茄子TRV-VIGS體系的優(yōu)化及SmIAA19基因功能初步分析.pdf

園藝學報， 2018， 45 (4)： 691 701. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0643； http： /www. ahs. ac. cn 691 收稿日期 ： 2018 01 18； 修回日期 ： 2018 03 16 基金項目 ： 國家自然科學基金項目（ 31572122） ；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目（ CAAS-ASTIP-IVFCAAS） ；農(nóng)業(yè)部中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（ 1610102016025） ；重慶市院士引導(dǎo)專項（ cstc2017jcyj-yszxX0005） ；農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室項目 * 共同第一作者 * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： lfzcaas126.com） 茄子 TRV-VIGS 體系的優(yōu)化及 SmIAA19 基因功能初步分析 齊東霞1,*，張 映1,*，趙 禎1，張偉偉1，陳鈺輝1，連 勇1，田時炳2，劉富中1,*（1中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2重慶市農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，重慶 400055） 摘 要： 以經(jīng)過改造的煙草脆裂病毒（ Tobacco rattle virus， TRV）載體 PYL156 為工具，采用葉片注射法侵染茄子（ Solanum melongena L.）葉片，通過表型比較、 TRV 病毒分子檢測和熒光定量 PCR 技術(shù)分析，探究環(huán)境溫度、植株大小、目的基因插入片段大小對茄子 TRV-VIGS 沉默體系的影響。結(jié)果表明，晝夜溫度為（ 25 ± 3）和（ 20 ± 2）時，接種茄子幼苗子葉的植株沉默效果明顯，侵染后植株葉片中目的基因表達量與陰性對照相比明顯降低；早春日光溫室和秋季日光溫室條件下，侵染植株表型性狀和基因表達量差異不顯著。沉默片段大小為 200 bp 左右時目的基因的沉默效果最好；侵染茄子幼苗子葉期植株出現(xiàn)明顯病毒斑，而接種 6 周齡真葉則無明顯表型差異。用茄子生長素誘導(dǎo)基因（ SmIAA19）為靶基因?qū)ζ溥M行驗證，結(jié)果表明顯著抑制了 SmIAA19 的表達，其在葉片中的表達量和生長素含量均顯著降低，表明 SmIAA19 是 1 個與生長素代謝途徑相關(guān)的基因。 關(guān)鍵詞： 茄子；煙草脆裂病毒；病毒誘導(dǎo)的基因沉默；生長素誘導(dǎo)基因 中圖分類號： S 641.1 文獻標志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 04-0691-11 Optimization of Virus-induced Gene Silencing System and Function Identification of SmIAA19 Gene in Eggplant QI Dongxia1,*， ZHANG Ying1,*， ZHAO Zhen1， ZHANG Weiwei1， CHEN Yuhui1， LIAN Yong1， TIAN Shibing2， and LIU Fuzhong1,*（1Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China；2The Institute of Vegetables and Flowers， Chongqing Academy of Agricultural Sciences， Chongqing 400055， China） Abstract： Virus-induced gene silencing（ VIGS） system is a very useful tool for evaluating gene function and molecular mechanism. Many factors， such as vector， viral proliferation and systemic movement throughout the plant， affect the efficiency of VIGS. In order to improve the VIGS silence efficiency in eggplant（ Solanum melongena L.） ， three parameters（ environment temperature， seedling age and gene fragment size） were optimized. The results showed that the silencing efficiency was higher in Qi Dongxia， Zhang Ying， Zhao Zhen， Zhang Weiwei， Chen Yuhui， Lian Yong， Tian Shibing， Liu Fuzhong. Optimization of virus-induced gene silencing system and function identification of SmIAA19 gene in eggplant. 692 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (4)： 691 701. temperature controlled greenhouse（ 25 ± 3） ， daytime and（ 20 ± 2） ， nightthan in room temperature greenhouse. After inoculation of the cotyledons of eggplant， the plants had obvious silence symptom， but there was no obvious silence effect when the six-week-old true leaves were inoculated. The silence frequencies of the gene fragments 597 bp， 442 bp and 205 bp were 56.67%， 62.5% and 68.75% respectively， indicating that about 200 bp might be the most suitable fragment size for VIGS. Then， the function of SmIAA19 from eggplant IAA family genes was evaluated using this VIGS system. The SmIAA19 silence plants presented obvious phenotypic symptoms after inoculation for 4 weeks. The transcript levels of SmIAA19 and auxin content in the SmIAA19 silenced plants were significantly reduced compared to the control. It showed that SmIAA19 was an auxin metabolic related gene in eggplant， and TRV-VIGS system was a reliable method for the function identification of eggplant gene. Keywords： eggplant； Tobacco rattle virus（ TRV） ； virus-induced gene silencing（ VIGS） ； SmIAA19 病毒誘導(dǎo)的基因沉默（ virus-induced gene silencing， VIGS）是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)（ Ratcliff et al.， 1997） ，通過含有目的基因的重組病毒載體沉默植株同源基因，從而導(dǎo)致表型變異，實現(xiàn)對該基因功能的分析（ Scofield et al.， 2005； Senthil-Kumar & Mysore， 2011） 。 VIGS 技術(shù)具有快速、有效、操作簡單和適用范圍廣等優(yōu)點（彭燕 等， 2002； Lu et al.， 2003； Qu et al.， 2003） ，其中煙草脆裂病毒（ Tobacco rattle virus， TRV）誘導(dǎo)的基因沉默（ TRV-VIGS） ，具有病毒癥狀溫和，持續(xù)時間長和沉默效率高等特點，是應(yīng)用較為廣泛的一種沉默體系（ Huang et al.， 2012） ，已在番茄（ Ryu et al.， 2004； Fragkostefanakis et al.， 2014） 、煙草（ Senthil-Kumar et al.， 2007； Senthil-Kumar & Mysore，2014） 、 辣椒 （ Zhang et al.， 2015） 、 馬鈴薯 （張曉蘿 等， 2014） 和矮牽牛 （ Spitaer et al.， 2007； Broderick & Jones， 2014）等植物中成功應(yīng)用。 Liu 等（ 2012）也證明了 TRV-VIGS 體系能在茄子中成功應(yīng)用，但其影響因素需進一步探索。 影響 VIGS 沉默效果的因素可以概括為病毒與宿主植物的相互作用及其生長的環(huán)境條件（ Burch-Smith et al.， 2004） 。如插入片段與目的基因的同源性（ Thomas et al.， 2001； Holzberg et al.，2002； Tuttle et al.， 2008） 、 插入片段的長度 （ Burch-Smith et al.， 2006； 張增艷 等， 2006； Liu & Page，2008） 、環(huán)境溫度（ Liu et al.， 2002； Tuttle et al.， 2008） 、侵染方式（ Fu et al.， 2005； Liu et al.， 2012）和植株的生育期（ Cai et al.， 2006）等。插入片段與目的基因的同源性越高，沉默效果越好，同源性超過 85%即可產(chǎn)生有效的基因沉默（ Thomas et al.， 2001； Holzberg et al.， 2002） 。 TRV 載體插入片段應(yīng)控制在 23 1 500 bp（張增艷 等， 2006） ，目的基因片段長度 200 350 bp 時沉默效果較好（ Burch-Smith et al.， 2006； Liu & Page， 2008） 。溫度是影響病毒傳播和宿主植物生長最重要的環(huán)境因素之一，有研究表明，較低的溫度沉默效果優(yōu)于較高的溫度，當溫度高于 25 時沉默效果不明顯（ Liu et al.， 2002； Tuttle et al.， 2008） 。侵染方式對 VIGS 的沉默效果也有不同程度的影響（ Fu et al.， 2005； Liu et al.， 2012） 。寄主的不同生育期對病毒侵入、增殖和移動均有影響，同時也會影響VIGS 的沉默效率（ Cai et al.， 2006） 。 本研究中以茄子單性結(jié)實品系 D-10 為材料，構(gòu)建實驗室克隆的兩個單性結(jié)實相關(guān)基因：茄子（ Solanum melongena L.）甲硫氨酸亞砜還原酶 A 基因（ methionine sulfoxide reductase A， SmMsrA）（張映 等， 2011a）和生長素誘導(dǎo)基因（ IAA family gene， SmIAA19） （張偉偉 等， 2014） ，插入片段長度不同的病毒誘導(dǎo)的基因沉默（ VIGS）表達載體，通過對 TRV 病毒誘導(dǎo)的基因沉默效果分析，研究溫度、接種苗齡和目的基因片段長度對 TRV 病毒介導(dǎo)的基因沉默的影響，以期完善茄子的齊東霞，張 映，趙 禎，張偉偉，陳鈺輝，連 勇，田時炳，劉富中 . 茄子 TRV-VIGS 體系的優(yōu)化及 SmIAA19 基因功能初步分析 . 園藝學報， 2018， 45 (4)： 691 701. 693 TRV-VIGS 體系，為茄子功能基因組學研究奠定基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 試驗材料 茄子（ Solanum melongena L.）單性結(jié)實品系 D-10，載體 pTRV1 和 pTRV2，和可引起植株產(chǎn)生白化癥狀的對照載體 pTRV2-PDS，農(nóng)桿菌（ Agrobacterium tumefaciens） GV3101 由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所加工番茄課題組提供。 RNA 提取試劑盒、 cDNA 合成試劑盒及 pEASY®-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit 和FASTPfu 高保真 DNA 聚合酶購自北京全式金有限公司，瓊脂糖凝膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司。 PentrtTMDirectional TOPO®Cloning Kits 和 Gateway®LR Clonase Enzyme Mix 購自美國 invitrogen 公司。 1.2 試驗方法 1.2.1 載體構(gòu)建 提取茄子單性結(jié)實材料開花當天果實的 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，利用 Gateway 技術(shù)（畢惠惠 等， 2013）構(gòu)建 3 個茄子甲硫氨酸亞砜還原酶 A 基因的 VIGS 表達載體（載體插入片段大小分別為 597、 442 和 205 bp） ，命名為 p1、 p2 和 p3。依據(jù)基因的 cDNA 序列設(shè)計引物（表 1） ，擴增其cDNA 序列，進行平末端 PCR 擴增。擴增產(chǎn)物進行膠回收并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，藍白斑篩選后測序鑒定。對測序正確的膠回收產(chǎn)物進行平末端 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物與 pENTRTMD-TOPO®載體連接并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，菌液 PCR 后測序驗證。通過 LR 反應(yīng)將連接在入門載體上的插入片段轉(zhuǎn)接到 pTRV2 載體上，并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，對陽性菌落測序鑒定。將檢測正確的表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 GV3101 中備用。 利用 In-Fusion 技術(shù)（根據(jù) pEASY®-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit 說明書）構(gòu)建 1 個插入片段為 256 bp 的生長素誘導(dǎo)基因（ SmIAA19）的 VIGS 表達載體，命名為 p4。依據(jù) SmIAA19序列設(shè)計引物（表 1） ，并在引物上加 15 25 bp 與線性化載體同源的接頭，以 cDNA 為模板用高保真 DNA 聚合酶進行平末端擴增，擴增產(chǎn)物進行膠回收。根據(jù) pEASY®-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit 說明書進行連接反應(yīng)，將插入片段連接到線性化載體 pTRV2 中，并轉(zhuǎn)入 Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)中，對陽性單克隆測序鑒定。將檢測正確的表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 GV3101 中備用。 表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences 引物 Primer name 序列（ 5 3） Sequence 片段大小 /bp Sequence size p1 F： CACCATGGCTTCCAAAGAAGAG； R： ACCGTAGCACCTTATTGG 597 p2 F： CACCAAGCGACTCAACCACCAAT； R： ACCGTAGCACCTTATTGG 442 p3 F： CACCTGATGCTCAGGCTCAACT； R： ACCGTAGCACCTTATTGG 205 p4 F： GCCTCCATGGGGATCCAGGAAAGTTGATTTGAGCAC R： GCTCGGTACCGGATCCCCCTATCACGTTTACCTCTG 256 RNA1 F： TTACAGGTTATTTGGGCTAG； R： CCGGGTTCAATTCCTTATC 647 RNA2 F： TACGACGAACCAAGGG； R： TGCGAAACTCAAATGCT 427 Actin F： ATCCAGCCTTCACCATTCCA； R： GGTCATCATCTCCGGTTTGC 150 Qi Dongxia， Zhang Ying， Zhao Zhen， Zhang Weiwei， Chen Yuhui， Lian Yong， Tian Shibing， Liu Fuzhong. Optimization of virus-induced gene silencing system and function identification of SmIAA19 gene in eggplant. 694 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (4)： 691 701. 1.2.2 不同處理條件對 VIGS 的影響及驗證 分別探索溫度、接種苗齡和插入片段長度對茄子的 VIGS 的影響。 溫度處理：分別在非控溫日光溫室條件（早春日光溫室和秋日光溫室）和控溫溫室條件下將表達載體 p3 接種到茄子幼苗子葉，用溫濕度記錄儀記錄試驗期間的溫度。早春日光溫室日最低溫度為9 22 ， 日最高溫度為 20 41 ； 秋日光溫室日最低溫度為 8 20 ， 日最高溫度為 19 38 ?？販販厥覘l件下晝夜溫度分別控制為（ 25 ± 3）和（ 20 ± 2），相對濕度為 60% 75%。 接種苗齡處理：控溫溫室條件下，接種表達載體 p3 到茄子幼苗子葉和 6 周齡真葉。 插入片度長度處理：控溫溫室條件下接種茄子幼苗子葉，載體的插入片段長度分別為 205、 442和 597 bp。 利用以上研究優(yōu)化的 TRV-VIGS 體系對基因 SmIAA19 的功能進行初步分析。 1.2.3 農(nóng)桿菌侵染 將含有目標載體 pTRV1、 pTRV2、 pTRV2-PDS、 p1、 p2、 p3 和 p4 的農(nóng)桿菌 GV3101 涂布在 LB固體培養(yǎng)基（含 50 mg · L-1 Kan 和 50 mg · L-1Rif）中， 28 ，倒置暗培養(yǎng)。挑取單克隆于 LB 液體培養(yǎng)基（含有相同濃度的 Kan 和 Rif）中， 28 ， 200 r · min-1過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)至 OD600約為 0.8 時，取 500 L 菌液轉(zhuǎn)接到 50 mL 細菌培養(yǎng)基（ YEB）中， 28 ， 200 r · min-1過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)至 OD600約為 0.8 時， 取 45 mL 菌液離心收集 （ 4 000 r · min-1， 8 min） ， 用新鮮 MMA含 20 g · L-1蔗糖， 5 g · L-1含鹽不含維生素的 MS 培養(yǎng)基， 1 mol · L-1 2（ N嗎啡啉）乙磺酸， pH 5.6， 200 mol · L-1乙酰丁香酮培養(yǎng)基懸浮菌液，重懸菌液的 OD600保持為 1.0 2.0。將 pTRV1 分別與其他菌液 1 1 混合，室溫靜置 1 h 后用于侵染。采用 5 mL 無菌注射器通過葉片注射侵染法進行接種（傅達其， 2016） 。侵染子葉時，從子葉背部進行注射，使菌液充滿整片子葉。侵染真葉時，對植株上部兩片嫩葉進行注射。試驗植株包括空白對照（不處理） 、 pTRV2 空載的陰性對照、含 pTRV2-PDS 載體的陽性對照、沉默 SmMsrA 基因的 3 個 VIGS 表達載體 p1、 p2、 p3 和沉默 SmIAA19 基因的 VIGS 表達載體 p4。 1.2.4 植株表型性狀鑒定 侵染后 21 d，通過比較白化或 TRV 病毒導(dǎo)致的花葉表型的植株數(shù)與接種的總植株數(shù)的百分比評估基因沉默頻率。測量株高、株幅、葉長和葉寬等植株表型數(shù)據(jù)，評估基因沉默對植株表型的影響。 1.2.5 熒光定量 PCR 分析 取接種后 28 d 不同處理植株嫩葉，提取總 RNA，并用隨機引物合成 cDNA。用特異引物 RNA1和 RNA2（表 1）檢測 TRV 病毒。對處理植株中內(nèi)源基因的表達量進行 qRT-PCR 檢測。取接種后不同處理植株嫩葉，提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以 cDNA 為模板，根據(jù)基因插入片段設(shè)計熒光定量引物，以肌動蛋白基因（ Actin）為內(nèi)參基因（表 1） ，使用 Roche Light Cycler480 進行熒光定量 PCR分析。反應(yīng)體系 10 L：模板 2 L，上、下游引物各 0.5 L， SYBR Green Master Mix 5 L， ddH2O 2 L。反應(yīng)程序為： 95 10 min； 95 10 s， 57 20 s， 72 30 s， 50 個循環(huán)后作熔解曲線（ 95 65 ， 0.1 · s-1） 。具體方法參考張映（ 2011b）的。 1.2.6 生長素含量的檢測 接種 45 d 后，采用酶聯(lián)免疫吸附分析法（ enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）測定各處理植株葉片內(nèi)源生長素（ IAA）含量，設(shè) 3 次重復(fù)。試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學提供。 使用 Excel 2010 軟件和 SPSS 軟件處理數(shù)據(jù)。 齊東霞，張 映，趙 禎，張偉偉，陳鈺輝，連 勇，田時炳，劉富中 . 茄子 TRV-VIGS 體系的優(yōu)化及 SmIAA19 基因功能初步分析 . 園藝學報， 2018， 45 (4)： 691 701. 695 2 結(jié)果與分析 2.1 目的基因 VIGS 表達載體的構(gòu)建 對構(gòu)建的 VIGS 表達載體進行 PCR 檢測， 出現(xiàn)符合預(yù)期的 597、 442、 205 和 256 bp 目的條帶 （圖1） ，且測序結(jié)果完全正確，表明 SmMsrA 的 VIGS 表達載體 p1、 p2 和 p3， SmIAA19 的 VIGS 表達載體 p4 構(gòu)建成功。 將構(gòu)建成功的 VIGS 表達載體熱激轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 GV3101 中，并對其進行 PCR 擴增檢測，結(jié)果與預(yù)期相符，出現(xiàn)目的片段，表明 4 個 VIGS 表達載體成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101。 圖 1 PCR 檢測 VIGS 表達載體 p1、 p2、 p3、 p4 Fig. 1 PCR identification of VIGS expression vectors p1， p2， p3 and p4 2.2 溫度對沉默效果的影響 2.2.1 非控溫日光溫室條件下的沉默效果 分別將空白對照植株，以及陽性對照 pTRV2-PDS、陰性對照 pTRV2 和 SmMsrA 表達載體 p3 的農(nóng)桿菌液侵染茄子幼苗子葉的植株，培養(yǎng)在早春日光溫室中 21 d 后，空白對照正常生長，無病毒斑和白化現(xiàn)象， 29 株 pTRV2-PDS 處理株中有 10 株第 2 片真葉上出現(xiàn)白化現(xiàn)象，沉默率為 34.48%（圖2， pTRV2-PDS） ； 28 株陰性對照 pTRV2 處理株中有 2 株第 2 片真葉上出現(xiàn)病毒斑， 沉默率為 7.14%；26 株 p3 處理株中有 4 株第 2 片真葉上出現(xiàn)病毒斑，沉默率為 15.38%， pTRV2 和 p3 侵染后 28 d 病毒斑未擴散。秋日光溫室未出現(xiàn)明顯白化現(xiàn)象和病毒斑（圖 2，對照、 P3） ，但是處理株的株高和生長速度稍小于對照株。 2.2.2 控溫溫室條件下的沉默效果 分別將空白對照植株，以及陽性對照 pTRV2-PDS、陰性對照 pTRV2 和 SmMsrA 表達載體 p3 的農(nóng)桿菌液侵染茄子幼苗子葉的植株，在控溫溫室中培養(yǎng) 21 d 后，空白對照正常生長，無病毒斑和白化現(xiàn)象， 32 株 pTRV2-PDS 處理株中 28 株出現(xiàn)白化現(xiàn)象，沉默率達 87.5%， 28 d 時白化現(xiàn)象明顯；32 株陰性對照 pTRV2 處理株中 28 株出現(xiàn)病毒斑，且葉片發(fā)黃，生長勢弱沉默率達 87.5%； 31 株p3 處理株中 21 株葉片出現(xiàn)病毒斑，且葉片發(fā)黃，生長勢弱，沉默率達 68.75%（圖 3） ，且葉片發(fā)黃，生長勢弱。陽性對照 pTRV2-PDS 的白化現(xiàn)象持續(xù)時間較長， 4 個月后植株基部萌發(fā)的側(cè)枝仍然表型為白化現(xiàn)，說明 TRV 病毒介導(dǎo)的基因沉默效率較高，基因沉默期較長。 Qi Dongxia， Zhang Ying， Zhao Zhen， Zhang Weiwei， Chen Yuhui， Lian Yong， Tian Shibing， Liu Fuzhong. Optimization of virus-induced gene silencing system and function identification of SmIAA19 gene in eggplant. 696 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (4)： 691 701. 圖 4 SmMsrA 基因在不同處理株中的相對表達量 Fig. 4 Relative expression of SmMsrA in different treatments圖 2 非控溫溫室中侵染茄子幼苗子葉后沉默表型 Fig. 2 The silence phenotype of infested eggplant seedling cotyledon in common greenhouse 圖 3 控溫溫室中侵染茄子幼苗子葉后沉默表型 Fig. 3 The silence phenotype of infested eggplant seedling cotyledon in temperature-controlled greenhouse 對處理株嫩葉 SmMsrA 的表達量進行熒光定量 PCR 分析。結(jié)果表明，與 pTRV2 陰性對照相比， p3 處理株葉片中 SmMsrA 的表達量顯著降低，為陰性對照的 36%（圖 4） ，說明沉默效果顯著。 2.3 接種苗齡對沉默效果的影響 2.3.1 侵染幼苗期子葉 即控溫溫室條件下接種茄子幼苗子葉，沉默pTRV2-PDS 處理株葉片白化； pTRV2 和 p3 處理，植株葉片出現(xiàn)病毒斑且葉片發(fā)黃，生長勢弱，基因表達量也顯著降低，表明控溫溫室條件下接種茄子幼苗子葉期沉默效果顯著。 2.3.2 侵染 6 周齡真葉 控溫溫室條件下侵染茄子 6 周齡真葉， 28 d 后，與空白對照相比，處理株均沒有明顯表型差異，表明控溫溫室條件下接種茄子 6 周齡真葉沉默效果不顯著。推測侵染時植株較大，葉片較硬，纖維化明顯，植株抗病毒侵染能力增強，侵染的菌量相對整個植株較少，導(dǎo)致基因沉默效果不能顯現(xiàn)。 齊東霞，張 映，趙 禎，張偉偉，陳鈺輝，連 勇，田時炳，劉富中 . 茄子 TRV-VIGS 體系的優(yōu)化及 SmIAA19 基因功能初步分析 . 園藝學報， 2018， 45 (4)： 691 701. 697 圖 5 控溫溫室條件下侵染子葉后葉片中 SmMsrA 基因 的相對表達量 Fig. 5 Leaves relative expression of SmMsrA after infested cotyledon in temperature-controlled greenhouse 2.4 目的基因插入片段長度對沉默效果的影響 在控溫溫室條件下侵染茄子幼苗子葉后21 d，統(tǒng)計基因沉默率。陰性對照 pTRV2、陽性對照 pTRV2-PDS、處理株 p1、 p2 和 p3 分別有 28 株、 28 株、 17 株、 19 株和 21 株出現(xiàn)表型， 沉默率分別為 87.5%、 87.5%、 56.67%、 62.5%和 68.75%， p3 沉默率最高， p2 其次， p1 最低。 每處理取 3 個重復(fù)，每個生物學重復(fù)取 3個單株，以 Actin 為內(nèi)參基因，對基因表達量進行分析。 結(jié)果 （圖 5） 表明， 與陰性對照 pTRV2相比， p1、 p2、 p3 的表達量顯著降低，在插入片段約 205 bp 的表達載體 p3 沉默效果最好。 2.5 驗證 SmIAA19 的功能 2.5.1 表型性狀 在控溫溫室條件下，采用葉片注射法侵染茄子幼苗子葉，其中陰性對照 pTRV2、陽性對照pTRV2-PDS、沉默 SmIAA19 基因的處理株 p4 分別接種了 90 株、 64 株和 96 株。侵染 15 d 后有 61株 pTRV2-PDS 處理株出現(xiàn)白化現(xiàn)象， 20 d 后陰性對照 pTRV2 和 p4 處理株分別有 89 和 92 株葉片上出現(xiàn)病毒斑， 28 d 后， 表型依然明顯 （圖 6） 。 與空白對照相比， 侵染后 28 d， 沉默 pTRV2、 pTRV2-PDS和 p4 植株的株高、株幅、葉長和葉寬 4 個性狀均變?。ū?2） ，說明病毒侵染會導(dǎo)致植株生長勢變?nèi)?。侵染?28 d，統(tǒng)計基因沉默頻率。 pTRV2、 TRV2-PDS 和 p4 的沉默頻率分別為 98.8%、 95.3%和 95.8%，沉默頻率較高。 圖 6 侵染后 28 d 植株沉默表型 Fig. 6 The silence phenotype 28 days after infection 表 2 侵染后 28 d 表型數(shù)據(jù) Table 2 The phenotypic data 28 days after infection 處理 Treatment 株高 /cm Height 株幅 /cm Spacing 葉長 /cm Leaf length 葉寬 /cm Leaf width 對照 Control 10.96 ± 1.16 a 7.38 ± 1.25 a 4.65 ± 0.64 a 3.91 ± 0.55 a pTRV2-PDS 8.49 ± 1.35 b 5.85 ± 0.91 b 3.54 ± 0.36 b 3.32 ± 0.71 b pTRV2 8.30 ± 1.01 b 3.95 ± 0.81 c 3.27 ± 0.51 b 2.43 ± 0.47 c pTRV2-SmIAA19 8.52 ± 0.74 b 4.47 ± 1.23 c 3.02 ± 0.42 b 2.53 ± 0.44 c Qi Dongxia， Zhang Ying， Zhao Zhen， Zhang Weiwei， Chen Yuhui， Lian Yong， Tian Shibing， Liu Fuzhong. Optimization of virus-induced gene silencing system and function identification of SmIAA19 gene in eggplant. 698 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (4)： 691 701. 2.5.2 病毒分子檢測 以特異引物 RNAl和 RNA2對處理株葉片進行 TRV病毒檢測。 結(jié)果 （圖 7） 表明， 沉默 pTRV2-PDS、pTRV2 和 p4 的植株中均出現(xiàn)病毒的兩條特異性條帶，空白對照中無特異性擴增。說明 TRV 病毒成功侵入到了茄子植株中。 圖 7 處理株 TRV 病毒 RNA1 和 RNA2 的檢測 M： Marker； 1、 6： pTRV2-PDS； 2、 7： p4； 3、 8： pTRV2； 4、 5：對照。 Fig. 7 TRV virus RNA1 and RNA2 detection in treatments M： Marker； 1， 6： pTRV2-PDS； 2， 7： p4； 3， 8： pTRV2； 4， 5： Control. 2.5.3 qRT-PCR 分析和生長素 （ IAA） 含量的變化 以 Actin 為內(nèi)參基因，對處理株的葉片進行基因表達量分析。結(jié)果（表 3）表明，與空白對照和陰性對照 pTRV2 相比， p4 處理株葉片中 SmIAA19 的表達量顯著降低。 p4 處理株基因的表達量是pTRV2 的 43.5%，是空白對照的 50.14%。陰性對照 pTRV2 比空白對照的 SmIAA19 基因表達量高，說明病毒對基因的表達量有一定影響?？瞻讓φ铡㈥幮詫φ?pTRV2 和 p4 處理植株的生長素含量分別為 76.9、 76.3 和 32.8 mg · g-1。 p4 處理植株生長素含量是 pTRV2 的 42.94%，是對照的 42.61%，處理株 pTRV2 與空白對照的生長素無差異，說明 SmIAA19 的表達與生長素含量的變化相關(guān)。 表 3 處理株 SmIAA19 相對表達量和生長素相對含量 Table 3 Relative expression of SmIAA19 and auxin relative content in treatments 處理 Treatment 相對表達量 Relative expression 生長素含量 /（ mg · g-1） Auxin content 對照 Control 0.0262 ± 0.0019 a 76.9 ± 1.7 b pTRV2 0.0337 ± 0.0025 a 76.3 ± 2.0 a p4 0.0169 ± 0.0014 b 32.8 ± 1.6 c 3 討論 煙草脆裂病毒（ TRV）誘導(dǎo)的基因沉默（ TRV-VIGS）是目前應(yīng)用廣泛的一種沉默體系（ Huang et al.， 2012） 。本研究中以經(jīng)過改造的 TRV 載體 PYL156 為工具，構(gòu)建了 4 個 VIGS 表達載體，利用注射壓迫法，在 20 25 侵染茄子幼苗子葉，有效降低了葉片中目的基因轉(zhuǎn)錄水平的表達量，證明改造后的 TRV 載體適用于茄子的 V1GS 沉默技術(shù)體系， 為研究茄子的功能基因組學提供了技術(shù)平臺。 影響 VIGS 效果的因素有環(huán)境條件、目的基因插入片段長度、侵染方式和接種苗齡等（張增艷 等，