芹菜中類胡蘿卜素合成相關(guān)番茄紅素ε–環(huán)化酶基因AgLCYE的克隆與表達分析.pdf

園藝學報， 2018， 45 (2)： 341 350. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0620； http： /www. ahs. ac. cn 341 收稿日期 ： 2017 11 02； 修回日期 ： 2018 01 10 基金項目 ： 國家自然科學基金項目（ 31272175） ；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目（ NCET-11-0670） ；江蘇省自然科學基金杰出青年基金項目（ BK20130027） ；江蘇高校優(yōu)勢學科建設項目（ PAPD） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： xiongaishengnjau.edu.cn） 芹菜中類胡蘿卜素合成相關(guān)番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE 的克隆與表達分析 李靜文，馬 靜，卻 楓，王 楓，徐志勝，熊愛生*（南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，南京 210095） 摘 要： 番茄紅素 環(huán)化酶（ lycopene epsilon cyclase， LCYE）是類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶。從 津南實芹 中克隆獲得番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE。 序列分析結(jié)果顯示， AgLCYE 包含 1 個 1 590 bp 的開放閱讀框，編碼 529 個氨基酸。氨基酸序列多重比對表明，芹菜和其他物種的 LCYE 同源性為77.68%， AgLCYE 和同屬傘形科的胡蘿卜 LCYE 氨基酸序列同源性高達 98.07%。 AgLCYE 蛋白與胡蘿卜LCYE 蛋白進化關(guān)系最近。 AgLCYE 蛋白屬于親水性蛋白，預測的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中有 9 個 螺旋和 18個 折疊。無序化分析結(jié)果表明， AgLCYE 編碼的氨基酸序列有 4 個無序化區(qū)域。用 UPLC 方法對 30、45 和 60 d 齡芹菜葉中葉黃素和 胡蘿卜素的含量進行測定， 30 d 時葉黃素含量最高， 45 d 時最低， 45和 60 d 時無顯著性差異，葉片中的葉黃素含量均高于葉柄。芹菜葉片和葉柄中均沒有檢測到 胡蘿卜素的存在。熒光定量表達分析結(jié)果顯示，隨著生長期的增加，葉片中 AgLCYE 的相對表達量逐漸升高；葉柄中逐漸降低。 關(guān)鍵詞： 芹菜；類胡蘿卜素；番茄紅素 環(huán)化酶基因；葉黃素； 胡蘿卜素 中圖分類號： S 636.3 文獻標志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 02-0341-10 Cloning and Expression Profiles Analysis of Carotenoid Biosynthesis Related Gene AgLCYE from Celery LI Jingwen， MA Jing， QUE Feng， WANG Feng， XU Zhisheng， and XIONG Aisheng*（ State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China， College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China） Abstract： Celery（ Apium graveolens L.） is an important vegetable in Apiaceae family， with excellent source of carotenoid. Lycopene epsilon cyclase is a key enzyme in the pathway of carotenoid biosynthesis. Here， the AgLCYE gene encoding lycopene epsilon cyclase was cloned from A. graveolens Jinnan Shiqin . The sequences of AgLCYE gene contained an open reading frame with the length of 1 590 bp， which encoded 529 amino acids. Multiple alignments of the AgLCYE amino acid sequences from celery and other different plants showed a homology of 77.68%. The homology of LCYE was up to 98.07% Li Jingwen， Ma Jing， Que Feng， Wang Feng， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and expression profiles analysis of carotenoid biosynthesis related gene AgLCYE from celery. 342 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 341 350. between celery and carrot. Phylogenetic tree analysis showed that the LCYE proteins were conserved. The physicochemical property analysis showed that AgLCYE belonged to hydrophilic protein. There were 9 alpha helices and 18 beta folds in the predicted tertiary structure of the protein. The results of disordered analysis showed that the amino acid sequence of AgLCYE protein had four disorder regions. The contents of lutein and -carotene of celery leaves in different growth stages（ 30， 45， and 60 d） were determined by UPLC. The peak of lutein content was detected at 30 d. The lowest content of lutein was observed in 45 d. There was no significant difference between 45 d and 60 d. The lutein content in leaf blade was higher than that in petiole of celery. The presences of -carotene were not detected in leaf blade and petiole of celery，respectively. The expression levels of AgLCYE gene in celery were detected by quantitative real-time PCR. In leaf blade， the relative expression levels of AgLCYE gene increased gradually over the process of celery growth and development. On the contrary， the relative expression levels of AgLCYE gene decreased in petiole. Keywords： celery； carotenoid； AgLCYE gene； lutein； -carotene 高等植物中， 類胡蘿卜素是合成維生素 A 和植物激素 ABA 的前體 （ Polívka et al.， 2004； Polívka & Frank， 2010） 。類胡蘿卜素可以作為葉綠體光合作用的輔助色素，還能夠保護植物組織免受強光破壞，同時參與光形態(tài)的建成（ Nambara & Marion-Poll， 2005； Bowman & Simon， 2013） 。類胡蘿卜素分子中存在共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，所以在可見光下會呈現(xiàn)出不同的顏色，使得植物顏色呈現(xiàn)多樣化，如：胡蘿卜中的 胡蘿卜素，番茄和西瓜中的番茄紅素，萬壽菊中的葉黃素等（ Hirschberg， 2001） 。類胡蘿卜素是國際公認的具有生理活性的功能性抗氧化劑，在抗癌、抗衰老等方面具有重要的作用（ Prabhala et al.， 2010） 。此外，類胡蘿卜素還是一種食用油溶性色素，具有很好的著色性能（ Blumberg， 1995） 。 番茄紅素 環(huán)化酶（ lycopene epsilon cyclase， LCYE）是類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化番茄紅素的一端形成 環(huán)，生成 胡蘿卜素，進而合成 胡蘿卜素和葉黃素。 LCYE 基因的表達水平在一定程度上與植物中 /胡蘿卜素的比值有關(guān)（ Harjes et al.， 2008） 。已有研究表明，黃色胡蘿卜中 LCYE 基因表達水平較高，根中主要積累葉黃素（ Clotault et al.， 2008） 。在番茄 Delta突變體中， LCYE 基因轉(zhuǎn)錄水平的提高，導致果實積累大量的 胡蘿卜素（ Ronen et al.， 1999） 。在萵苣中， LCYE 上的單氨基酸突變增加了其催化番茄紅素生成 環(huán)的活性（ Cunningham & Gantt，2001） 。玉米 lcyb 突變體中由于 LCYE 活性的增強，胚乳中產(chǎn)生了大量稀有的類胡蘿卜素，如 胡蘿卜素和萵苣黃素等（ Bai et al.， 2009） 。 芹菜（ Apium graveolens L.）富含類胡蘿卜素、 B 族維生素、芹菜素等（吳蓓 等， 2016；譚國飛 等， 2017； Li et al.， 2018） 。目前芹菜中關(guān)于類胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因的報道相對較少。以津南實芹為試驗材料，從其 cDNA 中克隆獲得芹菜編碼番茄紅素 環(huán)化酶的基因 AgLCYE，并對其進行序列分析。通過超高效液相色譜法（ Ultra Performance Liquid Chromatography， UPLC）對不同生長時期芹菜葉中的 胡蘿卜素和葉黃素含量進行了測定， 并用實時熒光定量 PCR（ quantitative real-time PCR， RT-qPCR）分析了 AgLCYE 在不同生長時期及葉不同部位的表達水平，為進一步深入研究芹菜中番茄紅素 環(huán)化酶在類胡蘿卜素生物合成中的功能提供基礎。 李靜文，馬 靜，卻 楓，王 楓，徐志勝，熊愛生 . 芹菜中類胡蘿卜素合成相關(guān)番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE 的克隆與表達分析 . 園藝學報， 2018， 45 (2)： 341 350. 343 1 材料與方法 1.1 材料及處理 芹菜津南實芹種子由南京農(nóng)業(yè)大學傘形科蔬菜作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室保存。2017 年 2 月將種子播種于該實驗室植物生長室，于旺盛生長階段中的 30、 45 和 60 d 時，選取生長勢一致的植株，剪取葉片和葉柄部分，用錫紙包裹后液氮速凍，保存于 80 冰箱，用于提取總RNA 和反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。 大腸桿菌菌株 DH5 由本實驗室保存。質(zhì)粒載體 pMD19-T Vector、 DNA 分子量 marker、 Ex Taq DNA 聚合酶、 Prime Script RT reagent Kit 和 SYBR Premix Ex Taq 試劑盒等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。 RNA simple Total RNA Kit 由天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)， DNA 凝膠回收試劑盒購于杭州維特潔公司。葉黃素（純度 90%）標準品購于上海源葉生物科技有限公司（中國上海） ， 胡蘿卜素（純度 95%）標準品購于和光純藥工業(yè)株式會社（日本大阪） 。 1.2 芹菜 AgLCYE 的克隆 根據(jù)本實驗室測定的芹菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（ Jia et al.， 2015） ，檢索拼接獲得 AgLCYE 的序列。根據(jù)芹菜 AgLCYE 序列，用 Primer Premier 6.0 設計一對引物（ AgLCYE-F： 5-ATGGAGACGTACTG CATCGGAGGC-3； AgLCYE-R： 5-CTAGACCGTTAGATATGTTCTTACC-3， ） ，由通用（滁州）生物科技有限公司合成。以津南實芹 cDNA 為模板進行 PCR 擴增。 PCR 反應體系為 20 L： cDNA（ 2.5 ng · L-1） 1 L， Ex Taq DNA 聚合酶 10 L，引物各加 1 L， ddH2O 7 L。反應條件為： 94 預變性 5 min； 94 變性 30 s， 54 退火 30 s， 72 延伸 120 s，共 30 個循環(huán)； 72 延伸 10 min。反應產(chǎn)物由 1.5%瓊脂凝膠電泳分離后，切膠。采用 DNA 凝膠回收試劑盒進行回收。將回收產(chǎn)物連接到 pMD19-T 載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株 DH5 中，提取質(zhì)粒經(jīng) PCR 鑒定后，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成測序。 1.3 生物信息學分析 在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行 BLAST，獲得胡蘿卜等其他物種中番茄紅素 環(huán)化酶的氨基酸序列，利用 DNAMAN 5.0 進行比對分析， AgLCYE 蛋白親 /疏水性分析。利用在線工具包（ SMS） （ http：/www. bio-soft.net/sms）和 ExPASy-ProtParam（ http： /web.expasy.org/protparam）分析氨基酸的理化性質(zhì)（ Gasteiger et al.， 2003； Harrison & Bagajewicz， 2015） 。用 MEGA 6.0 中的 Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（ Tamura et al.， 2013） 。利用 FoldIndex 程序測定 AgLCYE 蛋白的無序特征（ Jaime et al.， 2005） 。利用 Swiss-Model（ http： /www.Swissmodel.expasy.org）構(gòu)建 AgLCYE 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型（ Arnold et al.， 2006） 。 1.4 芹菜葉中類胡蘿卜素的提取和含量的測定 依照陳敏氡等（ 2013）和 Ma 等（ 2017）的方法，分別取 30、 45 和 60 d津南實芹的葉片和葉柄，將鮮樣于研缽中用液氮研磨，然后在冷凍干燥機中進行冷凍抽干，稱取樣品，用丙酮提取類胡蘿卜素。將提取液用 0.45 m 濾膜過濾后定容，通過超高效液相色譜（ Waters，美國）進行類胡蘿卜素含量的檢測。 UPLC 檢測柱型： UPLC BEH C18（ 2.1 mm × 100 mm， 1.7 m； Waters，美國） ，檢測波長： 450 nm，流動相為乙腈 甲醇 = 9 1，流速： 0.25 mL · min-1，色譜柱溫： 30 。設置 3 次重復。 Li Jingwen， Ma Jing， Que Feng， Wang Feng， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and expression profiles analysis of carotenoid biosynthesis related gene AgLCYE from celery. 344 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 341 350. 1.5 AgLCYE 的表達分析 使用 RNA simple Total RNA Kit 總 RNA 提取試劑盒提取樣品總 RNA，然后用 Prime Script RT reagent Kit 試劑盒將提取的 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。 實時熒光定量 PCR 平臺為 CFX96TMreal-time PCR system（ Bio-Rad，美國） 。芹菜 TUB-B 基因作為內(nèi)參基因（ Li et al.， 2016） 。其引物為 F： 5-TGG TGGCACTGGATCTGGTATGG-3； R： 5-ACTTTCGGAGGAGGGAAGACTGAA-3。目標基因的引物為 BDAgLCYE-F ： 5-TTTATCATAGCACCTCACCACTTG-3 ； BDAgLCYE-R ： 5-GACCGT TAGATATGTTCTTACCA-3。引物由通用（滁州）生物科技有限公司合成。每個處理設置 3 個生物學重復，采用 2-CT方法進行結(jié)果分析（ Pfaffl， 2001） 。 2 結(jié)果與分析 2.1 芹菜合成番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE 的 克隆 以芹菜津南實芹葉片 cDNA 為模板，用引物 AgLCYE-F 和 AgLCYE-R 進行 PCR 擴增，獲得預期 1 500 bp 左右擴增片段。克隆后測序結(jié)果（圖 1）顯示， AgLCYE 含有 1 個 1 590 bp 的開放閱讀框（ open reading frame， ORF） ，編碼 529 個氨基酸。 圖 1 芹菜 AgLCYE 的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列 Fig. 1 Nucleotide acids and deduced amino acids sequences of AgLCYE from celery 李靜文，馬 靜，卻 楓，王 楓，徐志勝，熊愛生 . 芹菜中類胡蘿卜素合成相關(guān)番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE 的克隆與表達分析 . 園藝學報， 2018， 45 (2)： 341 350. 345 2.2 番茄紅素 環(huán)化酶蛋白氨基酸序列的比對分析 將芹菜番茄紅素 環(huán)化酶氨基酸序列與胡蘿卜（ Daucus carota） 、萬壽菊（ Tagetes erecta）煙草 （ Nicotiana tabacum） 、 甘薯 （ Ipomoea batatas） 、 擬南芥 （ Arabidopsis thaliana） 、 大豆 （ Glycine max） 、黃瓜（ Cucumis sativus） 、橙（ Citrus sinensis） 、麻風樹（ Jatropha curcas） 、黃秋葵（ Abelmoschus esculentus）中的番茄紅素 環(huán)化酶蛋白氨基酸序列進行比對，結(jié)果（圖 2）表明這些番茄紅素 環(huán)化酶氨基酸序列的同源性為 77.68%，其中芹菜和胡蘿卜 LCYE 氨基酸序列的同源性高達 98.07%。 圖 2 芹菜與其他物種 LCYE 氨基酸序列的多重比對 1：芹菜； 2：胡蘿卜； 3：萬壽菊； 4：煙草； 5：甘薯； 6：擬南芥； 7：大豆； 8：黃瓜； 9：橙； 10：麻風樹； 11：黃秋葵。 Fig. 2 The alignment of amino acid sequences of LCYE from celery and other different plants 1： Apium graveolens； 2： Daucus carota； 3： Tagetes erecta； 4： Nicotiana tabacum； 5： Ipomoea batatas； 6： Arabidopsis thaliana； 7： Glycine max； 8： Cucumis sativus； 9： Citrus sinensis； 10： Jatropha curcas； 11： Abelmoschus esculentus. Li Jingwen， Ma Jing， Que Feng， Wang Feng， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and expression profiles analysis of carotenoid biosynthesis related gene AgLCYE from celery. 346 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 341 350. 2.3 AgLCYE 蛋白進化樹分析 選取番茄紅素 環(huán)化酶氨基酸序列相似度較高的物種進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，進一步探究AgLCYE 蛋白的進化關(guān)系。結(jié)果（圖 3）表明， AgLCYE 蛋白與同屬傘形科的胡蘿卜 LCYE 蛋白進化關(guān)系最近，其次與菊科和茄科中的較近，而與大戟科、蕓香科、錦葵科的較遠。 圖 3 AgLCYE 蛋白的系統(tǒng)進化樹 Fig. 3 Phylogenetic tree of AgLCYE protein 2.4 LCYE 氨基酸的理化性質(zhì)和親 /疏水性分析 對不同植物來源的 LCYE 蛋白進行理化性質(zhì)和組成成分分析，結(jié)果見表 1。 LCYE 蛋白的氨基酸數(shù)在 516 546 之間，相對分子質(zhì)量為（ 57 61 kD） ，理論等電點（ pI） 5.71 7.87。酸性氨基酸（包括天冬氨酸和谷氨酸）與堿性氨基酸（包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸）含量基本相同，為 12%左右。脂肪族氨基酸含量相對較高，為 23%左右。芳香族氨基酸含量相對較低，為 10%左右。除了黃瓜、牽?；ê透适碇?LCYE 蛋白總平均疏水性（ Grand average of hydrophobicity， GRAVY）為正值， 表 1 不同植物來源的 LCYE 蛋白氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析 Table 1 The comparison of composition and physical and chemical characterization of amino acid sequences of LCYE protein from different plant species 植物 Plant 氨基酸數(shù) Number of amino acid 理論相對分子量 /D Theoretical relative molecular mass pI 氨基酸比例 /% Ratio of amino acid 總平均疏水性 Grand average of hydrophobicity 酸性 Positive堿性 Negative脂肪族 Aliphatic 芳香族 Aromatic 芹菜 Apium graveolens 529 59 447.7 7.08 13 11 24 10 0.044 胡蘿卜 Daucus carota 530 59 552.9 7.09 13 11 23 10 0.050 萬壽菊 Tagetes erecta 516 57 365.4 6.30 11 10 22 10 0.003 向日葵 Helianthus annuus 535 59 745.2 7.87 12 10 22 10 0.014 煙草 Nicotiana tabacum 523 58 665.9 7.12 13 11 23 10 0.017 枸杞 Lycium ruthenicum 523 58 538.7 7.03 12 11 23 10 0.048 牽?；?Ipomoea nil 546 61 042.4 5.71 12 12 24 9 0.026 甘薯 Ipomoea batatas 542 60 600.0 6.01 12 11 24 9 0.007 擬南芥 Arabidopsis thaliana 524 58 515.1 5.79 12 12 23 10 0.103 大豆 Glycine max 532 59 450.6 7.51 13 11 23 10 0.087 黃瓜 Cucumis sativus 533 58 876.0 6.07 11 11 23 10 0.003 李靜文，馬 靜，卻 楓，王 楓，徐志勝，熊愛生 . 芹菜中類胡蘿卜素合成相關(guān)番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE 的克隆與表達分析 . 園藝學報， 2018， 45 (2)： 341 350. 347 屬疏水性蛋白之外，其他均 為負值，屬親水性蛋白。結(jié)果表明不同物種的 LCYE 蛋白氨基酸理化性質(zhì)相似。 通過 DNAMAN 5.0 對芹菜中的 AgLCYE 蛋白進行親 /疏水性分析，結(jié)果表明，芹菜 AgLCYE蛋白為親水性蛋白。 其中疏水性最強的位置是第 492 位亮氨酸 （ Leu） ， 其次為第 112 位頡氨酸 （ Val） ，親水性最強的位置是第 441 位賴氨酸（ Lys） 。 2.5 芹菜 AgLCYE 蛋白無序化分析和三級蛋白結(jié)構(gòu)的預測 利用 FoldIndex 程序?qū)η鄄酥?AgLCYE 蛋白的無序特征進行測定。結(jié)果顯示， AgLCYE 蛋白編碼的氨基酸序列在芹菜中有 4 個無序化區(qū)域，其中包含一個有 52 個氨基酸組成的長無序化區(qū)域， 氨基酸序列為 METYCIGGRNFITMAAFSTCPTWRRPRRKRLRRNVKMSSGRKSELRCVKESV。 為進一步分析蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，通過 Swiss-Model 對芹菜 AgLCYE 蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行同源建模，預測的芹菜 AgLCYE 蛋白三級結(jié)構(gòu)中有 9 個 螺旋和 18 個 折疊。 2.6 芹菜中葉黃素和 胡蘿卜素的含量測定 通過超高效液相色譜對不同生長時期（ 30、 45 和 60 d） 津南實芹葉中的葉黃素和 胡蘿卜素含量進行測定。從圖 4 可以看出，芹菜葉片和葉柄不同生長時期均沒有檢測到 胡蘿卜素的存在。葉黃素含量如圖 5 所示，芹菜葉片中葉黃素的含量均高于葉柄。芹菜葉片和葉柄中，葉黃素含量均在 45 d 時最低， 30 d 時最高，其中葉柄中 30 d 時葉黃素含量約是 45 d 和 60 d 的 2 倍。 圖 4 UPLC 測定不同生長階段芹菜葉中葉黃素和 胡蘿卜素含量 Fig. 4 Determination of lutein and -carotene of celery leaves in different growth stages by UPLC Li Jingwen， Ma Jing， Que Feng， Wang Feng， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and expression profiles analysis of carotenoid biosynthesis related gene AgLCYE from celery. 348 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 341 350. 圖 6 不同生長階段芹菜葉中 AgLCYE 的表達量分析 不同小寫字母表示差異顯著（ P < 0.05） 。 Fig. 6 Analysis of expression levels of AgLCYE in celery leaves in different growth stages Different letters indicate significant difference（ P < 0.05） . 圖 5 不同生長階段芹菜葉中葉黃素含量 不同小寫字母表示差異顯著（ P < 0.05） 。 Fig. 5 Lutein content of celery leaves in different growth stages Different letters indicate significant difference（ P < 0.05） . 2.7 芹菜 AgLCYE 的表達分析 如圖 6 所示， AgLCYE 在芹菜葉片中的相對表達量隨著生長期的增加逐漸升高，在 45 和 60 d時的相對表達量分別是 30 d 時的 1.5 倍和 1.6 倍。 AgLCYE 在芹菜葉柄中的相對表達量隨著生長期的增加逐漸降低。總體上看， AgLCYE 在芹菜葉片中的相對表達量高于葉柄。 3 討論 高等植物中編碼番茄紅素 環(huán)化酶的 LCYE 基因最先由 Cunningham 等（ 1996）在擬南芥中克隆出來，現(xiàn)已在多種植物中克隆得到，如萬壽菊（ Del et al.， 2005） 、玉米（李群睿， 2010）等，并進行了功能研究。 在 LCYE 基因被抑制的早實枳植株中， PDS 基因的表達量顯著增加， LCYB 和 ZEP基因的表達量下降， 胡蘿卜素的含量下降， 胡蘿卜素和紫黃質(zhì)含量增加，葉黃素含量沒有顯著變化（仝鑄， 2008） 。馬超等（ 2010）將 LCYE 基因構(gòu)建成 RNAi 載體并轉(zhuǎn)化煙草植株，獲得目的基因 mRNA 表達量減少和番茄紅素含量增加的轉(zhuǎn)基因植株。抑制 LCYE 基因的表達，馬鈴薯塊莖中 胡蘿卜素和總類胡蘿卜素的含量都顯著增加（ Diretto et al.， 2006） 。抑制油菜種子中的 LCYE 基因的表達，增加了油菜種子中的 胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和堇菜黃質(zhì)的含量（ Yu et al.， 2008） 。這些都證明 LCYE 基因在植物類胡蘿卜素生物合成途徑中起著重要的作用，并與不同類胡蘿卜素含量的相對比例密切相關(guān)，但具體作用機制還有待進一步研究。本試驗中從芹菜中克隆獲得番茄紅素 環(huán)化酶基因，并對其進行了分析，為進一步研究該基因在芹菜類胡蘿卜素生物合成中的功能和作用機制奠定了基礎。 本試驗中從芹菜中克隆得到的編碼番茄紅素 環(huán)化酶的 AgLCYE 序列含有一個 1 590 bp 的開放閱讀框，編碼 529 個氨基酸。芹菜番茄紅素 環(huán)化酶在進化上很保守，分別與菊科、茄科、十字花科依次接近，這與植物進化趨勢是一致的（ Soltis & Soltis， 2004） 。與豆科、葫蘆科進化關(guān)系較近，與錦葵科進化關(guān)系較遠，而在植物進化趨勢中傘形科植物與錦葵科植物的進化關(guān)系比豆科和葫蘆科植物更近（ Soltis & Soltis， 2004） 。此外，進化樹中可以看出同科植物的 LCYE 分布于同一分支，說明在進化中同科植物的 LCYE 蛋白有較近的親源關(guān)系。芹菜和其他物種中的 LCYE 氨基酸序列的同源性較高，和胡蘿卜中 LCYE 氨基酸序列的同源性高達 98.07%，這也和進化上的關(guān)系一致。 李靜文，馬 靜，卻 楓，王 楓，徐志勝，熊愛生 . 芹菜中類胡蘿卜素合成相關(guān)番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE 的克隆與表達分析 . 園藝學報， 2018， 45 (2)： 341 350. 349 Ma 等（ 2017）和 Liu 等（ 2017）分別對胡蘿卜和西瓜中類胡蘿卜素含量和相關(guān)基因表達水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜肉質(zhì)根和西瓜果實中，類胡蘿卜素的含量與相關(guān)基因的表達密切相關(guān)。通過對不同時期芹菜葉中葉黃素含量和 AgLCYE 相對表達量的測定，可知葉黃素含量和 AgLCYE 相對表達量都具有組織特異性，葉片中葉黃素的含量和 AgLCYE 相對表達量均高于葉柄。 AgLCYE 的相對表達量在芹菜葉片中隨著生長時期的增加逐漸升高，在葉柄中，隨生長期的增加逐漸降低。而葉黃素的含量在芹菜葉片和葉柄中 45 d 時含量最低。但葉黃素含量和 AgLCYE 相對表達量在 45 和 60 d 時無顯著性差異。此外，本試驗在芹菜葉片中沒有檢測到 胡蘿卜素的存在，由此推測芹菜葉中不含有 胡蘿卜素或者含量非常低，其中的具體調(diào)控機理還有待進一步研究。 References Arnold K， Bordoli L， Kopp J， Schwede T. 2006. 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