桃ABA8''-羥化酶基因PpeCYP707As在擬南芥中過表達(dá)的功能分析.pdf

<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (2)： 239 249. Acta Horticulturae Sinica &nbsp; doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0350； http： /www. ahs. ac. cn &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 239 收稿日期 ： 2017 08 02； 修回日期 ： 2018 01 22 基金項(xiàng)目 ： 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 31372050） ；山東農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)設(shè)施園藝優(yōu)勢(shì)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（ SYL2017YSTD07） &nbsp;* 通信作者 &nbsp;Author for correspondence（ E-mail： luckypipi163.com； gaodongsheng01163.com； Tel： 0538-8249659） &nbsp;桃 ABA 8羥化酶基因 PpeCYP707As在擬南芥中過表達(dá)的功能分析 &nbsp;高真真，徐功勛，王東嶺，劉 &nbsp;利，陳修德，李 &nbsp;玲，付喜玲*，高東升*（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 &nbsp;271018） &nbsp;摘 &nbsp;要： 以 8 年生中油 4 號(hào)油桃為試材，對(duì)休眠期的枝條進(jìn)行 ABA 和 GA 處理發(fā)現(xiàn)， ABA 延遲芽體萌動(dòng)， GA 促進(jìn)萌芽和提前開花，在桃芽萌發(fā)中 ABA 和 GA 起拮抗作用。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在擬南芥中過表達(dá)桃 ABA 分解代謝關(guān)鍵酶 ABA 8羥化酶基因 PpeCYP707A1、 PpeCYP707A2 和 PpeCYP707A3，獲得純合株系， RT-PCR 結(jié)果表明，目的基因在過表達(dá)株系中的表達(dá)量分別達(dá)到對(duì)照的 23.86 倍、 7.37 倍、3.23 倍；過表達(dá)株系生長緩慢，抽薹、開花延遲，其中過表達(dá) PPECYP707A1 株系生長最慢，開花最晚；過表達(dá)株系種子萌發(fā)和幼苗生長對(duì) ABA 不敏感，受傷害程度??； 10 低溫處理試驗(yàn)證明，過表達(dá)株系相對(duì)生長速率高于野生型，推測低溫條件下，過表達(dá) CYP707As 正調(diào)控?cái)M南芥的生長發(fā)育。 &nbsp;關(guān)鍵詞： 桃；擬南芥； CYP707A； ABA；過表達(dá)；功能分析 &nbsp;中圖分類號(hào)： S 662.1 &nbsp; &nbsp; &nbsp; 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 02-0239-11 Functional Analysis of Peach PpeCYP707As Gene in Arabidopsis thaliana Overexpressing Plants GAO Zhenzhen， XU Gongxun， WANG Dongling， LIU Li， CHEN Xiude， LI Ling， FU Xiling*， and GAO Dongsheng*（ College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University， State Key Laboratory of Crop Biology， Taian， Shandong 271018， China） &nbsp;Abstract： We used eight-year-old Zhongyoutao 4 nectarine as the material and then treated dormant peach branches with hormone. The results showed that ABA delayed bud germination， GA promoted germination and precocious flowering， ABA and GA had the adverse effect on the germination of peach buds. We obtained at least 3 homozygous lines with overexpression of ABA 8-hydroxylase gene which were key enzyme in ABA catabolism in peach such as PpeCYP707A1， PpeCYP707A2， PpeCYP707A3 in Arabidopsis thaliana by transgenic technique. The results of RT-PCR showed that the expression of target gene in overexpression lines reached 23.86 times， 7.37 times and 3.23 times， respectively. The Arabidopsis of overexpression lines showed slow growth， delayed bolting even flowering， which PPECYP707A1 slowest growth and flowering the latest. Relative conductivity and active oxygen analysis showed that seed germination and seedling growth of transgenic Arabidopsis were not sensitive to ABA and the damage Gao Zhenzhen， Xu Gongxun， Wang Dongling， Liu Li， Chen Xiude， Li Ling， Fu Xiling， Gao Dongsheng. Functional analysis of peach PpeCYP707As gene in Arabidopsis thaliana overexpressing plants. 240 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 239 249. degree was lower compared to wild type. Low temperature（ 10 ） treatment results showed that the relative growth rate of transgenic Arabidopsis with overexpressing PpeCYP707As was higher than that of wild type. It is speculated that the overexpression of CYP707As gene may positively regulate the growth and development of Arabidopsis under low temperature condition. Keywords： peach； Arabidopsis thaliana； CYP707A； ABA； overexpression； functional analysis 休眠是果樹在應(yīng)對(duì)外界不良環(huán)境時(shí)產(chǎn)生的一種自我保護(hù)機(jī)制，表現(xiàn)為分生組織可見的暫時(shí)停長（ Rohde &amp; Bhalerao， 2007） 。自然休眠由休眠結(jié)構(gòu)（比如芽、種子）內(nèi)部的生理因素控制，只有經(jīng)歷低溫滿足其需冷量之后芽才能萌發(fā)，進(jìn)而開花結(jié)果，所以自然休眠是設(shè)施果樹熟期調(diào)控的限制因子，研究調(diào)控休眠維持及休眠解除的因素及其分子機(jī)制意義重大。 &nbsp;影響自然休眠的環(huán)境因素主要有光周期、低溫和激素等。脫落酸（ ABA）是植物重要的逆境激素，一方面參與植物對(duì)低溫、干旱、高鹽等脅迫的應(yīng)答（ Leng et al.， 2014） ，同時(shí)參與調(diào)控葉片脫落、胚胎發(fā)育、種子的休眠與萌發(fā)等過程（ Lechat et al.， 2012） 。近年來的研究證明， ABA 在休眠（芽休眠和種子休眠） 及休眠解除中發(fā)揮重要作用， ABA 能夠誘導(dǎo)芽休眠并抑制萌發(fā)。 在油桃 （ Wang et al.， 2016）花芽休眠誘導(dǎo)期 ABA 含量逐漸升高，隨著休眠解除 ABA 含量逐漸降低。楊樹（ Rohde et al.， 2002）頂芽休眠解除過程中 ABA 含量也逐漸降低。也有證據(jù)表明赤霉素（ GA）可以解除種子休眠促進(jìn)萌發(fā)（ Huang et al.， 2016） ，并在櫻桃（ Duan et al.， 2004）芽休眠解除上得到證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)在唐菖蒲球莖（ Wu et al.， 2015）休眠解除過程中 ABA 含量逐漸降低， GA 含量逐漸升高，ABA/GA 逐漸降低。 &nbsp;ABA 合成、分解的動(dòng)態(tài)變化共同調(diào)控植物內(nèi)源 ABA 水平，在芽休眠進(jìn)程中 ABA 含量的變化反映了 ABA 合成與分解的關(guān)系，在芽解除休眠的過程中 ABA 的分解代謝起主導(dǎo)作用（ Zheng et al.，2015） 。在不同物種中， ABA 分解的主要途徑是轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的紅花菜豆酸（ Phaseic acid， PA）和二氫紅花菜豆酸（ Dihydro-phaseic acid， DPA） ，這一過程是解除休眠的關(guān)鍵（ Saito et al.， 2004） 。研究證實(shí) ABA 8羥化酶催化 ABA 轉(zhuǎn)變?yōu)?PA（ Nambara &amp; Marion-Poll， 2005） ，而 AtCYP707A 是擬南芥 ABA 8羥化酶的編碼基因。生化分析表明，在體外 CYP707A 蛋白能將 ABA 轉(zhuǎn)化成 PA（ Nambara &amp; Marion-Poll， 2005） 。擬南芥 AtCYP707A 家族基因有 4 個(gè)成員，其中 AtCYP707A2 被認(rèn)為是在種子吸脹時(shí)分解 ABA 的關(guān)鍵基因，在吸脹 6 h 后該基因轉(zhuǎn)錄水平開始增加， ABA 含量降低，相應(yīng)地 PA 含量升高（ Tetsuo et al.， 2004） 。這一結(jié)論在大麥（ Millar et al.， 2006）中得到驗(yàn)證。在擬南芥 AtCYP707A2 突變體中，其發(fā)芽率（ 10%）明顯低于野生型（ 70%） ， ABA 含量高達(dá)野生型的6 倍，種子若不經(jīng)低溫處理，需要更長的時(shí)間來打破休眠（ Millar et al.， 2006） 。 &nbsp;目前已在水稻 （ Seung &amp; Dongsu， 2006） 、 蠶豆 （ Yang &amp; Zeevaart， 2006） 、 馬鈴薯 （ Destefanobeltrán et al.， 2006） 、大麥（ Millar et al.， 2006）中克隆到 CYP707A 的同源基因。對(duì)于 CYP707A 的研究主要在逆境脅迫、植物脫水、再水合作用、種子休眠上（ Benech-Arnold et al.， 2013） 。但 CYP707A 參與花芽休眠調(diào)控的設(shè)想還未得到證實(shí)。在桃中，利用 SSH 技術(shù)篩選的調(diào)控芽休眠的基因也參與種子休眠，揭示芽休眠與種子休眠可能存在共同的調(diào)控機(jī)制（ Leida et al.， 2012） 。 CYP707A 在休眠中的作用機(jī)制尚不明確。 &nbsp;本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)桃 CYP707As 基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、組織特異性表達(dá)、激素誘導(dǎo)、原核表達(dá)誘導(dǎo)蛋白等一系列研究，發(fā)現(xiàn)桃 CYP707A2 與擬南芥 CYP707A2 親緣關(guān)系最近， CYP707As 基因在成熟組織中表達(dá)量比幼嫩組織高，且 CYP707A2 能被 ABA、 GA 誘導(dǎo)上調(diào)（ Wang et al.， 2016） 。高真真，徐功勛，王東嶺，劉 &nbsp; 利，陳修德，李 &nbsp; 玲，付喜玲，高東升 . 桃 ABA 8羥化酶基因 PpeCYP707As 在擬南芥中過表達(dá)的功能分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (2)： 239 249. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 241 本研究中以 ABA 介導(dǎo)芽休眠與種子休眠為切入點(diǎn)，從桃中克隆了 3 個(gè) CYP707As 基因，轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行表達(dá)分析及表型鑒定， 并研究 ABA 對(duì)種子和幼苗、 低溫對(duì)幼苗等的影響， 旨在揭示桃 CYP707A家族基因在休眠中與 ABA 的關(guān)系，為進(jìn)一步研究其在休眠解除中的作用奠定基礎(chǔ)。 &nbsp;1 &nbsp;材料與方法 &nbsp;1.1 &nbsp;桃樹材料及處理 試驗(yàn)材料為栽種于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)試驗(yàn)基地的 8 年生油桃（ Prunus persica var. nectariana）中油 4 號(hào)生長健壯、長勢(shì)一致的 9 株樹，選取生長良好的一年生枝條 90 個(gè)，分為 3 組，即 3個(gè)處理，每個(gè)處理 30 枝，分為 3 個(gè)重復(fù)， 1 個(gè)重復(fù) 10 枝。分別用 3 種處理溶液噴施枝條表面： （ 1）對(duì)照，清水 &nbsp;+ 0.5% Trtion 100； （ 2） ABA 處理， 1 mmol · L-1 ABA + 0.5% Trtion 100； （ 3） GA 處理，1 mmol · L-1GA3 + 0.5% Trtion 100。于 2016 年 12 月 10 日起每 7 d 噴 1 次，共 3 次。選擇傍晚進(jìn)行，噴施后套黑色塑料袋。 ABA、 GA 購自索萊寶公司。 &nbsp;擬南芥幼苗在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，晝 22 /夜 20 ，光照 12 h。 &nbsp;ABA 處理擬南芥種子和幼苗：將擬南芥種子消毒后種在分別含有 3 和 5 mol · L-1ABA 的 MS培養(yǎng)基上，觀察種子的萌發(fā)情況。選取生長 14 d 的擬南芥幼苗用 1 mmol · L-1 ABA + 0.5% Trtion 100溶液噴施灌溉，用黑色塑料袋罩住防止 ABA 見光分解，處理 3 d 后，選取野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片，稱取 3 份，每份 1 g，用于相對(duì)電導(dǎo)率測定，選取野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片各 10 片，用于活性氧分子測定。 &nbsp;低溫處理擬南芥幼苗： 選取生長 28 d 的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥后代幼苗， 在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為 10 （模擬進(jìn)入休眠誘導(dǎo)的秋季溫度）處理 10 d，用于相對(duì)生長速率測定。 &nbsp; 1.2 &nbsp;PpeCYP707As 轉(zhuǎn)化擬南芥 &nbsp; &nbsp;轉(zhuǎn)基因所用材料為本實(shí)驗(yàn)室保存的哥倫比亞野生型（ Columbia 型）擬南芥種子。利用 Thermo公司的 Phusion 高保真酶對(duì) PpeCYP707A1、 PpeCYP707A2 和 PpeCYP707A3 這 3 個(gè)基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增（引物見表 1） 。利用 TaKaRa 公司的 PMD-19simple 載體進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 感受態(tài)細(xì)胞。 選擇測序正確的克隆， 提取細(xì)菌中的質(zhì)粒 DNA， 根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn) （ PpeCYP707A1：BamH和 Sal； PpeCYP707A2： Xba和 Sac； PpeCYP707A3： BamH和 Sac）分別雙酶切pMD19-simple 及 PBI121 載體序列。分離酶切片段，回收目的基因和載體，利用 T4連接酶連接目的基因與 PBI121 載體， 成功構(gòu)建 PBI121-PpeCYP707A1、 PBI121-PpeCYP707A2、 PBI121-PpeCYP707A3 表達(dá)載體。 &nbsp;將分別含有 3 個(gè)基因正義表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液用花序侵染法侵染野生型擬南芥，將收獲的種子用 &nbsp;50 mg · L-1的卡那霉素（ Kan）進(jìn)行篩選。選擇那些能夠正常生長且沒有黃化的幼苗，利用 PCR及 RT-PCR 檢測篩選陽性植株。并選擇在擬南芥中目的基因表達(dá)量高的植株作為候選植株 T1 代， T2代種子開始出現(xiàn)分離。選擇 T3 代不出現(xiàn)分離的種子即為純合株系，依次命名為 35S： PPECYP707A1、35S： PPECYP707A2、 35S： PPECYP707A3。最終獲得至少 &nbsp;3 株純合株系，并觀察表型，記錄結(jié)果。 &nbsp;1.3 &nbsp;總 RNA 的提取和 RT-PCR 將擬南芥種子消毒后播種在 MS 培養(yǎng)基上，選取生長 14 d 的擬南芥幼苗，整株取樣后立即放入Gao Zhenzhen， Xu Gongxun， Wang Dongling， Liu Li， Chen Xiude， Li Ling， Fu Xiling， Gao Dongsheng. Functional analysis of peach PpeCYP707As gene in Arabidopsis thaliana overexpressing plants. 242 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 239 249. 液氮冷凍，用于 RT-PCR 檢測。擬南芥幼苗整株取樣，稱取 3 g，分為 3 份，每份 1 g 作為 1 次生物學(xué)重復(fù)。液氮研磨后采用 TIANGEN（天根）試劑盒提取總 RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（ Perfect Real Time， TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，采用軟件DNAMAN 設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物（表 1） ，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用 SYBR®Premix Ex TaqTM（ Tli RNaseH Pls）試劑盒（寶生物）進(jìn)行熒光定量 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為： SYBR®Premix Ex Taq（ 2×） 12.5 L，正 、反 向 引 物 各 1 L， cDNA 1 L，加去離子水至 25 L。試驗(yàn)設(shè)計(jì) 3 次技術(shù)性重復(fù)。熒光定量 PCR 反應(yīng)條件為： 95 預(yù)變性 30 s， 95 變性 5 s， 60 退火30 s， 35 40 次循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后得到熒光值變化曲線和熔解曲線，最終采用 2-Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 &nbsp; 表 1 &nbsp;克隆基因和 RT-PCR 所用引物 &nbsp;Table 1 &nbsp;Primers used for quantitative RT-PCR analysis and cloning genes 桃基因名稱 &nbsp;Nectarine gene name 引物序列（ 5 3） &nbsp;Primer sequence 用途 &nbsp; Use CYP707A1 F： CACGGATCCATGGAAATCAGCAGTATTTTATACTCCATGC 克隆基因 Clone R： GCCGTCGACTTATGTTTTAGGAGATAATCTGATGGGC &nbsp;CYP707A2 F： CGCGGATCCATGCAACTTTTCTGCTCATCATTACTAACAC &nbsp;GTCGAGCTCTCAACTCACAATCTTGCTCCTTGGG &nbsp;CYP707A3 F： CGCGCTCTAGAATGGAGATTGTTTCTAGTTTGATACACATATTGC &nbsp;R： CACGAGCTCTTATTCTTCCCAAAATCTGACTGGTAATCC &nbsp;CYP707A1 F： ACAGACCAACAGATTGCTGACAAC 熒光定量 qRT-PCR ： CCTTCATCATCACCCTCCTCTTCTT CYP707A2 F： TCGGCAACAATAGGGACTTTGAAATG R： CCATCACTCTTCCTTCTCTTCGCTAT CYP707A3 F： TCACCAAGGAGACTACCACAATAGC ： CAAGGAAGCCAACATCAAAGGAGAAC actin F： GTTATTCTTCATCGGCGTCTTCG R： CTTCACCATTCCAGTTCCATTGTC 1.4 &nbsp;相對(duì)電導(dǎo)率的測定 &nbsp;將擬南芥葉片用自來水沖洗后再用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸凈表面水分，放入裝有 10 mL 去離子水的試管中，真空抽氣 20 min 直至葉片完全沉入水底，室溫放置 1 h 并搖勻，用電導(dǎo)儀測定浸提液電導(dǎo)率（ R1） ，然后沸水浴加熱 10 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定浸提液電導(dǎo)率（ R2） ，相對(duì)電導(dǎo)率（ %） = R1/R2，試驗(yàn)設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)，取平均值。 &nbsp;1.5 &nbsp;活性氧分子的測定 &nbsp;將擬南芥葉片用蒸餾水沖洗干凈，置于試管中，加 10 mL 氮藍(lán)四唑（ NBT）染色溶液，用鋁箔紙包裹試管，在室溫下保持過夜。從試管中排出染色溶液，去除葉綠素以正確觀察染色。將葉片浸沒在無水乙醇中并在沸水浴中加熱 10 min，用 60%甘油飽和的紙巾轉(zhuǎn)移葉片， NBT 與內(nèi)源性活性氧分子反應(yīng)顯現(xiàn)藍(lán)色，觀察染色葉片并拍照。 &nbsp;高真真，徐功勛，王東嶺，劉 &nbsp; 利，陳修德，李 &nbsp; 玲，付喜玲，高東升 . 桃 ABA 8羥化酶基因 PpeCYP707As 在擬南芥中過表達(dá)的功能分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (2)： 239 249. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 243 1.6 &nbsp;相對(duì)生長速率的測定 &nbsp;選取擬南芥幼苗進(jìn)行低溫 （ 10 ） 處理， 處理前測量從地表到植株生長點(diǎn)的高度作為株高 （ W1） 。處理 10 d 后再次測量株高（ W2） ，計(jì)算相對(duì)生長速率（ RGR） 。設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)，取平均值。 RGR = （ lnW1 lnW2） /（ t1 t2） ，式中， t1、 t2分別為兩次株高測定的時(shí)間， W1、 W2分別為 t1和 t2時(shí)的株高， ln 為自然對(duì)數(shù)。 &nbsp;2 &nbsp;結(jié)果與分析 &nbsp;2.1 &nbsp;ABA 和 GA 處理的桃芽萌發(fā)情況 &nbsp;用 ABA 和 GA 處理休眠期桃枝條。從圖 1 中可以看出，處理 10 d 后對(duì)照（清水）芽體開始微微萌動(dòng)， ABA 處理的芽體最小，無萌動(dòng)跡象，而 GA 處理的芽體最飽滿，已形成小花苞；處理 15 d后對(duì)照形成花苞且花蕊（雌蕊和雄蕊）伸出花瓣，而此時(shí) ABA 處理的芽體才剛剛萌動(dòng)形成小花苞，GA 處理的已全部開花。由此可知， GA 處理能夠明顯促進(jìn)桃芽萌發(fā)，而 ABA 則明顯抑制桃芽萌發(fā)，在桃芽萌發(fā)上 GA 與 ABA 起到拮抗作用。 &nbsp;圖 1 &nbsp;ABA 和 GA 處理對(duì)桃芽萌發(fā)的影響 &nbsp;Fig. 1 &nbsp;Effects of ABA and GA treatments on peach for bud germination 2.2 &nbsp;轉(zhuǎn)基因擬南芥的 RT-PCR 鑒定 &nbsp;本試驗(yàn)中共獲得 4 個(gè) 35S： PPECYP707A1、 7 個(gè) 35S： PPECYP707A2、 6 個(gè) 35S： PPECYP707A3擬南芥過量表達(dá)株系。從每個(gè)轉(zhuǎn)基因后代群體均挑選 3 個(gè)株系，作為 3 個(gè)重復(fù)，并進(jìn)行后續(xù)的功能分析。以轉(zhuǎn)基因 T3 代純合植株為材料，提取 RNA 進(jìn)行 RT-PCR，在 3 個(gè)目的基因的過表達(dá)株系中PpeCYP707A1、 PpeCYP707A2、 PpeCYP707A3 的表達(dá)量分別達(dá)到了對(duì)照的 23.86 倍、 7.37 倍、 3.23倍（圖 2） ，表明 3 個(gè)目的基因都得到了有效的過表達(dá)。 &nbsp;Gao Zhenzhen， Xu Gongxun， Wang Dongling， Liu Li， Chen Xiude， Li Ling， Fu Xiling， Gao Dongsheng. Functional analysis of peach PpeCYP707As gene in Arabidopsis thaliana overexpressing plants. 244 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 239 249. 圖 2 &nbsp;PpeCYP707As 在野生型（ WT）和 35S： PPECYP707A1、 35S： PPECYP707A2、 35S： PPECYP707A3 株系中的表達(dá)分析 &nbsp;Fig. 2 &nbsp;Expression analysis of PpeCYP707As in wild type（ WT） and 35S： PPECYP707A1， &nbsp;35S： PPECYP707A2， 35S： PPECYP707A3 lines 2.3 &nbsp;轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型 &nbsp; &nbsp;選擇 T3 代不出現(xiàn)分離比的種子播種，觀察幼苗表型。從圖 3 可以明顯看出，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥 35S： PPECYP707A1、 35S： PPECYP707A2、 35S： PPECYP707A3 生長緩慢，長勢(shì)較弱，其中 35S： PPECYP707A1 生長最弱，且葉片橢圓，葉片數(shù) 9 12，而 28 d 的野生型生長旺盛，葉片數(shù) 18 21，葉面積明顯較大，葉片狹長。野生型 32 d 時(shí)主莖上已長出白色花苞，而轉(zhuǎn)基因株系均未抽薹。 &nbsp;圖 3 &nbsp;野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥后代的表型 &nbsp;Fig. 3 &nbsp;The phenotype of wild type and transgenic Arabidopsis &nbsp;2.4 &nbsp;轉(zhuǎn)基因擬南芥種子對(duì) ABA 的敏感性 &nbsp;將轉(zhuǎn)基因擬南芥 T3 代種子分別種在含有 3 mol · L-1ABA 和 5 mol · L-1ABA 的 MS + Kan 培養(yǎng)基上，野生型種在含有 3 mol · L-1ABA 和 5 mol · L-1ABA 的 MS 培養(yǎng)基上，檢測擬南芥種子對(duì) ABA 的敏感性。在 3 mol · L-1ABA 處理（圖 4， a）中，野生型沒有萌發(fā)，而轉(zhuǎn)基因株系高真真，徐功勛，王東嶺，劉 &nbsp; 利，陳修德，李 &nbsp; 玲，付喜玲，高東升 . 桃 ABA 8羥化酶基因 PpeCYP707As 在擬南芥中過表達(dá)的功能分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (2)： 239 249. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 245 35S： PPECYP707A1、 35S： PPECYP707A2、 35S： PPECYP707A3 的萌發(fā)率均在 85%以上，說明其對(duì) 3 mol · L-1ABA 不敏感而野生型對(duì) 3 mol · L-1ABA 極其敏感；在 5 mol · L-1ABA 處理（圖 4，b）中，野生型依然沒有萌發(fā)，而轉(zhuǎn)基因株系分別萌發(fā)了 5 粒、 3 粒、 7 粒，萌發(fā)率降低至 10%以下，說明其對(duì)高濃度 ABA 敏感。 &nbsp;圖 4 &nbsp;野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子對(duì) ABA 的敏感性 &nbsp;Fig. 4 &nbsp;Sensitivity to ABA of wild type and transgenic Arabidopsis seeds 2.5 &nbsp;ABA 處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥的電導(dǎo)率、活性氧分子測定 &nbsp;擬南芥幼苗經(jīng) 1 mmol · L-1 ABA 處理 3 d 后（圖 5） ，野生型植株莖基部的葉片已經(jīng)變黃萎蔫，而 3 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系植株葉片全部呈現(xiàn)綠色，沒有受到 1 mmol · L-1ABA 的傷害。 &nbsp;圖 5 &nbsp;1 mmol · L-1ABA 處理 3 d 的野生型和 35S： PPECYP707A1、 35S： PPECYP707A2、 35S： PPECYP707A3 植株和葉片生長情況 &nbsp;Fig. 5 &nbsp;The wild type and 35S： PPECYP707A1， 35S： PPECYP707A2， 35S： PPECYP707A3 plant and leaf growth &nbsp;under 1 mmol · L-1 ABA treatment for 3 days Gao Zhenzhen， Xu Gongxun， Wang Dongling， Liu Li， Chen Xiude， Li Ling， Fu Xiling， Gao Dongsheng. Functional analysis of peach PpeCYP707As gene in Arabidopsis thaliana overexpressing plants. 246 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 239 249. 表 2 &nbsp;在 1 mmol · L-1ABA 處理下野生型和轉(zhuǎn)基因 &nbsp;擬南芥的電導(dǎo)率 &nbsp;Table 2 &nbsp;Conductivity of wild type and transgenic Arabidopsis thaliana under 1 mmol · L-1 ABA treatment 材料 Material 相對(duì)電導(dǎo)率 Relative conductivity 野生型 &nbsp;Wild type 0.76 a 35S： PPECYP707A1 0.40 bc 35S： PPECYP707A2 0.32 c 35S： PPECYP707A3 0.49 b 選取 1 mmol · L-1 ABA 處理 3 d 的野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片，測定其相對(duì)電導(dǎo)率如表2 所示，與野生型（ 0.76 ）相比， 35S: PPECYP707A1 （ 0.40 ） 、 35S:PPECYP707A2（ 0.32） 、 35S:PPECYP707A3（ 0.49）的相對(duì)電導(dǎo)率均明顯降低，且差異顯著，表明轉(zhuǎn)基因植株葉片受傷害程度明顯減輕，能抵抗 1 mmol · L-1 ABA 的傷害。 &nbsp;選取經(jīng) 1 mmol · L-1 ABA 處理 3 d 的野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片， 用 &nbsp;NBT 溶液染色后檢測植株內(nèi)活性氧分子積累情況如圖 6 所示，有活性氧積累的部位已被染成藍(lán)色，證明在 ABA 處理下葉片細(xì)胞受到傷害，而染色深淺和面積大小反映了受害程度的大小。野生型的葉柄、葉緣及葉面均有被染成藍(lán)色的部分，而轉(zhuǎn)基因植株 35S:PPECYP707A1、 35S:PPECYP707A2、 35S:PPECYP707A3 只有少量的葉片葉柄或葉緣有斑點(diǎn)狀藍(lán)色痕跡，與葉片的相對(duì)電導(dǎo)率的數(shù)據(jù)結(jié)果一致，均能反映轉(zhuǎn)基因植株的葉片受傷害程度比野生型小。 &nbsp;圖 6 &nbsp;1 mmol · L-1ABA 處理下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥經(jīng) NBT 溶液染色情況 &nbsp;Fig. 6 &nbsp;The staining result of wild type and transgenic Arabidopsis thaliana by NBT solution under 1 mmol · L-1 ABA treatment 2.6 &nbsp;低溫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的影響 &nbsp;擬南芥幼苗經(jīng)低溫處理 10 d 后的表型如圖 7 所示，轉(zhuǎn)基因株系 35S:PPECYP707A1、 35S: 圖 7 &nbsp;低溫（ 10 ）處理下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型 &nbsp;Fig. 7 &nbsp;The phenotype of wild type and transgenic Arabidopsis at low temperature（ 10 ） &nbsp;高真真，徐功勛，王東嶺，劉 &nbsp; 利，陳修德，李 &nbsp; 玲，付喜玲，高東升 . 桃 ABA 8羥化酶基因 PpeCYP707As 在擬南芥中過表達(dá)的功能分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (2)： 239 249. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 247 表 3 &nbsp;低溫（ 10 ）處理下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的 &nbsp;相對(duì)生長速率 &nbsp;Table 3 &nbsp;Relative growth rate of wide type and transgenic Arabidopsis at low temperature（ 10 ） &nbsp;材料 &nbsp; Material 相對(duì)生長速率 &nbsp;Relative growth rate 野生型 &nbsp;Wild type 0.009 35S:PPECYP707A1 0.020 35S:PPECYP707A2 0.030 35S:PPECYP707A3 0.021 PPECYP707A2 、 35S:PPECYP707A3 的長勢(shì)均不如野生型旺盛，株高均低于野生型。35S:PPECYP707A1 株高最低；就節(jié)間距而言，低溫處理后野生型、 35S:PPECYP707A2 、35S:PPECYP707A3 的節(jié)間距與未經(jīng)低溫處理的野生型相比明顯縮短（由于 35S:PPECYP707A1 節(jié)間距縮短，株高僅為 1 cm 左右，所以未進(jìn)行比較） ，同時(shí)這也是生長緩慢的直接表現(xiàn)。其中野生型低溫處理前后的節(jié)間距變化差異最明顯；與植株長勢(shì)、株高等結(jié)果完全不同的是， 35S: PPECYP707A1 （ 0.020） 、 35S:PPECYP707A2（ 0.030） 、 35S:PPECYP707A3（ 0.021）的相對(duì)生長速率均比野生型（ 0.009 ）高，其中35S:PPECYP707A2 為野生型的 3.3 倍之多（表3） ，表明在低溫條件下， 3 個(gè)轉(zhuǎn)基因植株株系均比野生型生長速度快。 &nbsp; 3 &nbsp;討論 &nbsp;在番茄中過表達(dá) SlCYP707A1 后植株長勢(shì)較弱、矮小，葉表面積小，葉片卷曲，且 ABA 含量降低（ Nitsch et al.， 2009） 。本研究中擬南芥過表達(dá)株系 35S:PPECYP707A1、 35S:PPECYP707A2、35S:PPECYP707A3 均表現(xiàn)植株矮小，葉表面積小，并且抽薹、開花延遲，其中 35S:PPECYP707A2開花（ 56 d）時(shí)間比野生型（ 32 d）植株晚 24 d。 &nbsp;研究證實(shí)擬南芥中 CYP707A1 主要在種子成熟中期至成熟期表達(dá)，是種子發(fā)育期控制 ABA 分解的主效基因， CYP707A2 在種子晚熟期至發(fā)芽期間表達(dá)，干燥種子得以解除休眠，而 CYP707A1和 CYP707A3 均參與了種子萌發(fā)后芽的生長（ Masanori et al.， 2006） 。另一研究結(jié)果顯示，在擬南芥中過表達(dá)大豆 GmCYP707A1 可降低對(duì) ABA 的敏感性，起到 ABA 8羥化酶的功能（ Zheng et al.，2012） 。而本研究中對(duì)種子萌發(fā)試驗(yàn)的結(jié)果表明，在室溫下經(jīng)過后熟（即休眠解除）的擬南芥種子，在 3 和 5 mol · L-1ABA 處理下，野生型種子萌發(fā)率均表現(xiàn)為 0，對(duì) ABA 表現(xiàn)極其敏感，證明 ABA能有效維持種子休眠，而過表達(dá)株系 35S:PPECYP707A1、 35S:PPECYP707A2、 35S:PPECYP707A3的種子在 3 mol · L-1ABA 處理下萌芽率均超過 85%，而 在 5 mol · L-1ABA 處理下萌發(fā)率顯著降低到 10 %以下，表明 3 mol · L-1ABA 對(duì)過表達(dá)株系種子幾乎無影響，而 5 mol · L-1ABA 才能降低萌發(fā)率，使種子對(duì)其高度敏感?？傊?，與野生型種子相比，過表達(dá)株系種子能有效抵抗低濃度 ABA處理，提高種子萌發(fā)率，說明在擬南芥種子中過表達(dá)桃 PPECYP707As</p>