葡萄病毒A實時熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)的建立及應用.pdf
<p>園藝學報， 2018， 45 (11)： 2243 2253. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0124； http： /www. ahs. ac. cn 2243 收稿日期 ： 2018 05 02； 修回日期 ： 2018 11 09 基金項目 ： 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目（ CARS-29-bc-1） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： yfdong163.com） 葡萄病毒 A 實時熒光定量 RT-PCR 檢測技術(shù)的建立及應用 任 芳，董雅鳳*，張尊平，范旭東，胡國君 （中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所，國家落葉果樹脫毒中心，遼寧興城 125100） 摘 要： 根據(jù)文獻報道和 GenBank 已登錄序列設(shè)計引物建立了葡萄病毒 A（ Grapevine virus A， GVA）SYBR Green染料法實時熒光定量 RT-PCR 檢測技術(shù)體系。該技術(shù)標準曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，擴增效率為 99.2%，決定系數(shù)為 0.999，可特異性檢測 GVA，靈敏度高（達常規(guī) RT-PCR 的100 倍） ，重復性好。對不同季節(jié)、不同品種以及不同部位葡萄樣品（嫩葉、嫩葉柄、老葉、老葉柄、卷須和休眠枝條）中 GVA 的檢出率普遍高于常規(guī) RT-PCR。不同季節(jié)間比較，對秋、冬季樣品檢測效果最好，除嫩葉外其余部位檢出率均達 100%，春夏季檢出率為 10% 100%。不同部位間比較，老葉柄和休眠枝條檢測效果最好， 檢出率均達 100%， 其次為老葉 （ 80% 100%） ， 其余部位樣品檢出率為 10% 100%。在大量田間樣品檢測中，休眠枝條樣品檢測結(jié)果與常規(guī) RT-PCR 一致，而秋季老葉柄樣品檢出率明顯高于常規(guī) RT-PCR。 關(guān)鍵詞： 葡萄；葡萄病毒 A；檢測；實時熒光定量 RT-PCR；常規(guī) RT-PCR 中圖分類號： S 663.1 文獻標志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 11-2243-11 Development and Application of a Quantitative RT-PCR Approach for Detection of Grapevine virus A REN Fang， DONG Yafeng*， ZHANG Zunping， FAN Xudong， and HU Guojun*（ National Center for Eliminating Viruses from Deciduous Fruit Trees， Research Institute of Pomology， Chinese Academy of Agriculture Sciences， Xingcheng， Liaoning 125100， China） Abstract： To develop a rapid and highly sensitive method for Grapevine virus A（ GVA） detection，a SYBR Green real time fluorescence quantitative RT-PCR method（ RT-qPCR） was established， and an excellent linear correlation（ R2= 0.999） and a high amplification efficiency（ E = 99.2%） were obtained from standard curve of cDNA. The RT-qPCR method could be used to detect GVA specifically， and the sensitivity was 100-fold higher than conventional RT-PCR. Reproducibility test revealed that the coefficients of variation in the intra- and extra- assay were 0.16% 0.31% and 2.91%， respectively，indicating a good reproducibility. The RT-qPCR method could be used to detect a wide range of sample types， and the detection rates of samples from different seasons， cultivars and positions（ young leaves，young petioles， old leaves， old petioles， tendrils and dormant branches） were generally higher than Ren Fang， Dong Yafeng， Zhang Zunping， Fan Xudong， Hu Guojun. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of Grapevine virus A. 2244 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2243 2253. conventional RT-PCR. Comparison of the detection rates of samples in different seasons showed that samples in autumn and winter were best for detection， and except for young leaves， the detection rates of all samples in these two seasons were all 100%. The detection rates of samples in spring and summer were 10% to 100%. Comparison of the detection rates of samples in different positions showed that samples of old petioles and dormant branches were best for detection， for which the detection rates were all 100%. The detection rate for old leaves was 80% to 100%， and for samples from other positions was from 10% to 100%. In detection of field samples， the results of dormant branches were most consistent with conventional RT-PCR， but the detection rate of old tendrils in autumn by RT-qPCR was obviously higher than that by conventional RT-PCR. Keywords： grapevine； Grapevine virus A； detection； real-time fluorescent quantitative RT-PCR；conventional RT-PCR 葡萄皺木復合病（ Rugose wood complex， RW）是葡萄上的一類重要病害，發(fā)生普遍，可造成葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延遲、生長減弱甚至衰退死亡等（ Martelli， 1993） 。葡萄皺木復合病主要由線性病毒科（ Flexiviridae）葡萄病毒屬（ Vitivirus）病毒引起，其中葡萄病毒 A（ Grapevine virus A， GVA） 是主要病原之一 （ Martelli et al.， 1997） ， 其還與南非葡萄西拉衰退病有關(guān) （ Goszczynski et al.， 2008） 。目前 GVA 已在南非（ Goszczynski & Jooste， 2003） 、意大利（ Murolo et al.， 2008） 、法國（ Hommay et al.， 2008） 、澳大利亞、美國（ Goszczynski & Habili， 2012）以及中國（任芳 等，2012；王建輝 等， 2013）等普遍發(fā)生，危害趨勢不斷加重。 目前葡萄病毒檢測常用的 ELISA 血清學檢測方法簡單快速，但靈敏度略低于分子檢測方法，且GVA 抗血清需從國外進口，本實驗室制備了 GVA 多克隆抗體，但尚只能對少數(shù)樣品檢測成功（任芳 等， 2014） ； RT-PCR 是另一廣泛應用的方法，但其在靈敏度和檢測范圍上還存在一定不足。實時熒光定量 RT-PCR（ Real-time fluorescent quantitative RT-PCR， RT-qPCR）具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，在多種果樹病毒檢測中靈敏度普遍達常規(guī) RT-PCR 的 100 倍以上（ Beuve et al.， 2007；Loconsole et al.， 2010；秦子禹 等， 2015； Chen et al.， 2016；周俊 等， 2016）。目前國際上已建立葡萄卷葉伴隨病毒、皺木復合相關(guān)病毒、扇葉病毒、斑點病毒等主要葡萄病毒的 RT-qPCR 方法（ Beuve et al.， 2007； Osman & Rowhani， 2008； Poojari et al.， 2016； Bruisson et al.， 2017）。國內(nèi)目前僅報道了葡萄扇葉病毒（周俊 等， 2016）、葡萄卷葉伴隨病毒 3（乾義柯 等， 2017）和葡萄斑點病毒（卓娜 等， 2011）等少數(shù)幾種葡萄病毒的 RT-qPCR 檢測方法，多種葡萄病毒的 RT-qPCR檢測還未見報道。 本研究中建立了一種 GVA SYBR Green染料法 RT-qPCR 檢測技術(shù)，并對不同季節(jié)和不同部位田間葡萄樣品進行檢測驗證和比較，以期為 GVA 的高效、準確檢測提供一種可靠的技術(shù)手段，為檢測樣品的取樣時間及部位提供選擇依據(jù)，并為進一步分析病毒濃度變化規(guī)律提供基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 材料及試劑 2016 2017 年從遼寧省興城市中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所國家落葉果樹脫毒中心毒源保存圃采集葡萄嫩葉（枝條頂端嫩梢從上往下第 2、 3 片葉）、嫩葉柄、老葉（枝條基部自下往上第 2、 3任 芳，董雅鳳，張尊平，范旭東，胡國君 . 葡萄病毒 A 實時熒光定量 RT-PCR 檢測技術(shù)的建立及應用 . 園藝學報， 2018， 45 (11)： 2243 2253. 2245 片葉）、老葉柄、卷須和一年生休眠枝條等樣品備用。 10× PCR Buffer、 dNTPs、 Taq 酶、 DNA Marker DL2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 和 Escherichia coli DH5 感受態(tài)購自大連寶生物公司（ TaKaRa）； M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購自 Promega 公司； 2× SYBR Green qPCR Mix、 pTOPO-TA Vector、膠回收試劑盒購自北京艾德萊生物有限公司；實時熒光定量 RT-PCR 管購自美國 Bio-Rad 公司；實時熒光定量 PCR 儀為美國 BIO-RAD CFX ConnectTMReal-Time System。 1.2 引物設(shè)計及克隆鑒定 根據(jù) GenBank 已登錄序列和本實驗室獲得的 GVA 遼寧分離物序列（任芳 等， 2012），利用軟件 Primer premier 5.0 及 Oligo 7.0 設(shè)計引物，并參考文獻報道（ Osman & Rowhani， 2008）部分 GVA引物略作修改，設(shè)計和合成 4 對 GVA 特異性引物 QA1F/1R、 QA2F/2R、 QA3F/3R 和 QA4F/2R（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 表 1 GVA 實時熒光定量 RT-PCR 引物序列 Table 1 Sequences of GVA primers used in RT-qPCR detection 引物名稱 Primer name 目標基因 Target gene 引物 /探針序列（ 5 3） Primer/Probe sequence 產(chǎn)物大小 /bp Product size 參考文獻 Reference QA1F/1R CP F： CGACCGAAATATGTACCTGAATACTC 111 Osman & Rowhani， 2008 R： TTGCTAGCTTTAGGACCTACTATATCTACCT 本研究 This study QA2F/2R CP F： CGACCGAACTATGTACCTGAATACTC 100 Osman & Rowhani， 2008 R： AGGACCTACTATATCTACCTC 本研究 This study QA3F/3R CP F： CGACCGAAATATGTACCTGAACACTC 111 本研究 This study R： TTGCTAGCTTTAGGTCCTACTATATCTACCT 本研究 This study QA4F/2R CP F： CGACCGGAATATGTACCTGAATACTC 100 本研究 This study R： AGGACCTACTATATCTACCTC 本研究 This study 取葡萄相應部位樣品 50 mg， 采用吸附柱法 （ MacKenzie et al.， 1997） 進行總 RNA 提取， 80 保存?zhèn)溆谩?采用兩種方法反轉(zhuǎn)錄： （ 1） 普通反轉(zhuǎn)錄體系 25.0 L： 將 5.0 L 總 RNA 與 1.0 L 0.1 g · L-1隨機引物和 9.0 L 水混合， 95 變性 5 min 后立即置于冰中冷卻 2 min；加入 5.0 L 5× MLV-RT buffer、 1.25 L 10 mmol · L-1dNTPs、 0.5 L 200 U · L-1M-MLV 和 3.25 L DEPC 水， 經(jīng) 37 10 min、42 50 min、 70 5 min 合成 cDNA； （ 2）去除基因組 DNA 反轉(zhuǎn)錄（ PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser， Takara） ：取 5× gDNA Eraser buffer 2.0 L， gDNA Eraser 1.0 L，總 RNA 1.0 L混勻， 42.0 2 min； 加入以下混合液： PrimeScript RT Enzyme Mix 1.0 L， RT Primer Mix 1.0 L，5× PrimeScript buffer 2 4.0 L， RNase Free dH2O 4.0 L； 37 15 min， 85 5 s， 20 保存?zhèn)溆谩? 分別采用常規(guī) RT-PCR 和 RT-qPCR 對 4 對引物進行擴增和篩選。以普通反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA為模板進行常規(guī) RT-PCR 擴增，反應體系 25 µL，反應條件： 94 5 min， 94 30 s， 55 20 s，72 20 s， 35 個循環(huán)后， 72 延伸 7 min。 PCR 擴增產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。相同模板同時用于 RT-qPCR 擴增，反應體系 25 L，含 2× SYBR Green qPCR Mix 12.5 L， 10 mol · L-1正、反向引物各 0.5 L， DNase/RNase Free dH2O 10.5 L 和 cDNA 1 L。反應條件： 95 預變性 3 min，Ren Fang， Dong Yafeng， Zhang Zunping， Fan Xudong， Hu Guojun. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of Grapevine virus A. 2246 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2243 2253. 95 15 s， 60 15 s， 72 20 s， 40 個循環(huán)，在延伸步驟記錄熒光信號。 RT-qPCR 擴增產(chǎn)物的熔解曲線分析溫度范圍為 60 95 ，其中每 5 s 增加溫度 0.5 ，以鑒別引物二聚體和非特異性擴增。以擴增曲線 Cq 值（擴增產(chǎn)物熒光信號達到設(shè)定的閾值所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)） < 30 且熔解曲線為單一峰判定為陽性。以去除基因組 DNA 反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 10 倍梯度稀釋為模板進行RT-qPCR 擴增，構(gòu)建標準曲線，每個梯度設(shè)置 3 個重復。 PCR 擴增產(chǎn)物膠回收純化后與 pTOPO-TA Vector 連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 感受態(tài)細胞，挑取白色菌落進行菌液培養(yǎng)， PCR 鑒定篩選陽性克隆，將陽性克隆送北京諾賽基因組研究中心進行測序。采用 NCBI BLAST 方法比較所得序列與 GenBank 已登錄分離物的同源性。 1.3 實時熒光定量 RT-PCR 反應體系優(yōu)化及驗證 1.3.1 反應體系優(yōu)化 以去除基因組 DNA 反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 1 × 10-1稀釋作為模板，用不同退火溫度（ 50.0、 50.8、52.4、 54.7、 57.6、 60.0、 61.3 和 62.0 ）進行 RT-qPCR 擴增，根據(jù) Cq 值和擴增效果選擇確定最佳退火溫度；在最佳退火溫度下，分別采用不同引物濃度（ 100、 200、 300、 400 和 500 nmol · L-1）進行 RT-qPCR 擴增，根據(jù) Cq 值和擴增效果選擇確定最佳引物濃度。 1.3.2 特異性檢測 從本實驗室毒源保存圃采集分別感染了 GVA、葡萄病毒 B（ Grapevine virus B， GVB） 、葡萄病毒 E（ Grapevine virus E， GVE） 、 萄卷葉伴隨病毒 GLRaV-1、 GLRaV-2、 GLRaV-3、 GLRaV-4、 GLRaV-7、葡萄斑點病毒（ Grapevine fleck virus， GFKV）和沙地葡萄莖痘病毒（ Grapevine rupestris stem pitting associated virus， GRSPaV）的葡萄樣品，提取總 RNA，采用普通反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，用于 RT-qPCR特異性檢測，以健康無毒植株樣品作陰性對照。 1.3.3 靈敏度比較 以普通反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 10 倍梯度稀釋（ 1 10-9）為模板，進行常規(guī) RT-PCR 和 RT-qPCR檢測，比較檢測靈敏度。 1.3.4 重復性試驗 從同一 GVA 帶毒植株同一枝條上分別取 3 份樣品作為生物學重復，以相同方法同時提取總RNA，以去除基因組 DNA 反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 1 × 10-2稀釋為模板進行 RT-qPCR 擴增，每份樣品 3次重復。分別計算每份樣品組內(nèi)重復以及 3 份樣品組間重復的平均 Cq 值和 Cq 值標準差（ SD）和變異系數(shù)（ CV， % = 標準差 /平均 Cq 值 × 100） 。 1.4 田間樣品檢測 1.4.1 不同季節(jié)和不同部位葡萄樣品檢測 選擇前期經(jīng) ELISA 或常規(guī) RT-PCR 檢測 GVA 為陽性的 10 株田間葡萄植株， 分別在 5 月 （春） 、7 月（夏）、 9 月（秋）采集植株上部嫩葉、上部嫩葉柄、下部老葉、下部老葉柄和卷須 5 個部位樣品， 11 月（冬）采集休眠枝條，同時采集健康無毒植株樣品作陰性對照。所有樣品采用普通反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，用于常規(guī) RT-PCR 和 RT-qPCR，比較檢測效果。 1.4.2 大量田間葡萄樣品檢測 根據(jù)不同季節(jié)和不同部位葡萄樣品的檢測效果， 2016 2017 年采集大量田間葡萄樣品相應部位，分別采用常規(guī) RT-PCR 和 RT-qPCR 檢測 GVA，比較檢測效果。 任 芳，董雅鳳，張尊平，范旭東，胡國君 . 葡萄病毒 A 實時熒光定量 RT-PCR 檢測技術(shù)的建立及應用 . 園藝學報， 2018， 45 (11)： 2243 2253. 2247 2 結(jié)果與分析 2.1 引物設(shè)計與篩選 選擇前期經(jīng) ELISA 或常規(guī) RT-PCR 檢測 GVA 為陽性的 5 個葡萄樣品，以健康無毒的葡萄樣品作為陰性對照，分別進行常規(guī) RT-PCR 和 RT-qPCR 擴增。 4 對引物均在 5 個陽性樣品中擴增到目的條帶，陰性對照和水對照沒有條帶，但引物 QA3F/3R 有 1 個樣品，引物 QA4F/2R 所有樣品的目的條帶較弱，引物 QA1F/1R 和 QA2F/2R 所有目的條帶明亮且均為單一目的條帶，擴增效果較好（圖1）。 4 對引物 5 個陽性樣品 RT-qPCR 擴增曲線 Cq 值均小于 30， 熔解曲線均為單一峰， 判定為陽性。但引物 QA4F/2R 擴增陰性對照和水對照也有明顯擴增曲線且熔解曲線有峰， 表明該引物有非特異性擴增，因此只選擇引物 QA1F/1R、 QA2F/2R 和 QA3F/3R 進行標準曲線構(gòu)建。 3 對引物在 1 10-5稀釋梯度范圍內(nèi)擴增曲線呈梯度分布， QA1F/1R 擴增效率（ E）為 112.5%，決定系數(shù)（ R2） = 0.990，擴增效率過高，標準曲線相關(guān)性略差； QA2F/2R 的擴增效率為 99.2%， R2 = 0.999，均達到統(tǒng)計分析要求； QA3F/3R 的擴增效率為 103.7%， R2 = 0.981，決定系數(shù)過低，標準曲線相關(guān)性較差。 綜合 RT-PCR、 RT-qPCR 擴增以及標準曲線分析結(jié)果， 選擇擴增效果和相關(guān)性均最好的 QA2F/2R作為 GVA RT-qPCR 檢測引物。 圖 1 GVA 引物 QA1F/1R 和 QA2F/2R RT-PCR 擴增結(jié)果比較 M： DL2000； W：清水對照； 1 5： GVA 陽性的葡萄樣品； CK-：陰性對照。 Fig. 1 Comparison of RT-PCR amplification of GVA primers QA1F/1R and QA2F/2R M： DL2000； W： Water control； 1 5： GVA positive grapevine samples； CK-： Negative control. 2.2 克隆鑒定 采用引物 QA2F/2R 對秋蜜葡萄進行 RT-PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆測序共獲得 6 個克隆序列，其中 5 個克隆序列完全一致，經(jīng) NCBI BLAST 比對，與 GenBank 已登錄 GVA 序列相似性較高，達 94% 99%，表明擴增片段正確，為 GVA 目的片段（圖 2）。 Ren Fang， Dong Yafeng， Zhang Zunping， Fan Xudong， Hu Guojun. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of Grapevine virus A. 2248 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2243 2253. 圖 2 GVA 不同分離物核苷酸序列比較 QM1 QM6：本研究獲得 GVA 序列；其余為 GenBank 已登錄 GVA 序列。 Fig. 2 Sequence alignment of various GVA isolates QM1 QM6： GVA sequences obtained in this study； The others are GVA sequences logined in GenBank. 2.3 實時熒光定量 RT-PCR 反應體系優(yōu)化 退火溫度梯度 50.0 62.0 的 RT-qPCR 擴增 Cq 值為 23.26 24.04，不同溫度間 Cq 值差異較小，僅 0.78，不到一個循環(huán)周期，其中退火溫度 60.0 時 Cq 值最小，為 23.26。 54.7 時相對熒光強度最強，其次為 60.0 ，熔解曲線為單一峰，因此選擇 60.0 作為最終退火溫度。隨著引物濃度升高， Cq 值逐漸減小，相對熒光強度逐漸增加，到達最高濃度（ 500 nmol · L-1）時， Cq 值最低，為 22.19，但相對熒光強度不再增強，與 300 nmol · L-1的相對熒光強度接近；在擴增陰性對照和水對照時， 100 和 200 nmol · L-1引物濃度沒有明顯擴增曲線，熔解曲線也沒有擴增峰，但 300、 400和 500 nmol · L-1濃度時具有與陽性樣品相近的雜峰。因此，為避免非特異擴增，選擇擴增效果較好、相對較低的引物濃度 200 nmol · L-1作為最終引物濃度。 2.4 實時熒光定量 RT-PCR 反應體系驗證 2.4.1 特異性檢測 用本研究建立的 RT-qPCR 方法檢測分別感染了 GVA、 GVB、 GVE、 GFLV、 GLRaV-1、 GLRaV-2、任 芳，董雅鳳，張尊平，范旭東，胡國君 . 葡萄病毒 A 實時熒光定量 RT-PCR 檢測技術(shù)的建立及應用 . 園藝學報， 2018， 45 (11)： 2243 2253. 2249 GLRaV-3、 GLRaV-4、 GLRaV-7、 GFKV 和 GRSPaV 等病毒的葡萄樣品以及陰性對照葡萄樣品，只有感染 GVA 樣品有擴增曲線， Cq 值為 21.59，其余樣品均沒有明顯擴增曲線，與陰性對照擴增結(jié)果相近（圖 3） ，表明該 RT-qPCR 方法可特異性檢測 GVA。 圖 3 RT-qPCR 特異性檢測 Fig. 3 The specificity test of RT-qPCR 2.4.2 靈敏度比較 常規(guī) RT-PCR 能檢測到 1 × 10-2稀釋梯度的 GVA 陽性葡萄樣品 cDNA（圖 4） 。 RT-qPCR 檢測各稀釋梯度模板擴增曲線呈梯度分布，檢測 1 × 10-4稀釋梯度時 Cq 值仍小于 30（圖 5） ，為陽性，表明本研究中 RT-qPCR 檢測靈敏度可達常規(guī) RT-PCR 的 100 倍。 圖 4 不同稀釋梯度葡萄樣品常規(guī) RT-PCR 檢測靈敏度 Fig. 4 Sensitivity of RT-PCR detection of grapevine samples at different diluted gradient 圖 5 不同稀釋梯度葡萄樣品 RT-qPCR 檢測靈敏度 Fig. 5 Sensitivity of RT-qPCR detection of grapevine samples at different diluted gradient 2.4.3 重復性試驗 根據(jù) RT-qPCR 擴增 Cq 值數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，同一枝條上 3 份樣品組內(nèi)重復的變異系數(shù)最大Ren Fang， Dong Yafeng， Zhang Zunping， Fan Xudong， Hu Guojun. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of Grapevine virus A. 2250 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2243 2253. 為 0.31%，組間重復變異系數(shù)為 2.91%（表 2） ，表明該方法具有較好的重復性，檢測穩(wěn)定性好。 表 2 重復性試驗結(jié)果 Table 2 The result of reproducibility 重復類型 Repeat type 重復組編號 Number of repeat group Cq 平均值 Mean Cq value 標準差 SD 變異系數(shù) /% CV 組內(nèi)重復 Reproducibility test of intra-assay 1 26.99 0.05 0.19 2 25.71 0.08 0.31 3 25.63 0.04 0.16 組間重復 Reproducibility test of extra-assay 26.11 0.76 2.91 2.5 田間樣品檢測 2.5.1 不同季節(jié)和不同部位葡萄樣品檢測 從 10 株感染 GVA 的葡萄上分別采集春、夏、秋 3 個季節(jié)的嫩葉、嫩葉柄、老葉、老葉柄和卷須 5 個部位樣品以及冬季休眠枝條，共 160 個樣品，分別采用常規(guī) RT-PCR 和 RT-qPCR 進行 GVA檢測。結(jié)果（表 3）表明， RT-qPCR 對各季節(jié)和部位樣品的檢出率普遍高于常規(guī) RT-PCR。不同季節(jié)比較， RT-qPCR 冬季檢出率 100%，比常規(guī) RT-PCR 高 10%，秋季僅嫩葉檢出率略低（ 50%） ，其余 4 個部位檢出率均達 100%，比常規(guī) RT-PCR 高 10% 80%，春夏季檢出率 10% 100%，比常規(guī)RT-PCR 高 10% 40%。不同部位比較，枝條和老葉柄樣品檢測效果最好， RT-qPCR 檢測春、夏、 表 3 不同季節(jié)和不同部位葡萄樣品常規(guī) RT-PCR 和 qRT-PCR 檢測結(jié)果 Table 3 RT-PCR and qRT-PCR detection of samples collected from different seasons and different positions of grapevine 方法 Method 品種 Cultivar 春 Spring 夏 Summer 秋 Autumn 冬季枝條Dormant branch of winter A B C D E A B C D E A B C D E RT-PCR 巨玫瑰 Jumeigui - + + + + - - + + - - + + + - + 紅雙味 -1 Hongshuangwei-1 - + + + - - + + + + + - + + - + 庫特賽塔 Kutesata + + + + + - - + + + + + + + + + 紅繭 Hongjian - - - - - - - - - - - - - - - + 紅雙味 -2 Hongshuangwei-2 - - + + + - - + + - + + + + - + 黑拉查基 Helachaj - - - - - - - - - - - - - - - - 大寶 Taiho - + + + - - + + + - - + + + - + 烏茲別克玫瑰 Muscat Uzbekistan - + - + - - - - + +- + - + - + 寧夏蛇龍珠 Ningxia Cabernet Gernischet - - + + - - - + + - - + - + - + 秋蜜 Qiumi - - + + + - + - + - + + + + + + 檢出率 /% Detection rate 10 50 70 80 40 0 30 60 80 30 40 70 60 80 20 90 RT-qPCR 巨玫瑰 Jumeigui - + + + + - - + + - + + + + + + 紅雙味 Hongshuangwei - + + + + - + + + + - + + + + + 庫特賽塔 Kutesata - + + + + - + + + + + + + + + + 紅繭 Hongjian - - + + - - + + + - + + + + + + 紅雙味 Hongshuangwei - - + + + - - + + - - + + + + + 黑拉查基 Helachaj - - + + - - + + + - + + + + + + 大寶 Taiho + - - + - - + - + - - + + + + + 烏茲別克玫瑰 Muscat Uzbekistan - + - + + + + + + + + 寧夏蛇龍珠 Ningxia Cabernet Gernischet + - + + - - +- + + + + + 秋蜜 Qiumi - - + + + - - - + - - + + + + + 檢出率 /% Detection rate 20 40 80 100 60 10 70 80 100 40 50 100 100 100 100 100 注： A：嫩葉； B：嫩葉柄； C：老葉； D：老葉柄； E：卷須。 Note： A： Young leaf； B： Young petiole； C： Old leaf； D： Old petiole； E： Tendril. 任 芳，董雅鳳，張尊平，范旭東，胡國君 . 葡萄病毒 A 實時熒光定量 RT-PCR 檢測技術(shù)的建立及應用 . 園藝學報， 2018， 45 (11)： 2243 2253. </p>
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