甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌WF-3微粉劑的研制及對黃瓜炭疽病的防治效果.pdf

34(5)722-728 中國生物防治學報 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 10 月 收稿日期： 2018-03-23 基金項目：國家重點研發(fā)計劃（ 2016YFD0201000 ） ；中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ CAAS-ASTIP-IVFCAAS） ；農業(yè)部園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室項目 作者簡介： *共同第一作者，謝學文，博士，助理研究員， E-mail： xiexuewencaas.cn；揣紅運，碩士研究生， E-mail： 805724482qq.com； *通信作者，研究員， E-mail： libaojucaas.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.05.011 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3微粉劑的研制及 對黃瓜炭疽病的防治效果 謝學文1*，揣紅運1*，董瑞利1，楊 杰2，石延霞1，柴阿麗1，李寶聚1*（ 1. 中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081； 2. 西藏自治區(qū)農牧科學院，拉薩 850000） 摘要： 以甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 為研究對象，通過對載體、潤濕劑、分散劑、保護劑的篩選，確定了甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌微粉劑的最佳配方。其最佳配方為：白炭黑 10%，潤濕劑 K12 2%，分散劑 NNO 2%，保護劑 CMC 0.5%，煅燒高嶺土 85.5%。測定結果表明，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑含菌量 2.07×1010 cfu/g，分散指數(shù) 83.31%，潤濕時間 11.4 s， pH 6.8，雜菌率 2.6%，含水率 0.98%，細度通過率 98%（ 8.13 m），熱貯分解率為 4.02%，產品各項指標均達到標準。盆栽條件下，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3微粉劑對黃瓜炭疽病的保護效果優(yōu)于治療效果，防效分別為 77.38%和 72.69%。 關 鍵 詞： 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌；微粉劑；黃瓜炭疽??；防治效果 中圖分類號： S476 文獻標識碼 ： A 文章編號： 1005-9261(2018)05-0722-07 Preparation of Micropowder of Bacillus methylotrophicus WF-3 and Its Control Effect on Cucumber Anthracnose XIE Xuewen1*, CHUAI Hongyun1*, DONG Ruili1, YANG Jie2, SHI Yanxia1, CHAI Ali1, LI Baoju1*(1. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2. Tibet Autonomous Regional Academy of Agricultural Sciences, Lasa 850000, China) Abstract: By screening the carriers, wetting agents, dispersing agents and protection agents for Bacillus methylotrophicus WF-3, the optimal formulation were confirmed as follows: the content of filler carbon-white and calcined kaolin, dispersing agent NNO, wetting agent K12 and UV protection agents CMC were 10.0, 85.5%, 2.0%, 2.0% and 0.5%, respectively. The quality detection showed that the spores content of B. methylotrophicus WF-3 micropowder could come up to 2.07× 1010cfu/g, the pH value was 6.8, the rate of heterozygous bacteria was 2.6%, the water content was 0.98%, the fineness rate was 98% ( 8.13 m), the spore dispersion index was 83.31%, dispersing time was 11.4 s, and thermal decomposition rate of storage was 4.02%, which came up to the formulation standard. Pot experiment demonstrated that the protective effects of B. methylotrophicus WF-3 micropowder on cucumber anthracnose was better than the therapeutic effect, and the efficacies were 77.38% and 72.69%, respectively. Key words: Bacillus methylotrophicus; micropowder; Colletrichum orbiculare; biocontrol effect 由半知菌亞門真菌， 葫蘆科刺盤孢菌 Colletotrichum orbiculare sp.引起的黃瓜炭疽病是一種重要的真菌病害，植株染病后，被害葉片干枯，導致成熟期果實開裂，完全喪失商品價值，常造成減產 10% 20%，第 5 期 謝學文等：甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑的研制及對黃瓜炭疽病的防治效果 723 對黃瓜種植產業(yè)影響較大1。隨著設施黃瓜的大量種植，棚室內溫、濕度小氣候環(huán)境十分有利于黃瓜炭疽病病菌的侵染與為害，使得炭疽病逐漸發(fā)展成為設施黃瓜生產的主要病害之一。目前，黃瓜炭疽病仍以化學防治為主，常用的殺菌劑包括嘧菌酯、三環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑等2，但由于該病原菌繁殖速度快，遺傳變異大，突變菌田間適應能力強等原因，對上述殺菌劑已產生了不同程度的抗藥性，使得化學藥劑的防治效果不斷下降，增加了黃瓜炭疽病的防治難度3-5。因此，研發(fā)一種高效、低毒、低殘留，不污染環(huán)境的生物殺菌劑成為近年來的研究熱點。 生防細菌能夠在其生長發(fā)育過程中產生多種拮抗性的代謝產物，直接或間接的達到阻礙或殺死病原菌的效果6。甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 Bacillus methylotrophicus 是 2010 年在水稻根系土壤中首次分離得到，已有大量實踐證明甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌對黃瓜炭疽病、枯萎病、番茄青枯病、灰霉病、煙草黑脛病、香蕉枯萎病及水稻稻瘟病具有較強的抑制作用7-9，但在實用劑型方面研究較少。 微粉劑是在粉劑基礎上發(fā)展起來的一種新劑型，含有原藥、填料或載體、分散劑、潤濕劑以及其他輔助助劑，經氣流粉碎加工技術，使微粉劑粒徑達到 10 m 以下的粉狀制劑。市場上的微粉劑主要有“ DL（ Drift Less）”粉劑和“ FD（ Flow Dust）”粉劑10：即日本在 1979 年首次注冊的一種農藥新型微粉劑（ DL粉劑）和在溫室中使用的一種專門的微粉劑（ FD 粉劑）。微粉劑施藥不需兌水，不會增加棚室濕度，省工省時，安全環(huán)保，提高了農藥利用率，且施藥過程中，無高溫引起的農藥損失，可以實現(xiàn)生物農藥微粉劑的常溫施用。與生物農藥可濕性粉劑、懸浮劑、水分散粒劑等相比，微粉劑粒徑小，分散性強，加工工藝簡單，操作方便且藥劑噴出后通過靜電吸附作用沉積在葉片正背面，提高了對病害的防治效果。關于生物農藥菌劑，目前明亮等11、楊春平等12、趙彥兵等13分別對水分散粒劑、可濕性粉劑、懸浮劑配方進行了篩選， 尚無生物農藥微粉劑配方篩選的相關報道， 更無甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌微粉劑配方篩選的相關研究。甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌微粉劑施用過程中不增加棚室濕度，可以擴大其對病害的防治效果14。本課題組在前期的研究工作中，已從黃瓜根系土樣中分離得到一株對黃瓜炭疽病菌 C. orbiculare 具有較強拮抗活性的菌株 WF-3，并經分子生物學和 16S rDNA 分析鑒定為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 B. methylotrophicus15。本試驗以甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 為有效成分，通過對載體助劑的篩選，確定其微粉劑最佳配方，并測定其防治效果，為將其運用于黃瓜炭疽病的防治提供依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 供試材料 供試菌株： 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 B. methylotrophicus WF-3 為本課題組從連作多年的黃瓜根際土樣中篩選得到16；黃瓜炭疽病菌 C. orbiculare（編號： HG10050502），經鑒定該病原菌具有較強致病力，保存于中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所。 供試藥劑： 25%咪鮮胺（ prochloraz）乳油，江蘇輝豐生物農業(yè)股份有限公司。 供試載體：膨潤土（ Bentonite）、白炭黑（ Silica）、煅燒高嶺土（ Kaolin）、凹凸棒土（ Attapulgite）、滑石粉（ Talc）、硅藻土（ Diatomite），所有載體均由河北石家莊靈壽縣天昊礦產品加工廠提供。 供試助劑： 十二烷基硫酸鈉 （ Sodium dodecyl sulfate， K12） 、 烷基萘磺酸鹽 （ Alkyl naphthalene sulfonate，Morwet EFW）、異丙醛萘磺酸鈉（ Isopropyl aldehyde naphthalene sulfonate， Morwet IP）、酸性烷基硫酸鹽（ Acid alkyl sulfate， W2001）、磺酸鹽（ Sulfonate， W2002）、木質素磺酸鹽（ Lignosulfonate， DM02）、烷基萘磺酸縮聚物 （ Alkylnaphthalene sulfonic acid polycondensate， Morwet D-425） 、 萘磺酸鹽類 （ Naphthalene sulfonate， D10）、聚羧酸鹽類（ Carboxylates， T36）、萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物（ Formaldehyde condensates of sodium naphthalene sulfonate salt， NNO），所有助劑均由南京捷潤科技有限公司提供。 保護劑：抗壞血酸（ Vitamin C， VC）、熒光素鈉（ Fluorescein sodium）、羧甲基纖維素（ Carboxymethyl cellulose， CMC），所有保護劑均由南京捷潤科技有限公司提供。 1.2 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 發(fā)酵液的制備 種子液：將菌株 WF-3 活化后轉接到 pH 為 7.0 的 NB（葡萄糖 10 g、牛肉膏 5 g、蛋白胨 10 g、 NaCl 15 g、蒸餾水 1000 m L， pH 7.0 7.2）液體培養(yǎng)基中，裝液量為 125 mL/250 mL，置于 28 、 126 r/min 振蕩培 724 中 國 生 物 防 治 學 報 第 34 卷 養(yǎng) 24 h。 發(fā)酵液：取 5 mL 菌株 WF-3 種子液轉接到裝液量為 125 mL/250 mL NB 液體培養(yǎng)基中，置于 28 、126 r/min 振蕩培養(yǎng) 48 h，制成芽胞含量為 5× 1010cfu/mL 發(fā)酵液。 1.3 指標測定 pH 測定參照 GB/T1601-1993 農藥 pH 的測定方法進行； 細度測定參照 （ GB/T 16150-1995） 用 BT-9300Z型激光粒度分布儀測定甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌微粉劑的粒徑大小；含水量測定參照（ GB/T 1600-1989）。 參照中華人民共和國農業(yè)部標準 NY/T2293.1-2012（ 5.3），采用平板菌落計數(shù)法，測定制劑的活菌總數(shù)（或芽胞含量），同時稱取 1 g 待測樣品用 10 mL 無菌蒸餾水制成 10 倍稀釋液，取 1.0 mL 稀釋液放入水浴鍋中 80 條件下水浴 15 min，之后冷卻至室溫，用無菌水梯度稀釋至 106倍，取 50 L 涂布于NA 固體培養(yǎng)基 （葡萄糖 10 g、 牛肉膏 5 g、 蛋白胨 10 g、 瓊脂粉 20 g、 NaCl 15 g、 蒸餾水 1000 mL， pH 7.07.2）上于 30 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 36 h 左右，觀察菌落生長情況統(tǒng)計菌落數(shù)并按照公式：芽胞含量（ cfu/g）100× 20×平均每皿菌落數(shù)×稀釋倍數(shù) /10，計算母粉中芽胞含量。 雜菌率測定參照中華人民共和國農業(yè)部標準（ NY/T2293.1-2012）按照芽胞含量測定方法進行測定，選擇 NA 培養(yǎng)基檢測樣品中的細菌雜菌，選擇 PDA 培養(yǎng)基檢測樣品中的真菌雜菌，然后統(tǒng)計總的可見雜菌菌落數(shù)量并按照公式：雜菌率（ %）（細菌雜菌菌落數(shù)的總和真菌雜菌菌落數(shù)的總和） /（細菌雜菌菌落數(shù)的總和真菌雜菌菌落數(shù)的總和有效成分甲基營養(yǎng)性芽胞桿菌菌落數(shù)總和）× 100，計 算雜菌率。 熱貯穩(wěn)定性測定加速貯存實驗（ GB/T 19136-2003）：將 5 g 微粉劑加入到潔凈的安瓿瓶中，用酒精噴燈進行封口，封口后分別稱重。稱重后將封好的安瓿瓶置于 GH-500 型隔水式培養(yǎng)箱中，（ 54± 2）貯存， 14 d 后取出安瓿瓶，稱重測量，并對菌含量進行測定。 載體分散性測定17：稱取定量混合均勻的樣品后過 500 目篩，鋪平到分散器底部，接通電源并開始計時， 30 s 后停止，稱取分散后殘余粉體質量，按照公式分散指數(shù)（ %）（樣品量殘余樣品量） /樣品量× 100，試驗重復 3 次。 浮游指數(shù)17：將混合均勻的樣品在散粉箱內散粉 30 s 后，再將浮游在箱內的粗微粒子捕集到盛水的集塵管內，在波長 610 nm 處測定透光率，按照公式浮游指數(shù) 100透光率。 1.4 載體的篩選 分別稱取膨潤土、白炭黑、煅燒高嶺土等載體 1 kg，每種載體中加入 3 L 芽胞含量為 5× 1010cfu/mL發(fā)酵液進行吸附，自然條件下晾干，制備好的各母粉室溫貯藏。 14 d 后通過測定各制劑的菌落數(shù)，分散指數(shù)，浮游指數(shù)，密度等因素，確定最佳載體。試驗設 3 次重復。 1.5 助劑及復配助劑配比篩選 在制備好的母粉中，分別添加 4%的 K12、 Morwet EFW 等助劑，即制得不同的制劑。測定各制劑的潤濕時間，比較潤濕性能的好壞：潤濕時間越短，潤濕性越好。測定分散性，比較各種制劑的分散效果：分散指數(shù)越高，分散性越好，根據(jù)試驗結果選取最優(yōu)分散劑和潤濕劑。試驗設 3 次重復。 將從助劑中篩選出的分散劑與潤濕劑，分別按質量比 1:9、 2:8、 3:7、 4:6、 5:5、 6:4、 7:3、 8:2、 9:1 比例經研磨機混合均勻，測定分散指數(shù)和潤濕時間，篩選出一種最佳助劑復配組合。 1.6 保護劑的篩選 將菌株 WF-3（菌含量為 5× 1010cfu/mL）的發(fā)酵液與篩選出的載體、助劑按優(yōu)化后的配比吸附晾干，加入 0.5%的保護劑（熒光素鈉、抗壞血酸、羧甲基纖維素）經研磨機混合均勻，稀釋后涂布在 NA 平板上，置于 28 W 紫外燈下，距離 10 cm 處，照射 60 min 后計算芽胞含量18，以不加保護劑作為對照，試驗設 3次重復。 1.7 微粉劑的加工與測定 按照優(yōu)化篩選出的最佳配方配成甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 制劑，經氣流粉碎機（ GYF-100，昆山密友粉碎設備有限公司）超微粉碎后制成微粉劑。采用平板菌落計數(shù)法記錄菌落數(shù)，測定經超微粉碎后的WF-3 微粉劑對芽胞活性的影響。 第 5 期 謝學文等：甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑的研制及對黃瓜炭疽病的防治效果 725 1.8 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑室內盆栽防效 2017 年 8 月在中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所溫室進行盆栽防效測定試驗。使用精量電動彌粉機19測定甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑對黃瓜炭疽病的防治效果。試驗共設 4 個處理：甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑按施藥劑量為 45 kg/hm2噴粉；對照藥劑 25%咪鮮胺乳油按施藥劑量為 112.5 L/hm2噴霧；清水對照。在噴藥前，將噴粉處理的黃瓜苗放置到一個密閉的空間以防止微粉飄散，噴粉結束 4 h 后，將噴粉處理的黃瓜苗與噴霧處理的黃瓜苗放置一起，以保證整個環(huán)境條件一致。 將黃瓜炭疽病菌在 PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1000 mL）上培養(yǎng)22 d，用毛刷將孢子刷下，用血球計數(shù)板調配，獲得 1× 106孢子 /mL 懸浮液。待盆栽黃瓜苗長至 2 4 片真葉時進行藥劑處理， 施藥 2 h 后待葉片表面晾干后采用葉面噴霧的方式接種 1× 106孢子 /mL 黃瓜炭疽病菌孢子懸浮液。接菌后將黃瓜苗放在相對濕度為 95%，溫度 25 30 保濕柜中保濕培養(yǎng) 24 h，之后轉入正常育苗溫室培養(yǎng)，每個處理 4 次重復，每次重復 10 株黃瓜苗。待清水對照充分發(fā)病后，參照 GB/T 17980.112-2004 進行黃瓜炭疽病病情調查。 黃瓜炭疽病病情分級標準： 0 級，無病； 1 級，病斑面積占整片葉面積的 5%以下； 3 級，病斑面積占整片葉面積的 6% 10%； 5 級，病斑面積占整片葉面積的 11% 25%； 7 級，病斑面積占整片葉面積的26% 50%； 9 級，病斑面積占整片葉面積的 50%以上。病情指數(shù) （各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值） /（調查總葉數(shù)× 9）× 100；防治效果（ %）（ CK PT） /CK× 100；發(fā)病率（ %）發(fā)病葉片數(shù) /調查總葉片數(shù)× 100。式中 CK：空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù)； PT：藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)20。 1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 18.0 軟件分析處理， LSD 法做多重比較分析（ P 0.05）。 2 結果與分析 2.1 載體的篩選 載體在制劑中占據(jù)較大比例，因此載體對制劑的理化性質影響很大。白炭黑制劑對甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 芽胞活性影響較小且分散指數(shù)，浮游指數(shù)分別為 96.78%， 64.11；膨潤土、凹凸棒土和滑石粉制劑的芽胞含量較少， 分別為 0.88× 1010、 0.79× 1010和 0.94× 1010 cfu/g。 煅燒高嶺土芽胞含量為 2.12× 1010cfu/g，浮游指數(shù)為 53.22%，透光率為 45.67（表 1）。綜合考慮各制劑的分散性、漂浮性、密度及與菌株的生物相容性，確定最優(yōu)載體為白炭黑和煅燒高嶺土復配，白炭黑用量 10%，煅燒高嶺土用量補足至 100%。 表 1 載體對甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 的影響 Table 1 Effects of filler on WF-3 處理 Treatment 分散指數(shù) Dispersion (%) 浮游指數(shù) Planktonic index (%) 透光率 Transmittance 芽胞含量 Spore content (× 1010cfu/g)凹凸棒土 Attapulgite 80.98± 0.88 c 28.55± 0.78 d 72.67± 0.30 a 0.79± 0.31 a 硅藻土 Diatomite 62.87± 1.10 d 41.88± 0.98 c 57.67± 0.31 b 2.63± 0.15 b 白炭黑 Silica 96.78± 0.48 a 64.11± 2.07 a 34.33± 0.33 d 2.07± 0.25 c 煅燒高嶺土 Kaolin 92.75± 0.31 b 53.22± 1.63 b 45.67± 0.88 c 2.12± 0.37 c 膨潤土 Bentonite 82.22± 0.30 c 31.88± 0.98 d 67.67± 0.32 e 0.88± 0.19 a 滑石粉 Talc 92.78± 1.14 b 35.67± 0.88 e 64.00± 1.53 e 0.94± 0.13 a 注：不同小寫英文字母表示在 0.05 水平上有顯著性差異，下同。 Note: Different small letters indicated significant difference at the 0.05 level. The same below. 2.2 助劑的篩選 由于大部分助劑具有雙重作用，因此本試驗同時篩選樣品的潤濕劑和分散劑。不同助劑對樣品的潤濕性和分散性影響較大， K12、 W2001 的潤濕性較好，潤濕時間都在 10 s 以下，而它們的分散指數(shù)較低，在60%以下； DM02、 D10、 NNO 的分散指數(shù)較高，而它們的潤濕時間較長，都在 60 s 以上（表 2）。綜合考慮，選擇分散劑 NNO 與潤濕劑 K12 復配。 NNO 和 K12 隨著用量的變化而變化，當分散劑與潤濕劑比726 中 國 生 物 防 治 學 報 第 34 卷 例為 5:5 時，分散指數(shù)為 81.61%，潤濕時間為 10 s，隨著助劑用量的增加，潤濕時間與分散指數(shù)在不斷增加，確定最佳配比為 5:5（表 3）。 2.3 保護劑的篩選 當甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌應用到田間時，陽光中的紫外線會削弱活菌體的防治效果，然而保護劑能將陽光中的大部分紫外線吸收掉，將吸收的能量轉化為無害的能量散發(fā)到空氣中21。當紫外照射 60 min 后，選用羧甲基纖維素作保護劑，含菌量均高于抗壞血酸和熒光素鈉，為 1.27× 1010cfu/g，且分散指數(shù)，潤濕時間基本無變化（表 4）。 表 2 助劑對樣品潤濕時間和分散指數(shù)的影響 Table 2 Effect of additives on the wetting time and dispersion of the sample 處理 Treatment 潤濕時間 Wetting time (s) 分散指數(shù) Dispersion (%) 芽胞含量 Spore content (× 1010cfu/g)D10 65.00± 11.02 b 98.20± 0.31 a 1.38± 1.97 b DM02 68.20± 18.02 c 82.26± 0.88 b 1.69± 1.22 a K12 6.40± 5.13 i 54.08± 2.79 g 1.98± 0.48 a Morwet D-425 44.00± 13.66 a 76.56± 0.33 d 1.78± 0.66 a Morwet EFW 49.20± 3.27 f 49.48± 1.06 h 1.83± 0.39 a Morwet IP 17.00± 13.98 g 50.95± 0.85 h 1.98± 1.26 a NNO 71.60± 10.88 d 87.19± 0.30 c 2.17± 0.58 a T36 41.60± 22.36 a 77.60± 0.42 d 1.25± 1.38 b W2001 7.00± 6.78 h 58.81± 0.70 f 1.04± 1.39 c W2002 94.40± 8.82 e 66.89± 1.88 e 2.06± 0.48 a 表 3 助劑復配對樣品潤濕時間和分散指數(shù)的影響 Table 3 Effect of compound additives on the wetting time and dispersion of the sample 質量比 Mass ratio NNO:K12 細度 Fineness ( 10m, %) 潤濕時間 Wetting time (s) 分散指數(shù) Dispersion (%) 芽胞含量 Spore content (× 1010cfu/g) 1:9 100 4.10± 1.23 c 69.17± 0.89 b 1.98± 0.35 a 2:8 100 5.60± 1.93 c 72.06± 1.35 e 2.03± 0.21 a 3:7 100 7.00± 2.00 b 76.02± 0.67 a 2.06± 0.56 a 4:6 100 9.20± 1.63 b 77.04± 1.22 a 2.12± 0.13 a 5:5 100 10.00± 2.00 b 81.61± 0.92 d 2.05± 0.41 a 6:4 100 12.80± 1.36 b 83.10± 0.61 c 1.97± 0.24 a 7:3 100 15.40± 2.70 a 84.63± 0.42 c 1.93± 0.13 a 8:2 100 16.00± 2.85 a 85.31± 0.26 c 1.92± 0.04 a 9:1 100 17.80± 1.66 a 85.61± 0.93 c 1.91± 0.2 a 表 4 保護劑對樣品的影響 Table 4 Effects of protective agent on the sample 照射 60 min 后 After 60 min of irradiation 處理 Treatment 照射前芽胞含量 Spore content (× 1010cfu/g) 潤濕時間 Wetting time (s) 分散指數(shù) Dispersion (%) 芽胞含量 Spore contend (× 1010cfu/g)抗壞血酸 Vitamin C 2.12± 0.13 a 22.00± 0.94 c 78.07± 1.21 b 0.68± 0.13 c 熒光素鈉 Fluorescein sodium 2.04± 0.41 a 15.60± 1.33 b 85.86± 1.67 a 0.98± 1.12 b 羧甲基纖維素 Carboxymethyl cellulose 2.10± 0.19 a 11.40± 1.02 a 83.31± 0.96 a 1.27± 0.45 a 對照 Control 1.94± 0.28 d 30.00± 2.00 d 81.61± 0.92 a 0.32± 0.19 d 2.4 微粉劑的加工與測定 WF-3 制劑經氣流粉碎機超微粉碎制成微粉劑后，細度通過率為 98%（ 8.13 m），采用平板菌落計數(shù)法測定其菌落數(shù)為 2.07× 1010cfu/g，未經粉碎的 WF-3 制劑平均菌落數(shù)為 2.10× 1010cfu/g，處理組和對照組相比無顯著性差異22，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 制劑經超微粉碎后孢子生物活性不受影響。 第 5 期 謝學文等：甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑的研制及對黃瓜炭疽病的防治效果 727 2.5 性能測定 參照中華人民共和國農藥粉劑及凌世海17農藥劑型加工相關檢測方法進行測定，結果顯示制備的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑芽胞含量、 pH、雜菌率、粒徑、含水率、分散指數(shù)、潤濕時間、熱貯分解率均符合標準（表 5）。 表 5 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑主要性能指標 Table 5 Main performance index of B. methylotrophicus WF-3 micropowder 性能指標 Performance 微粉劑標準 Micropowder standard 測定結果 The measurement results 菌量 Amount of bacteria (cfu/g) - 2.07× 1010粒徑 Particle size (D98, m) 10 8.13 含水率 Water content (%) 1.5 0.98 分散指數(shù) Dispersion (%) 20 83.31 潤濕時間 Wetting time (s) 120 11.4 pH 5.5 7.0 6.8 雜菌率 Miscellaneous rate (%) 3 2.6 分解率 Decomposition rate (%) 5 4.02 2.6 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑室內盆栽防效 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑（ 2.07× 1010cfu/g）按施藥劑量為 45 kg/hm2時，噴粉對黃瓜炭疽病的治療效果和保護效果分別為 72.69%和 77.38%；對照藥劑 25%咪鮮胺乳油按施藥劑量為 112.5 L/hm2時，噴霧對黃瓜炭疽病的治療效果和保護效果分別為 87.04%和 81.73%。 WF-3 微粉劑在室內盆栽試驗中對黃瓜炭疽病的保護效果和治療效果均超過 70%，且保護效果優(yōu)于治療效果（表 6）。 表 6 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑對黃瓜炭疽病盆栽防治效果 Table 6 Control effect of B. methylotrophicus WF-3 micropowder against C. orbiculare in pot experiment 治療作用 Protective effect 保護作用 Curative effect 處理 Treatment 濃度 Concentration處理方式 Processing method 病情指數(shù) Disease index防治效果 Control efficacy (%)病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control efficacy (%)甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑 B. methylotrophicus powder 2.0× 1010cfu/g 45 kg/hm2噴粉 14.24 72.69± 2.45 a 12.67 77.38± 1.54 a 25%咪鮮胺乳油 prochloraz EC 112.5 L/hm2噴霧 7.26 87.04± 3.12 b 11.16 81.73± 2.12 a 清水對照 Control - - 61.08 - 56.01 - 3 討論 早在 20 世紀，日本就開始研究農藥微粉劑，微粉劑以其施藥不需兌水，不會增加棚室濕度的獨特優(yōu)勢，在生產上得到了廣泛的應用23；甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 作用方式直接，生物活性強，防治效果好，具有較強的促生長作用，且從 1995 年發(fā)現(xiàn)至今，尚未有對人畜有害的報道24，與其他芽胞桿菌相比，雖然都具有耐高溫、抗輻射等特點，但甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 因其代謝產物的多樣性、對外界環(huán)境因子的多抗逆性和無污染無毒害等優(yōu)點，被廣泛應用于蔬菜病害防治。甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌微粉劑具有較強的空中懸浮效果和葉片附著性，從而對設施蔬菜病害有更好的防治效果。 生防菌的芽胞存活力是決定其最終防效的因素之一，選擇適合的載體和助劑是衡量生物農藥微粉劑最佳配方的首要因素。本試驗所研制的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑芽胞含量為 2.07× 1010 cfu/g，符合芽胞桿菌粉劑含胞量行業(yè)標準（ NY/T2293.1-2012，含胞量指標 1.0× 1010cfu/g）。張金鳳等25將白炭黑和高嶺土復配作為解淀粉芽胞桿菌 41B-1 可濕性粉劑的載體。劉振華等26在載體篩選中，將白炭黑和高嶺土復配作為最終多粘類芽胞桿菌可濕性粉劑的載體；助劑復配使用不僅能提高制劑的分散性，潤濕性，而且能夠增強其防治效果。李學紅等27采用正交試驗設計對甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌可濕性粉劑的助劑進行篩728 中 國 生 物 防 治 學 報 第 34 卷 選，確定其最佳配方，且防治效果達到了 75%以上。然而有關制備生物農藥微粉劑的載體和助劑的研究較少，本研究通過單因素試驗，確定了甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑的最佳載體和助劑，即配方為白炭黑 10%、高嶺土 85.5%、十二烷基硫酸鈉（ K12） 2%、萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物（ NNO） 2%，羧甲基纖維素（ CMC） 0.5%，研究結果與前人結論一致。 在室內盆栽試驗中，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑對黃瓜炭疽病的保護作用優(yōu)于治療作用，防效分別為 77.38%和 72.69%，雖然略低于對照藥劑咪鮮胺的防效，但無顯著性差異，且長期采用化學農藥防治，容易產生抗藥性，增加農藥殘留量，污染環(huán)境；采用生物農藥可濕性粉劑、懸浮劑、水分散粒劑噴霧防治，容易增加棚室濕度，促使病害發(fā)生，導致防治難度進一步加大；采用甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌微粉劑噴粉防治不增加棚室濕度，不利于病害的發(fā)生與流行，不污染環(huán)境，對黃瓜炭疽病具有較好的防治效果。因此，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑可作為防治黃瓜炭疽病的有效藥劑，這也表明甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑在黃瓜炭疽病防治方面具有較廣的應用前景。 參 考 文 獻 1 李春藻 . 農抗 120 防治黃瓜炭疽病和枯萎病 J. 中國生物防治 , 1990, 6(2): 63. 2 韓秀英 , 張小風 , 王文橋 , 等 . 不同殺菌劑對黃瓜炭疽病菌的抑制作用 C/中國植物病害化學防治學術研討會 , 2006. 3 張舒亞 . 嘧菌酯對植物病原真菌的生物活性及抗藥性研究 D. 南京 : 南京農業(yè)大學 , 2002. 4 張傳清 , 周明國 . 間接作用化合物三環(huán)唑防治黃瓜炭疽病的作用機制 J. 中國農業(yè)大學學報 , 2009, 14(3): 49-53. 5 伏波 , 姚娟妮 , 高小寧 ,等 . 植物內生枯草芽孢桿菌 Em7 菌株對葡萄灰霉病菌的抑菌活性 J. 農藥學學報 , 2016, 18(4): 465-471. 6 李長松 . 拮抗性細菌生物防治植物土傳病害的研究進展 J. 中國生物防治學報 , 1992, 8(4):168-172. 7 馮云利 , 奚家勤 , 馬莉 , 等 . 烤煙品種 NC297 內生細菌中拮抗煙草黑脛病的生防菌篩選及種群組成分析 J. 云南大學學報 (自然科學版 ), 2011, 33(4): 488-496. 8 黃霄 , 陳波 , 周登博 , 等 . 菌株 BM-24 的分離鑒定及對香蕉枯萎病菌的抑菌活性 J. 植物保護學報 , 2013, 40(2): 121-127. 9 Shan H, Zhao M, Chen D, et al. 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