牛心甘藍蠟粉缺失突變體410M特征的研究.pdf

南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 ，(): :/. :./. 收 稿 日 期: 基 金 項 目: 國 家 重 點 研 發(fā) 計 劃 項 目() 作 者 簡 介: 石 利 朝， 碩 士 研 究 生。 通 信 作 者: 嚴(yán) 繼 勇， 研 究 員， 主 要 從 事 甘 藍 類 蔬 菜 遺 傳 育 種 與 種 質(zhì) 創(chuàng) 新 研 究，-:.。 石 利 朝， 曾 愛 松， 李 家 儀， 等. 牛 心 甘 藍 蠟 粉 缺 失 突 變 體 特 征 的 研 究. 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報，():. 牛 心 甘 藍 蠟 粉 缺 失 突 變 體 特 征 的 研 究 石 利 朝 ， ， 曾 愛 松 ， 李 家 儀 ， 王 金 香 ， ， 宋 立 曉 ， 嚴(yán) 繼 勇 (. 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 園 藝 學(xué) 院， 江 蘇 南 京；. 江 蘇 省 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 蔬 菜 研 究 所/ 江 蘇 省 高 效 園 藝 作 物 遺 傳 改 良 重 點 實 驗 室， 江 蘇 南 京；. 中 國 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 生 物 學(xué) 院， 北 京) 摘 要: 目 的 本 文 旨 在 探 索 牛 心 甘 藍 蠟 粉 缺 失 突 變 體 的 特 征 和 實 際 應(yīng) 用 價 值， 以 豐 富 甘 藍 種 質(zhì) 資 源， 加 速 新 品 種 創(chuàng) 制 和 改 良。 方 法 調(diào) 查 牛 心 甘 藍 野 生 型 材 料 和 蠟 粉 缺 失 突 變 體 的 農(nóng) 藝 性 狀， 測 定 其 營 養(yǎng) 品 質(zhì)； 掃 描 電 鏡 觀 察 其 葉 表 超 微 結(jié) 構(gòu)； 以 蠟 粉 缺 失 突 變 體 材 料( ) 與 其 野 生 型( ) 為 親 本 分 別 配 制 世 代 群 體， 分 析 蠟 粉 缺 失 性 狀 的 遺 傳 規(guī) 律； 篩 選 出 個 在 擬 南 芥 中 參 與 蠟 粉 合 成、 轉(zhuǎn) 運 的 基 因， 并 利 用 實 時 熒 光 定 量 對 其 在 和 中 的 表 達 模 式 進 行 分 析。 結(jié) 果 蠟 粉 缺 失 甘 藍 葉 色 亮 綠， 突 變 體 球 葉 和 外 葉 的 維 生 素 含 量 顯 著 高 于 野 生 型； 其 他 表 型 及 主 要 營 養(yǎng) 成 分 與 野 生 型 無 明 顯 差 異。 葉 表 超 微 結(jié) 構(gòu) 觀 察 顯 示， 突 變 體 葉 表 面 光 滑， 蠟 粉 嚴(yán) 重 缺 失； 野 生 型 葉 表 蠟 粉 分 布 致 密， 晶 體 結(jié) 構(gòu) 主 要 為 片 狀 和 線 狀。 對 世 代 群 體 分 離 比 例 進 行 檢 測， 結(jié) 果 表 明 蠟 粉 缺 失 性 狀 為 隱 性 單 基 因 遺 傳。 在 參 與 擬 南 芥 蠟 粉 生 物 合 成、 轉(zhuǎn) 運 的 個 基 因 中， 共 有 個 基 因 在 野 生 型 中 的 表 達 顯 著 高 于 突 變 體。 結(jié) 論 蠟 粉 缺 失 突 變 體 遺 傳 穩(wěn) 定， 商 品 性 好， 為 育 種 和 蠟 粉 分 子 基 礎(chǔ) 研 究 的 優(yōu) 良 材 料。 關(guān) 鍵 詞: 甘 藍； 蠟 粉 缺 失 突 變 體； 農(nóng) 藝 性 狀； 超 微 結(jié) 構(gòu)； 遺 傳 規(guī) 律； 蠟 粉 基 因 中 圖 分 類 號:. 文 獻 標(biāo) 志 碼: 文 章 編 號:() - ， ， ， ， ， ， ， (.，；.， /， ，；.，) : ，-. ，- ().，-， ， ， ，-()().， -. ，- .， ，. ， .， ，-.， -.- ，-. ， - .，- ，. ，- . :； 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 第 卷 結(jié) 球 甘 藍(.) 簡 稱 甘 藍， 是 十 字 花 科 蕓 薹 屬 甘 藍 種 中 的 一 個 變 種。 其 葉 色 綠 至 深 綠， 外 葉 及 外 層 球 葉 表 面 均 有 一 層 蠟 粉 覆 蓋。 蠟 粉 的 主 要 作 用 是 減 少 非 氣 孔 的 水 分 散 失， 降 低 水 分 消 耗 ， 保 護 植 物 抵 御 過 量 紫 外 線 輻 射、 低 溫 凍 傷 等 逆 境 ， 還 可 有 效 抵 御 細(xì) 菌 和 真 菌 病 原 體 的 入 侵， 防 止 食 草 昆 蟲 的 侵 害 等 。 同 時， 甘 藍 植 株 表 面 的 蠟 粉 多 少 還 是 決 定 商 品 品 質(zhì) 的 一 個 重 要 指 標(biāo)。 蠟 粉 少 的 甘 藍 葉 色 亮 綠， 感 官 好， 品 質(zhì) 優(yōu) 良， 受 到 消 費 者 歡 迎。 亮 葉 甘 藍 由 普 通 甘 藍 突 變 而 來， 體 表 無 或 有 少 量 蠟 粉 覆 蓋， 葉 色 亮 綠， 品 質(zhì) 優(yōu) 良， 對 于 豐 富 甘 藍 種 質(zhì) 資 源、 培 育 優(yōu) 質(zhì) 甘 藍 新 品 種 具 有 重 要 的 意 義 。 關(guān) 于 無 蠟 粉 缺 失 突 變 體 甘 藍 的 相 關(guān) 研 究， 在 國 內(nèi)、 外 僅 有 少 量 報 道 ， 而 且 發(fā) 現(xiàn) 的 均 是 圓 球 和 扁 球 型 突 變 體。 在 我 國 長 江 流 域 及 以 南 地 區(qū)， 牛 心( 尖 球) 類 型 甘 藍 一 直 是 大 家 喜 歡 種 植 和 消 費 的 品 種 類 型。 牛 心 甘 藍 普 遍 存 在 蠟 粉 較 多、 球 色 不 夠 綠 的 問 題。 為 了 提 高 特 色 新 品 種 的 競 爭 優(yōu) 勢， 牛 心 甘 藍 葉 色 的 改 良 成 為 育 種 工 作 者 的 一 個 重 要 課 題。 年， 在 優(yōu) 良 牛 心 型 純 合 材 料 的 群 體 中， 發(fā) 現(xiàn) 了 其 蠟 粉 缺 失 突 變 體 。 前 人 的 研 究 結(jié) 果 表 明， 蕓 薹 屬 植 物 突 變 體 缺 失 蠟 粉 性 狀 遺 傳 規(guī) 律 較 為 復(fù) 雜， 不 同 突 變 體 之 間 差 異 較 大， 且 由 不 同 的 基 因 控 制。 因 此， 本 文 對 首 次 發(fā) 現(xiàn) 的 牛 心 類 型 甘 藍 突 變 體 的 特 征、 主 要 營 養(yǎng) 物 質(zhì) 含 量、 蠟 粉 結(jié) 構(gòu)、 遺 傳 規(guī) 律 進 行 研 究， 并 且 對 擬 南 芥 中 參 與 蠟 粉 合 成、 轉(zhuǎn) 運 的 基 因 在 和 中 進 行 了 表 達 水 平 分 析， 以 期 明 確 該 甘 藍 蠟 粉 缺 失 突 變 體 的 特 征 特 性 及 其 在 育 種 中 的 實 際 應(yīng) 用 價 值， 為 豐 富 甘 藍 種 質(zhì) 資 源、 新 品 種 創(chuàng) 制 和 改 良 提 供 理 論 依 據(jù)。 材 料 與 方 法 . 材 料 供 試 甘 藍 野 生 型 材 料 及 其 蠟 粉 缺 失 突 變 體 由 江 蘇 省 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 蔬 菜 研 究 所 葉 菜 類 蔬 菜 研 究 室 提 供。 供 試 材 料 分 別 于 年 月 和 年 月 中 旬 播 種， 月 中 旬 定 植 于 江 蘇 省 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 六 合 實 驗 基 地， 至 月 進 行 田 間 取 樣 和 田 間 性 狀 調(diào) 查； 月 上 旬 每 份 材 料 各 選 取 株 移 栽 于 大 棚， 翌 年 至 月 進 行 授 粉 留 種。 . 農(nóng) 藝 性 狀 觀 察 于 葉 球 成 熟 期 對 熟 性、 葉 色、 株 高、 開 展 度、 外 葉 數(shù)、 球 形、 單 球 質(zhì) 量、 球 徑、 中 心 柱 等 農(nóng) 藝 性 狀 按 常 規(guī) 方 法 進 行 調(diào) 查。 . 營 養(yǎng) 品 質(zhì) 測 定 于 葉 球 成 熟 期， 分 別 選 取 大 小 相 近、 成 熟 度 一 致、 無 病 害、 無 創(chuàng) 傷 的 球 葉 和 外 葉， 對 其 主 要 營 養(yǎng) 成 分 維 生 素、 粗 纖 維、 總 糖、 干 物 質(zhì) 含 量 按 常 規(guī) 方 法 進 行 測 定。 每 重 復(fù) 取 株 葉 球 及 相 應(yīng) 外 葉， 次 重 復(fù)。 . 蠟 粉 的 掃 描 電 鏡 觀 察 于 葉 球 成 熟 期， 取 各 材 料 的 外 葉， 避 開 葉 脈 用 直 徑 打 孔 器 進 行 取 樣， 然 后 將 樣 品 置 于 烘 箱 中 干 燥。 烘 干 后， 用 銀 膠 固 定 在 樣 品 臺 上， 噴 金， 置 于 掃 描 電 子 顯 微 鏡 下 觀 察。 . 的 提 取 及 實 時 熒 光 定 量(-) 測 定 于 葉 球 成 熟 期， 取 各 材 料 的 外 葉， 采 用 試 劑 盒( 北 京 百 泰 克 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司) 分 別 提 取 野 生 型 和 突 變 體 材 料 總， 提 取 方 法 參 照 試 劑 盒 說 明 書。 按 照- 要 求 將 反 轉(zhuǎn) 錄 成， 根 據(jù) 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 網(wǎng) 站(:/-./.) 公 布 的 甘 藍 基 因 序 列， 利 用 擬 南 芥 各 個 基 因 序 列 進 行 比 對， 選 擇 同 源 性 較 高 的 保 守 序 列， 使 用. 軟 件 設(shè) 計- 引 物 ( 表)， 以 甘 藍 的 基 因 作 為 內(nèi) 參 基 因。 所 用 染 料 為()， 配 制 的 體 系: (×)、 正 向 引 物(· ).、 反 向 引 物(· ).、 模 板() ， 加 至。 采 用 兩 步 法 熒 光 定 量 進 行 擴 增。 擴 增 程 序: ， 循 環(huán) 次； ， 循 環(huán) 次， 單 點 檢 測 信 號。 熔 解 程 序:， 連 續(xù) 檢 測 信 號。 每 個 樣 品 重 復(fù) 次。 采 用 法 對 數(shù) 據(jù) 進 行 相 對 定 量 分 析。 . 數(shù) 據(jù) 處 理 所 得 數(shù) 據(jù) 采 用. 軟 件 進 行 差 異 顯 著 性 分 析， 在. 水 平 上 進 行 鄧 肯 氏 多 重 比 較。 第 期 石 利 朝， 等: 牛 心 甘 藍 蠟 粉 缺 失 突 變 體 特 征 的 研 究 表 用 于 實 時 熒 光 定 量 的 引 物 - 基 因 甘 藍 基 因 組 序 列 編 號 . 擬 南 芥 中 蛋 白 家 族 名 稱 引 物 對 序 列() 反 式 烯 脂 酰 還 原 酶 -，- / 酰 基 硫 酯 酶 - / 酮 酰 還 原 酶 - / 酰 基 轉(zhuǎn) 移 酶 / 長 鏈 酰 基 合 成 酶 - / 酮 酰 合 成 酶 - / 酰 基 結(jié) 合 蛋 白 - / 囊 泡 轉(zhuǎn) 運 / 轉(zhuǎn) 運 器 / 錨 定 脂 質(zhì) 轉(zhuǎn) 移 蛋 白 - / 類 轉(zhuǎn) 錄 因 子 - / - 類 基 因 - / / / 結(jié) 果 與 分 析 . 突 變 體 與 野 生 型 的 特 征 特 性 由 圖 可 見: 突 變 體 與 野 生 型 表 型 相 比， 除 了 蠟 粉 缺 失 性 狀 外， 其 他 表 型 均 無 明 顯 差 異。 圖 野 生 型 和 突 變 體 表 型 . . 幼 苗 期；. 結(jié) 球 期；. 生 殖 生 長 期 花 序。 .；.；. 對 個 材 料 整 個 生 育 期 的 特 征 特 性 進 行 觀 察 發(fā) 現(xiàn)， 從 苗 期、 營 養(yǎng) 生 長 結(jié) 球 期 至 生 殖 生 長 期， 其 蠟 粉 缺 失 性 狀 均 保 持 穩(wěn) 定； 而 且， 突 變 體 連 續(xù) 自 交 代 后， 未 出 現(xiàn) 蠟 粉 性 狀 分 離 現(xiàn) 象， 說 明 其 蠟 粉 缺 失 性 狀 為 純 合 性 狀。 對 個 材 料 營 養(yǎng) 生 長 結(jié) 球 成 熟 期 的 農(nóng) 藝 性 狀 調(diào) 查 結(jié) 果 顯 示， 突 變 體 與 野 生 型 成 熟 期 ( 定 植 到 葉 球 成 熟 的 時 間) 均 為 左 右， 株 高、 開 展 度、 外 葉 數(shù)、 球 形、 單 球 質(zhì) 量、 球 徑、 中 心 柱 長 等 農(nóng) 藝 性 狀 指 標(biāo) 均 無 顯 著 差 異( 表)。 球 葉 和 外 葉 的 維 生 素 含 量 分 別 為. 和.· ， 而 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 第 卷 球 葉 和 外 葉 的 維 生 素 含 量 分 別 為. 和.· ， 維 生 素 含 量 較 有 顯 著 提 高。 而 在 粗 蛋 白、 粗 纖 維、 總 糖、 干 物 質(zhì) 成 分 含 量 方 面， 二 者 無 明 顯 差 異( 表)。 表 和 農(nóng) 藝 性 狀 調(diào) 查 材 料 株 高/ 開 展 度/ 外 葉 數(shù) . 球 形 葉 色 單 球 質(zhì) 量/ 葉 球 縱 徑/ 葉 球 橫 徑/ 中 心 柱 長/ 中 心 柱 長/ 球 高 / .±. .±. ±. 尖 - 綠 .±. .±. .±. .±. .±. .±. .±. ±. 尖 - 亮 綠 - .±. .±. .±. .±. .±. 注: 同 列 數(shù) 據(jù) 后 不 同 小 寫 字 母 表 示 差 異 顯 著(<.)。 下 同。 :. 表 和 主 要 營 養(yǎng) 成 分 含 量 · 葉 片 材 料 維 生 素 粗 蛋 白 粗 纖 維 總 糖 干 物 質(zhì) 球 葉 .±. .±. .±. .±. .±. .±. .±. .±. .±. .±. 外 葉 .±. .±. .±. .±. .±. .±. .±. .±. .±. .±. . 蠟 粉 性 狀 掃 描 電 鏡 觀 察 掃 描 電 鏡 觀 察( 圖) 表 明， 野 生 型 和 突 變 體 蠟 粉 覆 蓋 度 差 異 顯 著， 與 牟 香 麗 等 、 唐 俊 等 的 研 究 結(jié) 果 一 致。 在 倍 視 野 下， 野 生 型 甘 藍 葉 片 背 面、 腹 面 均 覆 蓋 有 較 多 的 蠟 粉， 且 分 布 致 密； 在 倍 視 野 下， 可 觀 察 到 其 蠟 粉 結(jié) 構(gòu) 為 片 狀 和 線 狀。 而 突 變 體 葉 面 光 滑， 葉 背 面 和 腹 面 均 幾 乎 無 蠟 粉 覆 蓋， 只 有 零 星 顆 粒 狀 結(jié) 構(gòu)。 圖 野 生 型 和 突 變 體 葉 片 腹 面 和 背 面 微 觀 結(jié) 構(gòu) 觀 察 . -. 突 變 體 葉 片 腹 面(×)；. 野 生 型 葉 片 腹 面(×)；. 野 生 型 葉 片 腹 面(×)；. 突 變 體 葉 片 背 面(×)；. 野 生 型 葉 片 背 面(×)；. 野 生 型 葉 片 背 面(×)。 .(×)；.(×)；.(×)；. (×)；.(×)；.(×). 第 期 石 利 朝， 等: 牛 心 甘 藍 蠟 粉 缺 失 突 變 體 特 征 的 研 究 . 蠟 粉 缺 失 性 狀 遺 傳 規(guī) 律 分 析 以 和 為 親 本 構(gòu) 建 世 代 群 體， 正 交 與 反 交 群 體 株 單 株 全 部 表 現(xiàn) 為 葉 面 有 蠟 粉； 群 體 有 蠟 粉 的 植 株 株， 蠟 粉 缺 失 的 植 株 株， 分 離 比 例 為.， 經(jīng) 測 驗 符 合( .< . .) 的 分 離 比 例； 以 有 蠟 粉 的 為 回 交 親 本 獲 得 的 回 交 群 體 中， 株 單 株 全 部 表 現(xiàn) 為 葉 面 有 蠟 粉； 而 與 蠟 粉 缺 失 親 本 回 交 獲 得 的 回 交 群 體 中， 有 蠟 粉 的 植 株 株， 蠟 粉 缺 失 的 植 株 株， 分 離 比 例 為.， 經(jīng) 測 驗 符 合( .< . .) 的 分 離 比 例( 表)。 表 明 的 蠟 粉 缺 失 性 狀 由 隱 性 單 基 因 控 制。 表 世 代 材 料 性 狀 田 間 調(diào) 查 及 測 驗 - 世 代 總 株 數(shù) . 有 蠟 粉 單 株 數(shù) . 無 蠟 粉 亮 綠 單 株 數(shù) . 有 蠟 粉 無 蠟 粉 亮 綠 . () () (×) (×) . . . . . . . 蠟 粉 合 成、 轉(zhuǎn) 運 基 因 的- 分 析 圖 和 相 關(guān) 蠟 質(zhì) 合 成、 轉(zhuǎn) 運 基 因 的 表 達 模 式 分 析 . 篩 選 出 個 在 擬 南 芥 中 參 與 蠟 粉 合 成、 轉(zhuǎn) 運 的 基 因， 對 其 在 野 生 型 和 突 變 體 中 的 表 達 進 行 實 時 熒 光 定 量 分 析。 其 中 、 、 和 為 參 與 表 皮 蠟 質(zhì) 生 物 合 成 的 基 因，、 為 參 與 蠟 質(zhì) 傳 輸 的 基 因，、 為 參 與 蠟 質(zhì) 合 成 和 傳 輸 的 調(diào) 控 基 因。 在 這 個 基 因 中， 中、 的 表 達 高 于 其 野 生 型，、 在 個 材 料 中 表 達 差 異 不 顯 著， 其 余 個 基 因 均 為 高 于， 而 且 均 差 異 顯 著。 討 論 扁 球 類 型 和 圓 球 類 型 的 蠟 粉 缺 失 突 變 體 均 有 報 道 ， 牛 心 類 型 的 蠟 粉 缺 失 突 變 體 為 首 次 報 道。 前 人 研 究 表 明， 蠟 粉 缺 失 突 變 體 營 養(yǎng) 生 長 期 生 長 滯 后， 生 長 勢 小 于 野 生 型； 而 且， 蠟 粉 缺 失 材 料 結(jié) 種 能 力 減 弱， 不 易 結(jié) 籽。 但 本 研 究 中 的 牛 心 突 變 體， 在 營 養(yǎng) 生 長 期 與 生 殖 生 長 期， 除 了 蠟 粉 缺 失 性 狀 外， 在 生 長 勢 和 結(jié) 種 能 力 方 面 與 野 生 型 均 無 明 顯 差 異， 表 明 蠟 粉 缺 失 對 植 株 生 長 發(fā) 育 方 面 產(chǎn) 生 的 影 響 大 小 與 不 同 突 變 體 材 料 有 關(guān)。 在 品 質(zhì) 測 定 中， 突 變 體 球 葉 和 外 葉 的 維 生 素 含 量 高 于 野 生 型。 研 究 表 明 大 部 分 植 物 中 的( 維 生 素) 含 量 與 抗 逆 性 呈 正 相 關(guān)， 可 通 過 提 高 含 量 或 促 進 氧 化 態(tài) 的 還 原 來 提 高 植 物 的 抗 逆 性 。 植 物 表 面 覆 蓋 的 蠟 粉 可 抵 御 外 界 逆 境、 病 蟲 害 等 傷 害， 而 蠟 粉 的 缺 失 使 得 植 物 對 外 部 各 種 逆 境 承 受 力 減 弱， 猜 測 植 物 會 應(yīng) 激 性 調(diào) 動 自 身 的 防 御 系 統(tǒng)， 比 如 提 高 含 量 來 增 強 對 逆 境 的 抵 御。 至 于 蠟 粉 缺 失 是 否 與 甘 藍 含 量 的 變 化 之 間 存 在 某 種 相 關(guān) 性， 還 需 進 一 步 深 入 研 究。 國 內(nèi) 外 關(guān) 于 蕓 薹 屬 蠟 粉 缺 失 性 狀 的 研 究 多 有 報 道。 蕓 薹 屬 作 物 的 蠟 粉 缺 失 性 狀 遺 傳 規(guī) 律 較 為 復(fù) 雜， 不 同 突 變 體 之 間 存 在 多 樣 性， 且 由 不 同 的 基 因 控 制， 其 中 大 多 數(shù) 突 變 體 蠟 粉 缺 失 性 狀 受 單 個 基 因 控 制， 其 中 以 單 基 因 隱 性 遺 傳 最 為 常 見 ， 顯 性 遺 傳 和 不 完 全 顯 性 遺 傳 較 少 ； 少 數(shù) 突 變 體 受 雙 基 因 控 制 。 在 甘 藍 蠟 粉 缺 失 突 變 體 中， 初 蓮 香 等 在 甘 藍 品 種 迎 春 中 發(fā) 現(xiàn) 了 一 株 蠟 粉 缺 失 突 變 體， 對 其 遺 傳 效 應(yīng) 分 析 表 明， 這 一 蠟 粉 缺 失 性 狀 是 由 一 對 隱 性 純 合 基 因 控 制 。 李 景 濤 對 份 圓 球 蠟 粉 缺 失 突 變 體- 和 的 遺 傳 規(guī) 律 進 行 分 析， 結(jié) 果 表 明 這 份 突 變 體 蠟 粉 缺 失 性 狀 均 為 隱 性 單 基 因 遺 傳， 但 其 無 蠟 粉 亮 綠 基 因 位 于 不 同 的 遺 傳 位 點。 其 后 該 研 究 團 隊 又 報 道 了 受 單 基 因 顯 性 控 制 的 無 蠟 粉 材 料 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 第 卷 - 的 發(fā) 現(xiàn) 。 本 試 驗 中， 突 變 體 配 制 的 世 代 群 體 的 分 離 比 例 符 合 單 基 因 隱 性 遺 傳 的 分 離 比 例。 植 物 外 表 皮 蠟 粉 成