carotovorum subsp. odoriferum， Pco - - - - 桃色歐文氏菌 Erwinia persicina， Ep - - - - 托拉斯假單胞 Pseudomonas tolasii， Pt - - - - 注： “ +”表示單一條帶； “ -” ：表示無條帶。 Note： “ +” ： A single PCR band； “ -” ： No PCR band. 1.2 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌特異性引物設(shè)計(jì)及四重 PCR 引物組合 從 NCBI 網(wǎng)站下載 Pst 與表 1 中其他細(xì)菌的 gap1 基因序列，應(yīng)用軟件 MEGA 5.0 將所下載的序列進(jìn)行同源性比對(duì)， 根據(jù) Pst 序列與其他細(xì)菌的差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)出 Pst 特異性引物 BW-F/BW-R（表 2） ，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 375 bp。 查閱國(guó)內(nèi)外關(guān)于潰瘍病菌、青枯病菌以及瘡痂病菌分子檢測(cè)的文獻(xiàn)，選取可能進(jìn)行四重 PCR 反康華軍，柴阿麗，石延霞，謝學(xué)文，袁軍海，李寶聚 . 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、潰瘍病菌、青枯病菌和瘡痂病菌的四重 PCR 檢測(cè)方法 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2254 2264. 2257 應(yīng)的引物組合。 潰瘍病菌引物選自吳興海等 （ 2007） 根據(jù) 16s rRNA 基因設(shè)計(jì)的特異性引物 Fan1/Fan2，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 146 bp；青枯病菌采用 Pastrik 等（ 2002）根據(jù) 16s rRNA 基因設(shè)計(jì)的特異性引物RS-1-F/RS-3-R，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 716 bp；瘡痂病菌采用 Park 等（ 2009）根據(jù) Rhs family protein 基因設(shè)計(jì)的特異性引物 XCVF/XCVR，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 517 bp。 通過 NCBI 網(wǎng)站對(duì)這 4 對(duì)引物進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，確定這 4 對(duì)引物之間相似度比較低，符合組成四重 PCR 的條件，因此設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行組合驗(yàn)證。供試引物組合見表 2。 表 2 四重 PCR 所用引物 Table 2 The primers used for quadruple PCR in this study 物種 Species 引物（ 5 3） Primer 產(chǎn)物長(zhǎng)度 / bp Product length 退火溫度 / Annealing temperature 參考文獻(xiàn) Reference Pst BW-F： CGTTTCGACACTGTACAC BW-R： CGATACCCAGTTCACGGTG 375 60 Xcv XCVF： GAACTTCGCACCGCCGACCTTCTA XCVR： AATGACCTCGCCAGTTGAGT 517 58 Park et al.， 2009 Cmm Fan1:GCATGTGCACCTCTCCTCTGTA Fan2： CCCCACAAGGAGGCGTACTA 146 57 吳興海 等， 2007 Rs RS-1-F： ACTAACGAAGCAGAGATGCATTA RS-3-R： TTCACGGCAAGATCGCTC 716 57 Pastrik et al.， 2002 1.3 四重 PCR 反應(yīng)體系及優(yōu)化 1.3.1 退火溫度 退火溫度直接影響引物與模板的特異性結(jié)合。 根據(jù)對(duì) 4 對(duì)引物堿基數(shù)量分析， 選定在 55 64 之間設(shè)置 64、 63.4、 62.3、 60.7、 58.6、 57.1、 55.9 和 55 ，對(duì)不同引物組合的退火溫度進(jìn)行探索。 1.3.2 引物濃度 每對(duì)引物與各自模板結(jié)合的頻率受引物濃度的影響。在 25 L 反應(yīng)體系中，設(shè)定引物BW-F/BW-R 的濃度為 0.24 和 0.16 mol · L-1， RS-1-F/RS-3-R 的濃度為 0.24 和 0.16 mol · L-1，F(xiàn)an1/Fan2 的濃度為 0.24， 0.16 和 0.08 mol · L-1， XCVF/XCVR 的濃度為 0.16 和 0.08 mol · L-1。共設(shè)置 24 個(gè)組合（表 3） 。四 重 PCR 反應(yīng)體系 25 L： 2×Taq PCR Master Mix 12.5 L， BW-F/BW-R（ 10 mol · L-1） 0.6/0.4 L， RS-1-F/RS-3-R（ 10 mol · L-1） 0.6/0.4 L， Fan1/Fan2（ 10 mol · L-1） 0.6/0.4/0.2 L， XCVF/XCVR（ 10 mol · L-1） 0.4/0.3 L，細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、潰瘍病菌、青枯病菌及瘡痂病菌基因組 DNA（ 10 ng · L-1）各 1 L， ddH2O 補(bǔ)充至 25 L。反應(yīng)程序?yàn)椋?94 預(yù)變性 4 min； 94 變性 30 s， 57 退火 30 s， 72 延伸 45 s， 35 個(gè)循環(huán)；最后 72 延伸 10 min。 PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取 5 L PCR 產(chǎn)物 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。 1.3.3 延伸時(shí)間和循環(huán)次數(shù) 延伸時(shí)間分別設(shè)定為 30、 45、 60 和 90 s ；循環(huán)次數(shù)分別設(shè)定為 25、 30、 35 和 40 次。 1.4 四重 PCR 特異性檢測(cè) 將丁香假單胞菌番茄致病變種 Pst、密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種 Cmm、茄科雷爾氏菌 Rs 和野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)致病變種 Xcv 基因組 DNA 等量混合均勻。分別以胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（ P. carotovorum subsp. carotovorum， Pcc） 、菊苣假單胞（ P. cichorii， Pc） 、丁香假單胞菌流淚致病變種（ P. syringae pv. lachrymans， Psl） 、胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種（ P. carotovorum subsp. brasiliense， Pcb） 、野油菜黃單胞菌油菜致病變種（ X. campestris pv. campestris， Xcv） 、西瓜嗜酸菌Kang Huajun， Chai Ali， Shi Yanxia， Xie Xuewen， Yuan Junhai， Li Baoju. Quadruple PCR detection of Pseudomonas syringae pv. tomato， Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in infected tomato tissues. 2258 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2255 2264. （ A. citrulli， Ac） 、胡蘿卜軟腐果膠桿菌氣味亞種（ P. carotovorum subsp. odoriferum， Pco） 、桃色歐文氏菌（ E. persicina， Ep） 、托拉氏假單胞菌（ P. tolasii， Pt）以及丁香假單胞菌番茄致病變種、密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種、茄科雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)致病變種混合基因組 DNA 為模板， ddH2O 為陰性對(duì)照，利用優(yōu)化好的四重 PCR 反應(yīng)條件下進(jìn)行四重 PCR 反應(yīng)，檢驗(yàn)反應(yīng)體系的特異性。 1.5 四重 PCR 靈敏性檢測(cè) 分別設(shè)置 Pst、 Cmm、 Rs 和 Xcv 混合基因組 DNA 濃度為 10、 1、 10-1、 10-2和 10-3ng · L-1，在優(yōu)化后的四重 PCR 反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)該體系靈敏度。 1.6 四重 PCR 檢測(cè)番茄發(fā)病葉片 1.6.1 接種發(fā)病組織檢測(cè) 采集接種發(fā)病的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病、潰瘍病、青枯病及瘡痂病病害組織并提取基因組 DNA；將4 種發(fā)病組織基因組 DNA 等量混勻以及兩兩和三三混勻，分別作為四重 PCR 特異性檢測(cè)的模板，同時(shí)以 4 種細(xì)菌基因組 DNA 作為陽性對(duì)照，健康植物基因組 DNA 為陰性對(duì)照。以優(yōu)化好的四重PCR 反應(yīng)體系對(duì) Pst、 Cmm、 Rs 及 Xcv 進(jìn)行特異性檢測(cè)，驗(yàn)證該四重 PCR 反應(yīng)體系。 為了檢驗(yàn)所建立的四重 PCR 反應(yīng)體系的穩(wěn)定性以及可重復(fù)性， 另外使用了大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)的 TaKaRa Taq 酶進(jìn)行四重 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系： TaKaRa Taq（ 5 units · L-1） 0.125 L，10× PCR Buffer 2.5 L， dNTP Mixture（各 2.5 mmol · L-1） 2 L，引物體積（濃度）為優(yōu)化后的體積，細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、潰瘍病菌、青枯病菌及瘡痂病菌基因組 DNA（ 10 ng · L-1）各 1 L， ddH2O 補(bǔ)充至 25 L。反應(yīng)程序按照優(yōu)化后的反應(yīng)程序進(jìn)行。兩種反應(yīng)體系均分別使用 C1000 TouchTM型（賽默飛世爾科技有限公司）與 AerisTM型（新加坡藝思高科技有限公司）熱循環(huán)儀進(jìn)行擴(kuò)增。 1.6.2 田間發(fā)病植株檢測(cè) 對(duì) 2017 年從浙江蒼南（ 12 份） 、山東壽光（ 8 份）和新疆昌吉（ 21 份）等地采集的 41 份番茄細(xì)菌性病害樣本進(jìn)行發(fā)病組織 DNA 的提取，以優(yōu)化后的四重 PCR 反應(yīng)體系對(duì)病原菌進(jìn)行檢測(cè)。 2 結(jié)果與分析 2.1 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病病原菌引物特異性擴(kuò)增 根據(jù) gap1 基因設(shè)計(jì)的 Pst 特異性引物 BW-F/BW-R 可從供試的 3 個(gè)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌（ Pst）菌株 DNA 中擴(kuò)增出 375 bp 的產(chǎn)物，而其他細(xì)菌及陰性對(duì)照均無任何擴(kuò)增（圖 1） 。 圖 1 引物 BW-F/BW-R 特異性擴(kuò)增 Fig. 1 Specific amplified products obtained using primers BW-F/BW-R 康華軍，柴阿麗，石延霞，謝學(xué)文，袁軍海，李寶聚 . 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、潰瘍病菌、青枯病菌和瘡痂病菌的四重 PCR 檢測(cè)方法 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2254 2264. 2259 2.2 四重 PCR 反應(yīng)體系及條件 通過對(duì) 55 64 之間 8 個(gè)不同溫度的探索，發(fā)現(xiàn)當(dāng)退火溫度為 57.1 時(shí)，番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、潰瘍病菌、青枯病菌和瘡痂病菌 DNA 模板均能得到最大程度的擴(kuò)增（圖 2） 。 圖 2 四重 PCR 退火溫度優(yōu)化 Fig. 2 Optimization for the annealing temperature of quadruple PCR 通過對(duì)引物 BW-F/BW-R、 Fan 1/Fan 2、 RS-1-F/RS-3-R 和 XCVF/XCVR 濃度組合的優(yōu)化，最終當(dāng)4 對(duì)引物濃度分別為 0.24、 0.16、 0.16 和 0.08 mol · L-1時(shí)可以同時(shí)有效的擴(kuò)增 4 個(gè)目的片段（圖 3） 。 圖 3 四重 PCR 引物濃度（ mol · L-1）優(yōu)化 Fig. 3 Optimization for the concentration of primers used in quadruple PCR 將不同延伸時(shí)間及循環(huán)次數(shù)下的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶亮度確定最佳延伸時(shí)間為 45 s（圖 4） ，循環(huán)次數(shù)為 35 次（圖 5） 。 圖 4 四重 PCR 延伸時(shí)間 Fig. 4 The extending time of the quadruple PCR 圖 5 四重 PCR 循環(huán)次數(shù) Fig. 5 The cycling times of the quadruple PCR Kang Huajun， Chai Ali， Shi Yanxia， Xie Xuewen， Yuan Junhai， Li Baoju. Quadruple PCR detection of Pseudomonas syringae pv. tomato， Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in infected tomato tissues. 2260 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2255 2264. 四重 PCR 反應(yīng)體系： 2× Taq PCR Master Mix 12.5 L， BW-F/BW-R、 Fan1/Fan2、 RS-1-F/RS-3-R和 XCVF/XCVR 分別為 0.6、 0.4、 0.4 和 0.2 L， DNA 模板各 1 L，補(bǔ)加 ddH2O 至 25 L。反應(yīng)程序： 94 預(yù)變性 4 min； 94 變性 30 s， 57.1 退火 30 s， 72 延伸 45 s，共 35 個(gè)循環(huán)；最后72 延伸 10 min。 2.3 四重 PCR 的特異性 利用優(yōu)化好的四重 PCR 反應(yīng)體系對(duì)目的菌株和非目的菌株進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 檢測(cè)該體系特異性。結(jié)果（圖 6）顯示， Pst、 Cmm、 Rs 和 Xcv 分別擴(kuò)增出了 375、 146、 716 和 517 bp 的特異性目的條帶，而其他非目的菌株以及陰性對(duì)照均沒有擴(kuò)增。 圖 6 四重 PCR 特異性檢測(cè) Fig. 6 Specific detection of quadruple PCR for pathogens 2.4 四重 PCR 的靈敏性 由圖 7 可見，當(dāng) DNA 濃度為 10-2 ng · L-1時(shí)僅能檢測(cè)到 Xcv，而檢測(cè)不到其他病原菌，因此，四重 PCR 體系靈敏度為 10-1ng · L-1。 圖 7 四重 PCR 靈敏性檢測(cè) Fig. 7 The sensitivity of quadruple PCR detection 2.5 番茄發(fā)病葉片的四重 PCR 檢測(cè) 2.5.1 接種發(fā)病葉片檢測(cè) 提取采集的番茄 4 種細(xì)菌病害組織的基因組 DNA，以其等量混合作為陽性對(duì)照，以健康組織作為陰性對(duì)照，進(jìn)行四重 PCR 檢測(cè)。結(jié)果（圖 8）顯示，均可以擴(kuò)增出 4 種細(xì)菌的特異性目的片段，檢測(cè)結(jié)果與接種病原菌一致，而健康番茄組織中沒有擴(kuò)增。 康華軍，柴阿麗，石延霞，謝學(xué)文，袁軍海，李寶聚 . 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、潰瘍病菌、青枯病菌和瘡痂病菌的四重 PCR 檢測(cè)方法 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2254 2264. 2261 采用了寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司和天根生化科技有限公司生產(chǎn)的 Taq 酶， PCR 儀采用賽默飛世爾科技有限公司的 C1000 TouchTM熱循環(huán)儀和新加坡藝思高科技有限公司的 AerisTM擴(kuò)增儀。因此，本研究中建立的四重 PCR 反應(yīng)體系可以對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病、潰瘍病、青枯病及瘡痂病快速診斷。 圖 8 四重 PCR 特異性檢測(cè)番茄發(fā)病組織 A： Taq 酶采用 2× Taq Master PCR Mix（北京博邁德生物技術(shù)有限公司） ， PCR 擴(kuò)增由 C1000 TouchTM熱循環(huán)儀（賽默飛世爾科技有限公司）完成； B： Taq 酶采用 TaKaRa Taq 酶（大連寶生物工程有限公司） ， PCR 擴(kuò)增由 C1000 TouchTM熱循環(huán)儀（賽默飛世爾科技有限公司）完成。C： Taq 酶采用 2× Taq Master PCR Mix（北京博邁德生物技術(shù)有限公司） ， PCR 擴(kuò)增由 AerisTM型熱循環(huán)儀（新加坡藝思高科技有限公司）完成； D： Taq 酶采用 TaKaRa Taq 酶（大連寶生物工程有限公司） ， PCR 擴(kuò)增由 AerisTM型熱循環(huán)儀（新加坡藝思高科技有限公司）完成。 Fig. 8 Specific amplification for the DNA mix of pathogen-infected tomato tissues by quadruple PCR A： 2× Taq Master PCR Mix（ Biomed） was used in the quadruple PCR system and PCR amplification was performed by C1000 TouchTM thermal cycler （ Thermo Fisher Scientific） ； B： TaKaRa Taq was used in the quadruple PCR system and PCR amplification was performed by AerisTMthermal cycler （ ESCO） ； C： 2× Taq Master PCR Mix（ Biomed） was used in the quadruple PCR system and PCR amplification was performed by C1000 TouchTM thermal cycler（ Thermo Fisher Scientific） ； D： TaKaRa Taq was used in the quadruple PCR system and PCR amplification was performed by AerisTMthermal cycler（ ESCO） . Kang Huajun， Chai Ali， Shi Yanxia， Xie Xuewen， Yuan Junhai， Li Baoju. Quadruple PCR detection of Pseudomonas syringae pv. tomato， Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in infected tomato tissues. 2262 </p>
京公網(wǎng)安備 11010502048994號(hào)
個(gè)人主頁