短密木霉菌RT-PCR檢測(cè)體系的建立及其在南瓜根際的動(dòng)態(tài)分析.pdf
<p>34(4)574-581 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2018 年 8 月 收稿日期： 2017-12-25 基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（ 2016YFD0201010、 2017YFD0201102） ；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ CAAS-ASTIP-IVFCAAS） ；農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目 作者簡(jiǎn)介： *共同第一作者，謝學(xué)文，博士，助理研究員， Email： xiexuewencaas.cn；程穎超，碩士研究生， Email： 761017740qq.com； *通信作者，博士，研究員， Email： Libaojucaas.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.04.012 短密木霉菌 RTPCR檢測(cè)體系的建立及其在 南瓜根際的動(dòng)態(tài)分析 謝學(xué)文1*，程穎超1*，王 錕1，張紅杰2，楊 杰3，石延霞1，柴阿麗1，李寶聚1*（ 1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081； 2. 河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，張家口 075000； 3. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所， 拉薩 850000） 摘要： 根據(jù)短密木霉菌 31636 ITS 基因序列設(shè)計(jì)特異性引物 TB51F/51R，建立其熒光定量 PCR（ RTPCR）檢測(cè)體系。通過(guò)盆栽試驗(yàn)明確短密木霉菌 31636 對(duì)南瓜疫病的防治效果，并采用 RTPCR 檢測(cè)技術(shù)監(jiān)測(cè)短密木霉菌 31636 與辣椒疫霉菌 LJ12010805 在南瓜根際土中的動(dòng)態(tài)變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用該引物建立的 RTPCR 檢測(cè)體系線(xiàn)性關(guān)系良好，靈敏度為 0.16 pg/µL，是普通 PCR 的 100 倍。采用拌土法接種短密木霉菌 31636 菌懸液 10 mL 育苗對(duì)南瓜疫病的防效最佳，定植后第 15、 30 d 時(shí)防治效果分別為 75.63%和46.82%。 RTPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示基質(zhì)土中短密木霉菌 31636 呈減 增 減的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律， 15 d 時(shí)菌量最大，拷貝數(shù)為 3.44× 106 copys/L；于定植后第 3、 15 d 辣椒疫霉菌 LJ12010805 菌量分別達(dá)到最大、最小值，拷貝數(shù)分別為 2.42× 106 copys/L 和 5.76× 102 copys/L。而對(duì)照的辣椒疫霉菌 LJ12010805 菌量持續(xù)增加，監(jiān)測(cè)的第 30 d 拷貝數(shù)最大，為 8.42× 107 copys/L。 關(guān) 鍵 詞 ：短密木霉菌；南瓜疫?。粺晒舛?PCR；動(dòng)態(tài)變化；防效 中圖分類(lèi)號(hào)： S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ： A 文章編號(hào)： 1005-9261(2018)04-0574-08 Establishment of Real-time Fluorescent Quantitative PCR for Trichoderma brevicompactum and Its Dynamic Change in Pumpkin Rhizosphere XIE Xuewen1*, CHENG Yingchao1*, WANG Kun1, ZHANG Hongjie2, YANG Jie3, SHI Yanxia1, CHAI Ali1, LI Baoju1*(1. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2. School of Agriculture and Forestry Science and Technology, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China; 3. Institute of Vegetable, Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences, Lasa 850000, China) Abstract: A real-time fluorescent quantitative PCR detection assay of Trichoderma brevicompactum 31636 was developed based on a specific primer pair TB51F/51R which were designedbased on the ITS gene. The pot experiment was conducted to determine the control effect of T. brevicompactum 31636 on pumpkin Phytophthora blight, and the dynamic changes of population of T. brevicompactum 31636 and Phytophthora capsici Leonian LJ12010805 in pumpkin rhizosphere soil were monitored by RT-PCR. The result showed that the assay has a good liner relationship with a high sensitivity of 0.16 pg/L DNA, which is 100 times more than that of normal PCR. Inoculation with 10 mL T. brevicompactum 31636 bacterial suspension at sowing stage had a best control effect on pumpkin Phytophthora blight, with the efficacies of 73.11% and 46.82% on the 15th and 30th day, respectively. 第 4 期 謝學(xué)文等：短密木霉菌 RTPCR 檢測(cè)體系的建立及其在南瓜根際的動(dòng)態(tài)分析 575 RT-PCR results showed that dynamic change of T. brevicompactum 31636 in matrix after planting was appeared three distinct phases that were decrease, increase and decrease. The amount of bacteria was the largest on 15th day, with the copy number of 3.44× 106copys/L. On the 3rd after planting, the amount of P. capsici LJ12010805 reached the maximum, then decreased gradually and reached the lowest on 15th day, with the copy number of 2.42× 106copys/L and 5.76× 102 copys/L, respectively. However, P. c a p s i c i LJ12010805 of the control showed an increasing trend, with the highest copy number of 8.42× 107 copys/L on the 30th day. Key words: Trichoderma brevicompactum; pumpkin Phytophthora blight; real-time fluorescent quantitative PCR; dynamic change; control effect 南瓜疫病是由辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici Leonian 引起的一種世界性土傳病害，在南瓜整個(gè)生育期均可感染，為害植物根、莖、葉、果實(shí)，是制約南瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一1。隨著蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展加之農(nóng)民栽培管理方式不當(dāng)，疫病發(fā)生逐年加重，每年給全世界蔬菜產(chǎn)業(yè)造成的損失高達(dá) 10 億美元2。在黑龍江省，由辣椒疫霉菌引起的南瓜疫病所致?lián)p失一般在 10% 30%，流行年份達(dá) 100%3。此外，近些年一些以南瓜為砧木的黃瓜和西瓜的生產(chǎn)栽培也受到影響，而 2012 年研究者對(duì) 19 份南瓜砧木進(jìn)行抗病性鑒定及 RTqPCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)僅 3 份對(duì)南瓜疫病具有抗性4，且目前沒(méi)有真正意義上的抗疫病的南瓜品種。 目前，對(duì)于南瓜疫病的防治，主要是以化學(xué)防治為主，但容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性且造成環(huán)境污染等諸多負(fù)面影響，而生物防治方法較大程度地彌補(bǔ)了上述問(wèn)題。木霉菌 Trichoderma spp.是目前研究最為廣泛且深入的拮抗真菌。生產(chǎn)中的木霉制劑主要以活菌形式存在，在生產(chǎn)中極易受到溫度、濕度、土壤pH 等外界因素的影響，導(dǎo)致其防效表現(xiàn)參差不齊，故深入研究土壤中生防菌與病原菌的互作消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)對(duì)于木霉菌的田間應(yīng)用及進(jìn)一步提高其防治效果顯得尤為重要。傳統(tǒng)的量化生防菌與病原菌動(dòng)態(tài)變化的方法主要包括寄主侵染法6、植物材料誘捕法7、植物殘?bào)w分離法8、土壤團(tuán)粒法9及平板稀釋計(jì)數(shù)法10等，但這些方法相當(dāng)繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，重復(fù)性差11，且并未反映出生防菌與病原菌在同一時(shí)間內(nèi)的變化情況，嚴(yán)重妨礙生防菌的推廣應(yīng)用。而近年來(lái)，熒光定量 PCR 檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于土壤中微生物菌量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)12-16。 基于此，本研究通過(guò)盆栽試驗(yàn)，明確短密木霉菌 T. brevicompactum 31636 對(duì)南瓜疫病的防治效果，并且采用熒光定量 PCR 檢測(cè)技術(shù)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)南瓜根際土中生防菌與病原菌的動(dòng)態(tài)變化，以期為生防菌的田間應(yīng)用以及新型生防制劑的開(kāi)發(fā)提供理論支撐與技術(shù)指導(dǎo)。 1 材料與方法 1.1 供試作物及菌株 1.1.1 供試作物 南瓜，品種為“哈金龍”，其種子購(gòu)自山東壽光豐農(nóng)種業(yè)有限公司。 1.1.2 供試菌株 供試菌株共 11 株（表 1），其中木霉屬菌株 4 株，均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其他常見(jiàn)病害病原菌 7 株，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所菜病綜防組分離保存。 1.2 短密木霉菌 31636 熒光定量 PCR 檢測(cè)體系的建立 1.2.1 菌株培養(yǎng)與 DNA 的提取 供試疫霉菌及瓜果腐霉菌采用燕麥培養(yǎng)基進(jìn)行活化， 3 d 后挑取適當(dāng)大小的菌塊于液體燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)，其他供試菌株于 PDA 培養(yǎng)基活化 3 d 后，挑取適當(dāng)大小的菌塊于 PD 培養(yǎng)基培養(yǎng)。 28 培養(yǎng) 5 d 至有菌絲球出現(xiàn)， 4 層紗布過(guò)濾去除菌液收集菌絲體后于真空冷凍干燥機(jī)凍干，采用改良 CTAB 法提取 DNA17。 1.2.2 引物設(shè)計(jì) 從 GenBank 中下載供試菌株的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ ITS）基因部分序列（登錄號(hào)分別為 EU330943.1， KR296850.1， MG266013.1， AF140045.1， FJ435116.1， HG934415.1， FJ867940.1， KC438411.1，GU258097.1， AY387702.1， AH015115.2），應(yīng)用 MEGA 軟件對(duì)短密木霉菌的 ITS 序列與其他供試菌株 ITS序列進(jìn)行比對(duì)，利用 Primer 6.0 軟件對(duì)其差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性熒光定量 PCR 引物。通過(guò) Blast program（ http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)所設(shè)計(jì)的引物序列與其他生物種屬之間的同源性。引物由北京博邁德基因公司合成后進(jìn)行特異性篩選與評(píng)價(jià)。 576 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 表 1 供試菌株信息 Table 1 Isolates used in the test 序號(hào) Number 菌株編號(hào) Isolate code 病原菌 Pathogen 引起病害 Disease 1 31636 短密木霉菌 Trichoderma brevicompactum 生防菌 2 T22 哈茨木霉菌 Trichoderma harzianum 生防菌 3 31642 擬康寧木霉菌 Trichoderma koningiopsis 生防菌 4 Itr-2 綠色木霉菌 Trichoderma viride 生防菌 5 HG1601060103-4 灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 灰霉病 6 KXC151218030602 立枯絲核菌 Rhizoctonia solani 立枯病 7 FQ15051822 茄病鐮刀菌 Fusarium solani 根腐病 8 XG11012402 瓜果腐霉菌 Pythium aphanidermatum 猝倒病 9 FQ09092001 致病疫霉菌 Phytophthora infestans 晚疫病 10 HG15060516 尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum 枯萎病 11 LJ12010802 辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici 疫病 1.2.3 普通 PCR 檢測(cè)引物特異性 以短密木霉菌 31636 以及其他 10 種對(duì)照菌株基因組 DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增?？傮w系為 20 L，其中 2× Taq PCR Master Mix 10 L，上下游引物各 0.2 L， DNA 模板 1 L，ddH2O 補(bǔ)足至 20 L。反應(yīng)程序： 94 預(yù)變性 3 min； 94 變性 30 s， 58 退火 30 s， 72 延伸 30 s，共 35 個(gè)循環(huán)； 72 補(bǔ)充延伸 5 min。 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。 1.2.4 熒光定量 PCR 檢測(cè)引物特異性 以短密木霉菌 31636 以及其他 10 種對(duì)照菌株基因組 DNA 為模板進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增?？傮w系為 20 L，其中 2× SuperReal PreMix Plus 10 L，上下游引物各 0.2 L， DNA模板 1 L， 50× ROX Reference Dye 0.4 L， ddH2O 補(bǔ)足至 20 L。反應(yīng)程序： 95 預(yù)變性 10 min， 95 變性 15 s， 60 退火 32 s，共 40 個(gè)循環(huán)。在升溫時(shí)收集熒光信號(hào)，檢測(cè)引物特異性。 1.2.5 普通 PCR 與熒光定量 PCR 檢測(cè)引物靈敏度 采用離心柱型瓊脂糖凝膠回收試劑盒 （北京天根公司）對(duì)短密木霉菌 31636 特異性擴(kuò)增的 180 bp 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，回收產(chǎn)物連接到載體 pMD18T Vector上后轉(zhuǎn)入到 50 L TransT1 感受態(tài)細(xì)胞中， 37 ， 200 r/min 培養(yǎng) 2 h，涂 LB 平板過(guò)夜，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒 DNA 后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并送至北京博邁德公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得質(zhì)粒 DNA 的初始濃度為 1.0× 104 pg/µL，按 10 倍梯度稀釋 10 個(gè)濃度后分別進(jìn)行普通 PCR 擴(kuò)增和 RTPCR 擴(kuò)增以檢測(cè)引物靈敏度。 1.2.6 熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 陽(yáng)性克隆質(zhì)粒 DNA（濃度為 1.0× 104 pg/µL）以 10 倍梯度稀釋 8 個(gè)濃度，以不同稀釋倍數(shù)的 DNA 為模板，構(gòu)建 RTPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，每個(gè)反應(yīng) 3 次重復(fù)。反應(yīng)體系及程序同1.2.4。以模板 DNA 濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)循環(huán)數(shù)（ CT）值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 1.3 短密木霉菌 31636 與辣椒疫霉菌 LJ12010805 在南瓜根際的動(dòng)態(tài)分析 1.3.1 南瓜催芽育苗 選取飽滿(mǎn)的南瓜種子于 55 溫水中浸泡 4 h，完成后，把種子放入底部鋪有紗布的保濕盒中，置于 28 溫箱中催芽，當(dāng)胚根長(zhǎng)至 1.0 cm 時(shí)采用 5 cm× 5 cm 的穴盤(pán)育苗。育苗時(shí)采用拌土法接種短密木霉菌 31636 菌懸液（濃度為 1× 108 cfu/mL），每穴分別接入 10 mL， 20 mL， 30 mL 菌懸液，3 次重復(fù)，每次重復(fù) 20 株。對(duì)照藥劑采用 50%烯酰嗎啉可濕性粉劑（ 250 ppm）。 1.3.2 辣椒疫霉菌擴(kuò)繁與接種 參照許亞池等18的方法，將供試?yán)苯芬呙咕鷫K轉(zhuǎn)接于 5% V8 培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng) 5 d 后，加入 10 mL 無(wú)菌水并進(jìn)行光照處理 5 d，誘導(dǎo)孢子囊釋放游動(dòng)孢子并調(diào)至最適宜接種發(fā)病的濃度 1× 104 cfu/mL3備用。 1.3.3 南瓜疫病病指調(diào)查及防效計(jì)算 待南瓜長(zhǎng)至適當(dāng)株高后將其定植于裝有已接種辣椒疫霉菌LJ12010805 菌土的營(yíng)養(yǎng)缽中，于定植后 15 d， 30 d 分別調(diào)查各處理病情指數(shù)，計(jì)算防效。 病害調(diào)查采用南瓜疫病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)： 0 級(jí)：無(wú)??； 1 級(jí)：莖上出現(xiàn)些微水漬狀的病斑； 2 級(jí)：莖上病斑擴(kuò)展，但不超過(guò)株高 1/4，不萎蔫； 3 級(jí)：病部超過(guò)整株 1/4，向下延伸至根部不超過(guò)株高 3/4，莖基部輕微萎蔫； 4 級(jí)：病部超過(guò)整株或蔓延至全株，包括根和葉柄，莖基部嚴(yán)重溢縮，葉片枯萎，已死亡。采用 SPSS 第 4 期 謝學(xué)文等：短密木霉菌 RTPCR 檢測(cè)體系的建立及其在南瓜根際的動(dòng)態(tài)分析 577 18.0 進(jìn)行差異顯著分析， P 0.05。病情指數(shù) （各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)別） /（調(diào)查總株數(shù)×最大級(jí)數(shù)）×100；防治效果（ %）（空白對(duì)照病情指數(shù)處理病情指數(shù)） /空白對(duì)照病情指數(shù)× 100。 1.3.4 熒光定量 PCR 檢測(cè)體系檢測(cè)生防菌與病原菌的動(dòng)態(tài)變化 于定植后的 0、 1、 3、 5、 7、 15 和 30 d 分別取樣。取樣時(shí)距南瓜莖基部橫向距離及縱向深度均為 2 cm，三點(diǎn)取樣后混合為 1 份樣品，而后用錫箔紙包裹快速凍干。稱(chēng)取 0.2 g 樣品，采用離心柱型土壤基因組 DNA 提取試劑盒提取 DNA。分別利用已建立的RTPCR 檢測(cè)體系檢測(cè)土壤樣品中短密木霉菌 31636 及辣椒疫霉菌 LJ12010805（ Y 41.026 3.7026X）19的動(dòng)態(tài)變化。 根據(jù)以下公式分別計(jì)算供試菌株的平均分子質(zhì)量和樣品拷貝數(shù)20： M（ n× mw） /AN，其中， n 表示基因組包含的堿基數(shù)目（× 106bp）， mw 表示單個(gè)堿基的平均分子質(zhì)量（ 660 g/mol）， AN 表示阿伏伽德羅常數(shù)（ 6.023× 1023molecules/mol）， M 表示基因組的平均分子質(zhì)量。 N C/M，其中， N 表示樣品的拷貝數(shù)， C 表示 DNA 濃度， M 表示基因組 DNA 的平均分子質(zhì)量。 2 結(jié)果與分析 2.1 短密木霉菌 31636 熒光定量 PCR 檢測(cè)體系的建立 2.1.1 短密木霉菌 31636 PCR 引物設(shè)計(jì)及特異性驗(yàn)證 采用引物 TB51F/51R（其序列為 TB51F：5CTTCAAGTATGCGTGGGT3， TB51R： 5GCGTCTGCGTGAGGTT3）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，僅短密木霉菌 31636 DNA 在 180 bp 處有特異性擴(kuò)增，其他對(duì)照菌株和陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增條帶（圖 1），表明引物特異性良好。且所用序列在 GeneBank 比對(duì)，與其他種屬菌株均無(wú)同源性。 注： 1 2 為短密木霉菌 T. brevicompactum； 3：哈茨木霉菌 T. harzianum； 4：擬康寧木霉菌 T. koningiopsis； 5：綠色木霉菌 T. viride； 6：灰葡萄孢菌 B. cinerea； 7：立枯絲核菌 R. solani； 8：茄病鐮刀菌 F. solani； 9：瓜果腐霉菌 P. aphanidermatum； 10：致病疫霉菌 P. infestans； 11：尖孢鐮刀菌F. oxysporum； 12：辣椒疫霉菌 P. capsici； N：陰性對(duì)照 ddH2O Negative control ddH2O 圖 1 短密木霉菌引物特異性普通 PCR 篩選結(jié)果 Fig. 1 The screening result of T. brevicompactum specific primer by normal PCR 2.1.2 熒光定量 PCR 檢測(cè)短密木霉菌 31636 引物特異性 引物 TB51F/51R 對(duì)短密木霉菌 31636DNA 擴(kuò)增良好（圖 2），溶解曲線(xiàn)在 85 處有單一峰值（圖 3），無(wú)非特異性擴(kuò)增及引物二聚體現(xiàn)象。 2.1.3 普通 PCR 和熒光定量 PCR 檢測(cè)引物靈敏度 將質(zhì)粒 DNA 稀釋為 1.6× 105 pg/L 1.6× 104 pg/L的濃度梯度，并分別進(jìn)行普通 PCR 和 RTPCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果表明， TB51F/51R 及所建立的 PCR 反應(yīng)體系對(duì) 16pg/L 1.6× 104 pg/L 濃度范圍的 DNA 有擴(kuò)增，即普通 PCR 的靈敏性為 16 pg/L（圖 4）；而RTPCR 對(duì) 0.16pg/L 1.6× 104 pg/L 濃度范圍的 DNA 均有擴(kuò)增，即 RTPCR 檢測(cè)引物的靈敏性為0.16 pg/L（圖 5）。 RTPCR 較普通 PCR 靈敏度高 100 倍。 2.1.4 短密木霉菌 31636 熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立 將重組質(zhì)粒 DNA 以 10 倍梯度稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋濃度分別為 1.6× 103 pg/L 1.6× 104 pg/L，以不同稀釋倍數(shù)的 DNA 為模板，構(gòu)建 RTPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以質(zhì)粒 DNA 濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，反應(yīng)循環(huán)數(shù)（ CT）值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖 6）。得到該體系線(xiàn)性關(guān)系良好（ Y 3.5854X 35.608），相關(guān)系數(shù) R2值 0.98，擴(kuò)增效率 90.07%。 578 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 Rn圖 2 熒光定量 PCR 檢測(cè)引物特異性（擴(kuò)增曲線(xiàn)） Fig. 2 Detection of primer-specific by RT-PCR (Amplification curve) 熒光強(qiáng)度變化-RnDerivative reporter0.050.100.150.400.200.250.300.35065 7075 8085 90 95溫度 Temperature ( )短密木霉菌T. brevicompactum對(duì)照菌株Control (ddH2O)圖 3 熒光定量 PCR 檢測(cè)引物特異性（溶解曲線(xiàn)） Fig. 3 Detection of primer-specific by RT-PCR (Melt curve) N109 87 6543 21M250 bp100 bp注： M， BM 5000 DNA Marker，從右向左 1 4 分別為 1.6× 104 1.6× 10pg/µL，編號(hào) 5 10 及陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增現(xiàn)象。 Note: M, BM 5000 DNA Marker; From right to left, 1 4 concentrations were 1.6× 104pg/L to 16 pg/L, with no amplification of numbers 5 10 and negative control. 圖 4 普通 PCR 檢測(cè)引物靈敏性 Fig. 4 Sensitivity of normal PCR using the TB51F/51R primer pair Rn注：從左向右 1 6 分別為濃度 1.6× 104 1.6× 101 pg/µL， 7 10 及陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增現(xiàn)象。 Note: From left to right, 1 6 concentrations were 1.6× 104 1.6× 101 pg/µL, with no amplification of numbers 7 10 and negative control. 圖 5 熒光定量 PCR 檢測(cè)引物靈敏性 Fig. 5 Sensitivity of RTPCR using the TB51F/51R primer pair 2.2 短密木霉菌 31636 與辣椒疫霉菌在南瓜根際的動(dòng)態(tài)分析 2.2.1 短密木霉菌 31636 對(duì)南瓜疫病的防治效果 采用短密木霉菌 31636 菌懸液 10 mL 拌土育苗對(duì)南瓜疫病的防效最好（表 2）。定植后第 15 d、 30 d 時(shí)防治效果分別為 75.63%和 46.82%，且均顯著優(yōu)于其他處理（ P 0.05）。 第 4 期 謝學(xué)文等：短密木霉菌 RTPCR 檢測(cè)體系的建立及其在南瓜根際的動(dòng)態(tài)分析 579 Y = -3.5854X+35.608R2= 0.982805101520253035-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1DNA濃度對(duì)數(shù) LogDNA循環(huán)數(shù)CT圖 6 短密木霉菌 31636 熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) Fig. 6 Real-time fluorescence quantitative standard curve of T. brevicompactum 31636 表 2 短密木霉菌 31636 防治南瓜疫病的盆栽試驗(yàn)結(jié)果 Table 2 The result of the pot experiment that using T. brevicompactum 31636 to control pumpkin Phytophthora blight 防治效果 Control effect (%) 編號(hào) Number 處理 Treatment 濃度 Concentration 第 15 d The 15th day 第 30 d The 30th day 1 短密木霉菌 T. brevicompactum 10 mL 1× 108 cfu/mL 75.63 a 46.82 A 2 短密木霉菌 T. brevicompactum 20 mL 1× 108 cfu/mL 50.42 b 8.09 D 3 短密木霉菌 T. brevicompactum 30 mL 1× 108 cfu/mL 49.58 c 8.67 C 4 50%烯酰嗎啉 dimethomorph WP 250 ppm 50.42 b 27.17 B 注：同列不同字母表示經(jīng) LSD 法檢驗(yàn)在 0.05 水平差異顯著。 Note: Different letters in the same column indicated significant difference at 0.05 levels by LSD test. 2.2.2 熒光定量 PCR 檢測(cè)體系檢測(cè)生防菌與病原菌的動(dòng)態(tài)分析 南瓜育苗時(shí)采用拌土法接種短密木霉菌31636 菌懸液，待南瓜長(zhǎng)至適當(dāng)株高后將其定植于裝有已接種辣椒疫霉菌 LJ12010805 菌土的營(yíng)養(yǎng)缽中，于定植后的 0、 1、 3、 5、 7、 15 和 30 d 分別取樣，檢測(cè)土壤中短密木霉菌 31636 及辣椒疫霉菌 LJ12010805菌量的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，南瓜定植時(shí)短密木霉菌 31636 及辣椒疫霉菌 LJ12010805 的起始拷貝數(shù)分別為 1.36× 104 copys/L 和 9.98× 103copys/L，此后短密木霉菌 31636 菌量呈現(xiàn)減 增 減的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，第 15 d 時(shí)菌量最大，拷貝數(shù)為 3.44× 106 copys/L；處理組辣椒疫霉菌 LJ12010805 第 3 d 菌量最大，拷貝數(shù)為 2.42× 106 copys/L，第 15 d 時(shí)達(dá)到最低，拷貝數(shù)相應(yīng)地減小到 5.76× 102 copys/L。而對(duì)照的辣椒疫霉菌 LJ12010805 菌量則呈一直增加的趨勢(shì)，監(jiān)測(cè)的第 30 d 拷貝數(shù)最大，為 8.42× 107 copys/L（圖 7）。 拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值log copy number圖 7 RTPCR 監(jiān)測(cè)南瓜根際土中短密木霉菌 31636 與辣椒疫霉菌 LJ12010805 動(dòng)態(tài)變化 Fig. 7 The dynamic changes of population of T. brevicompactum 31636 and P. capsici LJ12010805 in pumpkin rhizosphere soil monitored by RTPCR 580 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 3 討論 木霉菌屬半知菌亞門(mén)、絲孢綱、叢梗孢目、叢梗孢科，其具有較高的幾丁質(zhì)酶活性、生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)。據(jù)部分資料統(tǒng)計(jì)，其寄生范圍至少涵蓋植物病原菌的 18 個(gè)屬中的 29 個(gè)種21，對(duì)黃瓜枯萎病、立枯病22、水稻紋枯病23，中藥材根腐病24、馬鈴薯晚疫病25等防效很好。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)拮抗木霉菌的研究，大多集中在哈茨木霉菌、綠色木霉菌等少數(shù)種，且大田應(yīng)用中效果極不穩(wěn)定，而本研究中報(bào)道的短密木霉菌26對(duì)南瓜疫病的防治效果在 15 d 和 30 d 時(shí)分別高達(dá) 75.63%和 46.82%， 可以進(jìn)一步應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上南瓜疫病的防治。 眾所周知，深入研究土壤中生防菌和病原菌的互作及種群生態(tài)學(xué)變化，對(duì)發(fā)展植病生防理論和進(jìn)一步提高生防菌的防效具有重要意義27。然而，長(zhǎng)期以來(lái)，由于缺乏快速、靈敏、準(zhǔn)確的定量測(cè)定方法，這方面的研究始終受到阻礙，且不能及時(shí)反映出植物根際土中病原菌與生防菌的同期數(shù)量變化。近年來(lái)，熒光定量 PCR 檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于土壤中生防菌與病原菌的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)28-30。本研究中，通過(guò)設(shè)計(jì)并篩選出短密木霉菌 31636 特異性引物 TB51F/51R， 首次建立其熒光定量 PCR 檢測(cè)體系， 且檢測(cè)下限低至 0.16 pg/µL，較普通 PCR 而言靈敏度提高了 100 倍， 可實(shí)現(xiàn)土壤中短密木霉菌 31636 的快速、 特異、 準(zhǔn)確且定量的檢測(cè)，為后期其動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。 利用所建立的 RTPCR 檢測(cè)體系監(jiān)測(cè)土壤中生防菌與病原菌的動(dòng)態(tài)變化，分析表明 30 d 內(nèi)南瓜根際基質(zhì)土中的短密木霉菌 31636 菌量呈現(xiàn)減 增 減的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，且第 15 d 時(shí)菌量達(dá)到最大值，這與這與張衡宇31關(guān)于哈茨木霉菌（菌株編號(hào)為 FJAT9295）接種后 4 d 開(kāi)始在土壤中定殖，從第 16 d 起其優(yōu)勢(shì)力逐漸降低，數(shù)量逐漸減少的報(bào)道相一致。結(jié)合盆栽試驗(yàn)，短密木霉菌 31636 與辣椒疫霉菌 LJ12010805 菌量分別達(dá)到最大、最小值時(shí)防效為 75.63%，而后隨著短密木霉菌 31636 與辣椒疫霉菌 LJ12010805 的互作消長(zhǎng)變化，防效也逐漸削弱至第 30 d 的 46.82%，這與之前關(guān)于哈茨木霉菌 SH2303 防治玉米小斑病的持效期僅為 15 d32，哈茨木霉菌 PSn86 防治人參灰霉病第 14 d 時(shí)防效最高33，后逐漸降低的研究結(jié)果相吻合。因此可以利用熒光定量 PCR 檢測(cè)體系測(cè)得土壤中生防菌與病原菌的 DNA 拷貝數(shù)后推測(cè)生防菌的防效，從而為其田間應(yīng)用提供理論參考。 參 考 文 獻(xiàn) 1 Elmer W H. Fusarium fruit rot of pumpkin in ConnecticutJ. Plant Disease, 1996, 80(2): 131. 2 Lamour K H, Stam R, Jupe J, et al. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsiciJ. Molecular Plant Pathology, 2012(13): 329-337. 3 劉學(xué)敏 , 劉昌洲 . 接種體和接種部位對(duì)南瓜疫病接種效果的影響 J. 植物保護(hù)學(xué)報(bào) . 1999, 26(1): 95-96. 4 Kousik C S, Donahoo R S, Hassell R. Resistance in watermelon rootstocks to crown rot caused by Phytophthora capsiciJ. Crop Protection, 2012, 39(5): 18-25. 5 Hagn A, Wallisch S, Radl V, et al. A new cultivation independent approach to detect and monitor common Trichoderma species in soilsJ. Journal of Microbiological Methods, 2007, 69(1): 86-92. 6 Davey C B, Papavizas G C. Comparison of methods for isolating Rhizoctonia from soilJ. Canadian Journal of Microbiology, 1962, 8(6): 847-853. 7 Papavizas G C. Ecology and epidemiology of Rhizoctonia solani in soilJ. Phytopathology, 1975, 65(8): 871-877. 8 Ahc V B, Ameson P A. Quantitative recovery of Rhizoctonia solani form soilJ. Plant Diseases, 1986, 70(4): 320-323. 9 Castro C J, Davis J R, Wiese M V. Quantitative estimation of Rhizoctonia solani AG-3 in soilJ. Phytopathology, 1988, 78(10): 1287-1292. 10 Janet L C, Michael J B, James M L. Interactions between Fusarium culmorum and its potential biocontrol agent, Trichoderma harzianum, in a packed-bed, continuous-flow column reactorJ. Enzyme and Microbial Technology, 1997, 21(5): 321-326. 11 Sariah M,</p>
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