中國(guó)水仙R2R3-MYB基因NtMYB5的克隆和功能研究.pdf

<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (7)： 1327 1337. Acta Horticulturae Sinica &nbsp; doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0889； http： /www. ahs. ac. cn &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1327 收稿日期 ： 2018 03 20； 修回日期 ： 2018 06 15 基金項(xiàng)目 ： 福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（ KFA17352A） ；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 2016J01109） ；福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)際科技合作與交流項(xiàng)目（ Kxb16013A） &nbsp;* 通信作者 &nbsp;Author for correspondence（ E-mail： lhzenghotmail.com， lhzengfafu.edu.cn） &nbsp;中國(guó)水仙 R2R3-MYB 基因 NtMYB5 的克隆和功能研究 &nbsp;吳嘉誠(chéng)，王桂青，Muhammad Anwar，曾黎輝*（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 &nbsp;350002） &nbsp;摘 &nbsp;要： 為研究中國(guó)水仙（ Narcissus tazetta var. chinensis）中類黃酮代謝途徑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從其轉(zhuǎn)錄組中篩選出 1 條 R2R3-MYB 基因并從花瓣 cDNA 中克隆其編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，命名為 NtMYB5。 NtMYB5開放閱讀框?yàn)?681 bp，編碼 226 個(gè)氨基酸。蛋白多重序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn) NtMYB5 含有 R2 和 R3 結(jié)構(gòu)域以及 1 個(gè) pdLNLD/ELxiG/S氨基酸基序；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明， NtMYB5 與花青素合成抑制因子親緣關(guān)系最近；通過對(duì) NtMYB5 在中國(guó)水仙中的表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量在花器官中較高，且隨花開放逐漸上升；在煙草瞬時(shí)表達(dá)中， NtMYB5 顯著抑制花青素合成促進(jìn)因子 StMYB 的效果；轉(zhuǎn) NtMYB5 煙草花瓣顏色變淺， qPCR檢測(cè)表明 NtMYB5 抑制類黃酮代謝途徑大部分結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。 NtMYB5 為中國(guó)水仙中花青素合成抑制因子。 &nbsp;關(guān)鍵詞： 中國(guó)水仙； R2R3-MYB；花青素合成抑制因子；結(jié)構(gòu)基因表達(dá) &nbsp;中圖分類號(hào)： S 682.2+1 &nbsp; &nbsp; &nbsp; 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 07-1327-11 Cloning and Functional Analysis of R2R3-MYB Gene NtMYB5 in Narcissus tazetta var. chinensis WU Jiacheng， WANG Guiqing， Muhammad Anwar， and ZENG Lihui*（ College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China） &nbsp;Abstract： A R2R3-MYB-like gene， named NtMYB5， was selected from transcriptome of Narcissus tazetta var. chinensis and was cloned in order to study its function in flavonoid metabolic pathway. Multiple alignments showed that NtMYB5 contained R2-domain and R3-domain. A pdLNLD/ELxiG/Smotif was also found near the C-terminal. Phylogenetic tree analysis indicated that NtMYB5 was closely related to negative regulators of anthocyain biosynthesis. The expression level of NtMYB5 was higher in perianth and corona，and increased during the process of flowering. The accumulation of anthocyanin activated by StMYB was suppressed by NtMYB5 in the transient expression of tobacco. Transgenic tobacco plants were obtained and the flower colour of transgenic plants became lighter. The results of quantitative real-time PCR indicated that most structural genes involved in the anthocyanin pathway were down-regulated by NtMYB5. This study suggests that NtMYB5 is a repressor of anthocyanin biosynthesis in Chinese narcissus. Keywords： Narcissus tazetta var. chinensis； R2R3-MYB； repressor gene of anthocyain biosynthesis；expression of structural genes Wu Jiacheng， Wang Guiqing， Muhammad Anwar， Zeng Lihui. Cloning and functional analysis of R2R3-MYB gene NtMYB5 in Narcissus tazetta var. chinensis. 1328 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1327 1337. 中國(guó)水仙（ Narcissus tazetta var. chinensis）花色以黃白色為主，其原因主要是缺乏花青素 （曾黎輝 &nbsp;等， 2015） ?；ㄇ嗨貙俣喾宇惢衔铮?朱麗和 錢前 ， 2017） ，在自然狀態(tài)下的花青素具有吸光性并表現(xiàn)出紅色、紫色和藍(lán)色等?；ㄇ嗨卦谥参矬w內(nèi)主要以糖苷形式存在 （ Allan et al.， 2008） 。類黃酮合成代謝途徑有原花青素途徑、黃酮醇途徑和花青素途徑等分支；類黃酮普遍存在于植物當(dāng)中，具有抗氧化，抗菌等作用 （邢文和金曉玲， 2015） 。 &nbsp;MYB 基因在植物體內(nèi)廣泛地參與各種植物次生代謝調(diào)控，包括花青素代謝途徑。 MYB 轉(zhuǎn)錄因子是一類 DNA 結(jié)合蛋白，由高度保守的 MYB 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由一系列高度保守的氨基酸序列及間隔序列拼接而成。這些氨基酸可以使 MYB 蛋白折疊成螺旋 螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋（ helix-helix-turn-helix， HHTH） 結(jié)構(gòu) （ Zhao et al.， 2013） 。 MYB 與 WD40 以及 bHLH 組成三元復(fù)合體結(jié)合到花青素苷合成酶等結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子上，調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控花青素苷合成和積累，其中 R2R3 類 MYB 蛋白在這一調(diào)控模式中起著重要作用 （趙佳 &nbsp;等， 2015） 。目前已知的促進(jìn)花青素合成的 R2R3-MYB 因子有葡萄中的 VvMYB1（趙佳 &nbsp;等， 2015） ，蘋果中的 MdMYB10a（ Lu et al.， 2017a） ，草莓中的 FaMYB10（ Lin-Wang et al.， 2014） ，甜櫻桃中的 PaMYB10（ Jin et al.，2016） 以及擬南芥中的 AtMYB75、 AtMYB90、 AtMYB113 等 （史倩倩 &nbsp;等， 2015） 。 &nbsp;MYB 家族蛋白中還包含另一類抑制花青素合成的 R2R3-MYB 因子，其在蛋白 C末端存在pdLNLD/ELxiG/S抑制基序，如金魚草中的 AmMYB308（ Tamagnone et al.， 1998） 和最早被發(fā)現(xiàn)的R2R3-MYB 抑制子，草莓中的 FaMYB1（ Aharoni et al.， 2001） ，其通過競(jìng)爭(zhēng)占據(jù) MBW 復(fù)合體中其他 MYB 蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，以此抑制花青素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄 （ Paolocci et al.， 2011） 。除此之外還有棉花中的 GhMYBL2（ Lu et al.， 2017b） 以及擬南芥中的 AtMYB3、 AtMYB4、 AtMYB7、 AtMYB32等，它們可能通過與靶基因結(jié)合來抑制其轉(zhuǎn)錄 （楊琳 &nbsp;等， 2014） 。單子葉植物中花青素合成抑制因子的研究較少。 玉米中分離得到的 ZmMYB31 和 ZmMYB42 可抑制木質(zhì)素合成 （ Agarwal et al.， 2016） 。 &nbsp;本試驗(yàn)中從中國(guó)水仙中克隆 1 個(gè) R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子， 命名為 NtMYB5。 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn) NtMYB5具有明顯的 R2R3-MYB 結(jié)構(gòu)域， 進(jìn)化樹分析其功能可能為花青素合成抑制因子； 通過熒光定量 PCR檢測(cè) NtMYB5 在水仙中的表達(dá)以及利用煙草瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因的功能。 &nbsp;1 &nbsp;材料與方法 &nbsp;1.1 &nbsp;材料與基因的克隆、測(cè)序 &nbsp;試驗(yàn)于 2015 年 9 月至 2017 年 11 月在福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。 &nbsp;中國(guó)水仙品種為產(chǎn)自福建漳州的金盞銀臺(tái) 。選用新鮮剛開放的水仙花瓣作為材料，液氮研磨， 使用北京百泰克多糖多酚總 RNA 提取試劑盒提取水仙 RNA， 使用 Thermo 公司的 Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 合成 cDNA。 cDNA 稀釋后置于 20 保存?zhèn)溆谩?&nbsp;前期從水仙轉(zhuǎn)錄組中獲得 1 個(gè) MYB 基因，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)兩個(gè)編碼區(qū)兩端特異性引物（表 1，引物 1） ，由鉑尚生物公司合成。 &nbsp;以漳州水仙 cDNA 為模板，使用 Trans Taq DNA Polymerase High Fidelity 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。設(shè)置梯度 PCR 反應(yīng)程序，反應(yīng)條件為 94 預(yù)變性 5 min， 94 變性 1 min， 60 55 退火 30 s， 72 延伸 1 min，反應(yīng) 35 個(gè)循環(huán)， 72 延伸 7 min， 4 保存。 PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將目的條帶產(chǎn)物膠回收，用全式金 pEASY-T1 Simple Cloning Kit 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)涂板、挑菌、菌液 PCR 驗(yàn)證后，將條帶大小正確的樣品送往鉑尚生物公司進(jìn)行測(cè)序。 &nbsp;吳嘉誠(chéng)，王桂青， Muhammad Anwar，曾黎輝 . 中國(guó)水仙 R2R3-MYB 基因 NtMYB5 的克隆和功能研究 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (7)： 1327 1337. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1329 1.2 &nbsp;實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè) NtMYB5 在水仙不同部位表達(dá) &nbsp;分別提取水仙鱗莖盤、 鱗片、 葉片、 花苞時(shí)期、 始花期、 和盛花期花瓣與副冠的 RNA。 用 TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（ Perfect Real Time）逆轉(zhuǎn)錄，模板稀釋 10 倍。使用Primer5 設(shè)計(jì)定量引物，反應(yīng)體系參考 TaKaRa SYBR®Premix Ex TaqTM推薦體系。每個(gè)樣品重復(fù) 3次，每個(gè)熒光定量 PCR 結(jié)束時(shí)獲得相對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)值，采用 2-Ct法處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出不同樣品間該基因的表達(dá)差異。用 SPSS19.0 軟件 Duncans 法進(jìn)行定量結(jié)果的顯著性差異分析。 &nbsp;1.3 &nbsp;植物表達(dá)載體構(gòu)建 &nbsp;用 Hind 和 EcoR將載體上原有的目的條帶切下，獲得線性化載體。設(shè)計(jì)兩條用于連接的引物（表 1，引物 2） 。以 pEASY-T1 質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得目的條帶，使用 TaKaRa 公司的 In-Fusion HD Cloning kits 將 NtMYB5 編碼區(qū)序列連接到線性化的 pSAK277 載體上 。反應(yīng)體系為 1 L 5× In-Fusion HD Enzyme Premix、 1 L Linearized Vector、 0.5 L Purified PCR Fragment、 2.5 L dH2O， 50 孵育15 min。將構(gòu)建好的表達(dá)載體通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌 GV3101，培養(yǎng) 12 h 后挑取陽性克隆，菌液 PCR 驗(yàn)證條帶大小，同時(shí)提質(zhì)粒，用 Hind 和 EcoR雙酶切驗(yàn)證。載體構(gòu)建流程如圖 1。 &nbsp;圖 1 &nbsp;NtMYB5 表達(dá)載體構(gòu)建流程圖 Fig. 1 &nbsp;Construction flow chart of NtMYB5 expression vector Wu Jiacheng， Wang Guiqing， Muhammad Anwar， Zeng Lihui. Cloning and functional analysis of R2R3-MYB gene NtMYB5 in Narcissus tazetta var. chinensis. 1330 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1327 1337. 1.4 &nbsp;NtMYB5 煙草瞬時(shí)表達(dá)及定量分析 &nbsp;將普通煙草（ Nicotiana tabacum L.）種子播種于土中，待其生長(zhǎng)出 4 片真葉后用于瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)。將甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)劉玉匯博士贈(zèng)送的 pSAK277-StMYB（ StMYB 為從馬鈴薯中克隆得到的花青素合成激活因子） 、 pSAK277-StbHLH 表達(dá)載體 （ Liu et al.， 2016）以及對(duì)照質(zhì)粒 pCAMBIA1301（含有GUS 基因）轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101 中分別培養(yǎng)。挑取農(nóng)桿菌菌落于 YEB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng) pSAK277- NtMYB5、 pSAK277-StMYB、 pSAK277-StbHLH 的培養(yǎng)基添加利福平 100 mg · L-1和鹽酸壯觀霉素 100 mg · L-1， 搖菌至 OD600值為 0.8 1.0。 將菌液分裝于 50 mL 離心管中， 并以 4 000 r · min-1離心 5 min。用懸浮緩沖液（ 10 mmol · L-1MES， 150 mol · L-1AS， 10 mmol · L-1MgCl2）重懸，靜置 3 h。用注射器將單個(gè)基因（ StMYB、 NtMYB5）懸浮液或幾個(gè)基因組合 NtMYB5 + StMYB、 NtMYB5 + StMYB + StbHLH、 StMYB + pCAMBIA1301 按 1 1 混合注射煙草葉片。重復(fù) 3 次。 &nbsp;分別提取煙草葉片注射 StMYB 和 NtMYB5 + StMYB 部位的 RNA， 以沒有注射的葉片部位的 RNA為對(duì)照，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后，通過實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)類黃酮代謝途徑中 PA L （ phenylalanine ammonia-lyase） 、 4CL（ 4-coumarate:CoA lig-ase） 、 CHS（ chalcone synthase） 、 CHI（ chalcone isomerase） 、F3H（ flavonoid 3-hydrox-ylase） 、 F3&#39;H（ flavonoid 3-hydroxylase） 、 ANS（ anthocyanidin sythase） 、 ANR（ anthocyanidin reductase） 、 UFGT（ Glucose-flavonoid 3-o-glucosyltransferase） 、 LAR（ Leucoantho- cyanidin reductase） 、 DFR（ dihydroflavonol 4-reductase） 、 FLS（ flavonol synthase）等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)情況。各結(jié)構(gòu)基因定量 PCR 引物見表 1。 &nbsp;表 1 &nbsp;煙草熒光定量 PCR 所用引物 &nbsp;Table 1 &nbsp;Primers used for qPCR 名稱 &nbsp;Name 上游引物序列（ 5 3） &nbsp;Forward primer sequence 下游引物序列（ 5 3） &nbsp;Reverse primer sequence 退火溫度 /Annealing1 ATGGGCAGAACTCCTTGTTG CACTATCTAATTACATGTGGATTGG 55 2 TGGATCCAAAGAATTCATGGGCAGAACTCCTTGTTG TACTCTCGAGAAGCTTCACTATCTAATTACATGTGGATTGG 55 3 AGAAGACGGATTCGGTAGAAGATG TGGAGAAGAAGAACAAGGAAGACC 60 DFR AACCAACAGTCAGGGGAATG TTGGGCATCGAGAGTTCCAG 58 ANS TGGCGTTGAAGCTCATACTG GGAATTAGGCACACACTTTGC 59 4CL TCATTGACGAGGATGACGAG TGGGATGGTTGAGAAGAAGG 60 CHI GAAATCCTCCGATCCAGTGA CAACGTTGACAACATCAGGC 58 F3H ACAGGGTGAAGTGGTCCAAG CCTTGGTTAAGGCCTCCTTC 58 F3H TCCAAGAATACTGGCCCAAG CTCACAACTCTCGGATGCAA 58 FLS GTCCACAACGTTGCATGGTG CACAACTTCTCGCAGCCTC 59 LAR TCAAGGTCCTTTACGCCATC ACGAACCTGCTTCTCTTTGG 59 ANR CATTTGACTTTCCCAAACGC ATTGGGCTTTTGAGTTGTGC 60 ACTIN AATGATCGGAATGGAAGCTG TGGTACCACCACTGAGGACA 58 CHS GTACAACTAGTGGTGTAGACA CCAACTTCACGAAGGTGAC 58 PAL CAAGAACGGTGGTGCTCTTC CCAGAACCAACTGCAGTACC 58 UFGT CAATGTTTGGGATGGTGTCA TTCCTCCTCTGCCTCTTTCA 58 1.5 &nbsp;NtMYB5 煙草穩(wěn)定轉(zhuǎn)化及定量分析 &nbsp;在無菌操作臺(tái)內(nèi)，將生長(zhǎng) 50 d 的普通煙草組培苗切成 2 cm × 2 cm 大小的切片，置于預(yù)培養(yǎng)基（固體 MS 培養(yǎng)基） 3 d； 將 OD600值為 0.5 已轉(zhuǎn)化 NtMYB5 的農(nóng)桿菌菌液用于侵染煙草葉切片 8 min，后放回預(yù)培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng) 3 d。用 300 mg · L-1羧芐青霉素的無菌水清洗煙草切片，置于選擇培養(yǎng)基 （固體 MS 培養(yǎng)基， 100 mg · L-1卡那霉素， 300 mg · L-1羧芐青霉素， 1 mg · L-16-BA， 0.1 mg · L-1NAA） 。將選擇培養(yǎng)基中長(zhǎng)至 2 cm 左右的小芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中（固體 MS 培養(yǎng)基加 0.5 mg · L-1NAA） ；煙草苗高度達(dá)到組培瓶蓋時(shí)進(jìn)行煉苗后移入盆中。 &nbsp;待煙草開花后，觀察煙草花的花色變化，提取煙草花瓣 RNA，進(jìn)行定量分析。 &nbsp;吳嘉誠(chéng)，王桂青， Muhammad Anwar，曾黎輝 . 中國(guó)水仙 R2R3-MYB 基因 NtMYB5 的克隆和功能研究 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (7)： 1327 1337. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1331 2 &nbsp;結(jié)果與分析 &nbsp;2.1 &nbsp;NtMYB5 基因克隆與序列分析 &nbsp;克隆出的 NtMYB5 基因 ORF 全長(zhǎng)為 681 bp，編碼 226 個(gè)氨基酸。通過 NCBI 上的保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)該條序列存在明顯的 R2 和 R3 結(jié)構(gòu)域，屬于 R2R3-MYB 基因，同時(shí) NtMYB5 還存在pdLNLD/ELxiG/S抑制基序（圖 2） 。 &nbsp;圖 2 &nbsp;NtMYB5 與同源蛋白的多重序列比對(duì) At：擬南芥； Am：金魚草； Ph：矮牽牛； Vv：葡萄； Fa：草莓。 &nbsp;Fig. 2 &nbsp;Multiple alignment of the NtMYB5 with other MYB proteins At： Arabidopsis thaliana； Am： Antirrhinum majus； Ph： Petunia hybrida； Vv： Vitis vinifera； Fa： Fragaria × ananassa. 通過與其它 MYB 因子構(gòu)建進(jìn)化樹分析， 花青素合成激活因子 （ anthocyanin activator） 聚為一類；花青素合成抑制因子分成 3 類，其中 CPC/TRY-like 抑制因子與其它基因關(guān)系較遠(yuǎn)，另外兩類為MYB4-like 和 FaMYB1-like。 NtMYB5 與 VvMYB4 等花青素合成抑制因子聚在一起，屬于抑制因子中MYB4-like 分支（圖 3） 。 &nbsp;Wu Jiacheng， Wang Guiqing， Muhammad Anwar， Zeng Lihui. Cloning and functional analysis of R2R3-MYB gene NtMYB5 in Narcissus tazetta var. chinensis. 1332 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1327 1337. 圖 3 &nbsp;NtMYB5 與調(diào)控花青素 MYB 因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 &nbsp;Fig. 3 &nbsp;Phylogenetic tree of NtMYB5 and other anthocyanin related MYB transcrpit factors 2.2 &nbsp;NtMYB5 組織特異性表達(dá) &nbsp;如圖 4 所示， NtMYB5 在水仙葉片、鱗莖盤和鱗片中表達(dá)量都較低，在花瓣和副冠中表達(dá)量較高。 &nbsp;圖 4 &nbsp;NtMYB5 在水仙中的表達(dá) &nbsp;1：花苞期； 2：始花期； 3：盛花期。不同小寫字母表示差異顯著（ P &lt; 0.05）。 &nbsp;Fig. 4 &nbsp;Expression analysis of NtMYB5 gene in Chinese narcissus 1： Budding stage； 2： Early flowering stage； 3： Full-bloom stage. &nbsp;Different small letters indicate significant difference（ P &lt; 0.05） . 吳嘉誠(chéng)，王桂青， Muhammad Anwar，曾黎輝 . 中國(guó)水仙 R2R3-MYB 基因 NtMYB5 的克隆和功能研究 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (7)： 1327 1337. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1333 在花瓣中，隨著花的開放， NtMYB5 表達(dá)量呈明顯上升趨勢(shì)，在盛花期的表達(dá)量是花苞期的近 25 倍；在副冠中 NtMYB5 的表達(dá)量從花苞期開始就維持一個(gè)較高水平，在始花期有所下降，盛花期又開始升高。 &nbsp;2.3 &nbsp;NtMYB5 煙草瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果 &nbsp;如圖 5 所示，煙草葉片單獨(dú)注射花青素激活因子 StMYB 的部位 5 d 后明顯呈現(xiàn)深紅色，單獨(dú)注射 NtMYB5 部位無反應(yīng)，呈現(xiàn)綠色； NtMYB + StMYB 混合注射部位呈現(xiàn)淺紅色；注射 NtMYB5 + StMYB + StbHLH 的 3 個(gè)基因的混合物的部分呈現(xiàn)紅色；對(duì)照帶有 GUS 基因的 pCAMBIA1301 + StMYB 混合注射沒有抑制 StMYB 的作用，與單獨(dú)注射 StMYB 的差別不大； 注射懸浮緩沖液部位無反應(yīng)，呈現(xiàn)綠色 。 &nbsp;上述結(jié)果說明 NtMYB5 對(duì)花青素合成有抑制作用。 &nbsp;圖 5 &nbsp;NtMYB5 煙草瞬時(shí)表達(dá) Fig. 5 &nbsp;Transient expression analysis of NtMYB5 in tobacco 2.4 &nbsp;煙草瞬時(shí)表達(dá)的定量檢測(cè) &nbsp;如圖 6 所示，煙草中類黃酮生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因 PA L、 4CL、 CHS、 CHI、 F3H、 F3H、DFR、 LAR、 ANS、 ANR 和 UFGT 的表達(dá)量，與野生型（ Wild type）相比，可見都被 StMYB 誘導(dǎo)顯著上調(diào)，而 FLS 的表達(dá)量下調(diào)；在 StMYB + NtMYB5 混合注射的葉片中， PA L、 CHS、 CHI、 F3H、F3H、 ANS、 UFGT 的表達(dá)量相比于單獨(dú)注射 StMYB 出現(xiàn)顯著下降，而 FLS 上升， ANR 和 4CL 變化不明顯。 &nbsp;NtMYB5 對(duì)大部分類黃酮代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)有明顯的抑制作用。 &nbsp;Wu Jiacheng， Wang Guiqing， Muhammad Anwar， Zeng Lihui. Cloning and functional analysis of R2R3-MYB gene NtMYB5 in Narcissus tazetta var. chinensis. 1334 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1327 1337. 圖 6 &nbsp;煙草葉片中類黃酮代謝途徑結(jié)構(gòu)基因瞬時(shí)表達(dá)的定量檢測(cè) &nbsp;不同小寫字母表示差異顯著（ P &lt; 0.05）。 &nbsp;Fig. 6 &nbsp;Transient expression of flavonoid metabolic pathway structural genes in tabacco leaf Different small letters indicate significant difference（ P &lt; 0.05） . 2.5 &nbsp;NtMYB5 轉(zhuǎn)基因煙草表型及基因表達(dá)定量分析 &nbsp;將帶有 35S 啟動(dòng)子的 pSAK277-NtMYB5 轉(zhuǎn)化煙草， 經(jīng) PCR 檢測(cè)后獲得 9 株轉(zhuǎn)基因植株。 NtMYB5轉(zhuǎn)基因煙草的花色比對(duì)照煙草變淺（圖 7） 。 &nbsp;圖 7 &nbsp;NtMYB5 轉(zhuǎn)基因（ L1、 L2、 L3）與野生型（ WT）煙草花瓣顏色的變化 Fig. 7 &nbsp;Changes in the color of NtMYB5 transgenic（ L1， L2， L3） and wild type（ WT） tobacco petals 吳嘉誠(chéng)，王桂青， Muhammad Anwar，曾黎輝 . 中國(guó)水仙 R2R3-MYB 基因 NtMYB5 的克隆和功能研究 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (7)： 1327 1337. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1335 通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草花瓣中類黃酮途徑結(jié)構(gòu)基因 PA L、 4CL、 CHS、 CHI、FLS、 DFR、 LAR、 ANS、 ANR、 UFGT 被顯著下調(diào)； F3H、 F3H 的表達(dá)量變化不顯著（圖 8） 。 &nbsp;圖 8 &nbsp;NtMYB5 轉(zhuǎn)基因煙草花瓣中類黃酮代謝途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá) &nbsp;不同小寫字母表示差異顯著（ P &lt; 0.05）。 &nbsp;Fig. 8 &nbsp;Expression analysis of flavonoid biosynthesis structural genes in petals of transgenic tobacco plants Different small letters indicate significant difference（ P &lt; 0.05） . 3 &nbsp;討論 &nbsp;依據(jù) C末端的不同，擬南芥 MYB 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分類可將其分成 22 個(gè)亞群 （ Stracke et al.， 2001） 。 NtMYB5 同擬南芥的第 4 家族中的 AtMYB3、 AtMYB4、 AtMYB7、 AtMYB32 有較高的親緣性 （ Jin et al.， 2000） ，屬于 MYB4-like 類的 R2R3-MYB 基因。這類 MYB 基因?yàn)榛ㄇ嗨睾铣梢种埔蜃樱谄涞鞍?C末端都有 1 個(gè)抑制區(qū)域 pdLNLD/ELxiG/S，該蛋白可能通過直接與靶基因結(jié)合而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄（ 楊琳 &nbsp;等， 2014） 。從序列分析中可以看到 NtMYB5 的 C末端也有抑制區(qū)域，表明 NtMYB5 的功能可能與 MYB4-like 因子類似。 &nbsp;NtMYB5 在水仙中的表達(dá)分析表明，其主要在花瓣與副冠中表達(dá)，可能與花瓣及副冠中的花青素等類黃酮代謝有關(guān)。 NtMYB5 表達(dá)水平在水仙花器官不同發(fā)育階段呈現(xiàn)明顯的變化，隨著花開放，NtMYB5 的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。有報(bào)道，水仙中的 CHS、 CHI 和 F3H 在開花的 3 個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，在花苞期表達(dá)最高，且隨著花開放表達(dá)量下降 （楊琳 &nbsp;等， 2014） 。 NtMYB5 表達(dá)量在未開放的水仙花瓣中表達(dá)量最低，隨著花開放，表達(dá)量上升，可能與 NtCHS、 NtCHI 和 NtF3H 的表達(dá)量降低有關(guān)。 &nbsp;Wu Jiacheng， Wang Guiqing， Muhammad Anwar， Zeng Lihui. Cloning and functional analysis of R2R3-MYB gene NtMYB5 in Narcissus tazetta var. chinensis. 1336 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1327 1337. 瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)是一種獲得目的基因短暫高水平表達(dá)的技術(shù)，比穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)周期短，但因未將外源基因整合到宿主植物染色體中，不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代 （趙文婷 &nbsp;等， 2013） 。通過瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)可以直觀地看到花青素激活因子 StMYB 誘導(dǎo)煙草葉片生成的花青素被 NtMYB5 抑制。 qPCR 結(jié)果進(jìn)一步證明 NtMYB5 抑制 StMYB 的機(jī)制是通過抑制 PA L、 CHS、 CHI、 F3H、 F3H、 DFR、 LAR、 ANS和 UFGT 等花青素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。 FLS 是黃酮醇分支的結(jié)構(gòu)基因， 表達(dá)被 StMYB 抑制， NtMYB5加入后， FLS 表達(dá)量有所上調(diào)。 Davies 等 （ 2003） 通過反義 RNA 技術(shù)抑制 FLS 基因表達(dá)，導(dǎo)致矮牽牛花中花青素合成量上調(diào)；類黃酮代謝途徑 FLS 和 DFR 有著相同的催化反應(yīng)底物，因此二者存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系 （ Lepiniec et al.， 2006） 。由此推測(cè)可能是 NtMYB5 對(duì)花青素合成相關(guān)基因表達(dá)的抑制一定程度上減少了對(duì)黃酮醇合成的競(jìng)爭(zhēng)，從而上調(diào)了 FLS 的表達(dá)量。 &nbsp;R2R3-MYB、 bHLH 和 WD40 蛋白是參與調(diào)節(jié)花青素合成的主要轉(zhuǎn)錄因子，大多數(shù)的植物花青素的合成是通過 MYB-bHLH 復(fù)合物或三者相互作用形成 MYB-bHLH-WD40 復(fù)合物 （即 MBW 復(fù)合物）進(jìn)行調(diào)節(jié)的 （ Gonzalez et al.， 2008） 。在 NtMYB5 + StMYB 混合液中添加 StbHLH，再注射煙草葉片并沒有明顯減少 NtMYB5 的抑制作用，說明 NtMYB5 抑制花青素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)不是因?yàn)榕c StMYB 爭(zhēng)奪 bHLH 因子，而是可能直接與靶基因結(jié)合進(jìn)行抑制，與 AtMYB4 類因子的作用機(jī)制相似。 &nbsp;NtMYB5 轉(zhuǎn)基因煙草花瓣顏色變淺，進(jìn)一步驗(yàn)證了 NtMYB5 抑制花青素合成的功能。類黃酮代謝途徑結(jié)構(gòu)基因的定量分析結(jié)果顯示， NtMYB5 抑制了 PA L、 CHS、 CHI、 DFR、 UFGT 和 ANS 這 6個(gè)基因的表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因煙草花瓣中花青素積累被抑制。與瞬時(shí)表達(dá)有所不同的是，煙草花瓣中FLS 和 ANR 基因的表達(dá)也受到抑制，說明 NtMYB5 有可能在花中同時(shí)抑制了黃酮醇和原花青素的積累，這個(gè)推論還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。 &nbsp;References Agarwal T， Grotewold E， Doseff A I， Gray J. 2016. MYB31/MYB42 syntelogs exhibit divergent regulation of phenylpropanoid genes in maize，sorghum and rice. Scientific Reports， 6： 28502. &nbsp;Aharoni A， de Vos C H， Wein M， Sun Z， Greco R， Kroon A， Mol J N， O&#39;Connell A P. 2001. The strawberry FaMYB1 transcription factor suppresses anthocyanin and flavonol accumulation in transgenic tobacco. The Plant Journal： for Cell and Molecular Biology， 28 (3)： 319 332. Allan A C， Hellens R P， Laing W A. 2008. MYB transcription factors that colour our fruit. Trends in Plant Science， 13 (3)： 99 102. Davies K M， Schwinn K E， Deroles S C， Manson D G， Lewis D H， Bloor S J， Bradley J M. 2003. Enhancing anthocyanin production by altering competition for substrate between flavonol synthase and dihydroflavonol 4-reductase. Euphytica， 131 (3)： 259 268. Gonzalez A， Zhao M， Leavitt J M， Lloyd A M. 2008.</p>