紅提葡萄灰霉病8株不同生防菌的篩選及鑒定

<p>2019年第2期現(xiàn)代園藝由灰葡萄孢菌侵染引起的葡萄灰霉病每年可造成葡萄高達50%的產后損失。用生物防治的手段來控制灰霉病己經逐漸發(fā)展成為一條重要且有潛力的防治途徑。本研究針對寧夏當?shù)爻Ｒ姷募t提葡萄發(fā)病的果實中分離病原菌灰葡萄孢菌，并從葡萄根際表面土壤中對灰霉病病原菌的拮抗菌株進行了初步篩選，得到了8株拮抗效果較好的拮抗菌，為紅提葡萄灰霉病的生物防治提供有力的菌種支持。1 材料與方法1.1 材料春季對寧夏永寧縣小任果業(yè)、銀川能源學院種植基地、銀川市西夏區(qū)軍馬場周邊葡萄園和寧夏農業(yè)學校葡萄種植基地6個不同地區(qū)紅提葡萄根際土壤取樣，每個取樣地采5個樣本，將5個點的土壤混勻后，取50mg3次重復保存共18份樣品進行分離。1.2 方法1.2.1 葡萄灰霉病病原菌的分離。紅提葡萄病果表面用10%次氯酸鈉溶液浸泡3min后，無菌水沖洗3次，切取若干塊分別接種在PDA培養(yǎng)基上，22培養(yǎng)12d后，挑選與灰葡萄孢菌形態(tài)相似的單菌落，接到新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直到菌落表現(xiàn)均勻一致為止。將純化后的灰霉病菌株標記為“JD2016- 8”且接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，22下培養(yǎng)3d后放到4冰箱保藏。1.2.2 葡萄灰霉病菌拮抗菌的分離。稱取土壤10g加入90mL充分混勻，制成10-1土壤懸浮液，依次加無菌水稀釋制成10-210-6濃度梯度系列土壤懸液，分別取200L涂布于清蛋白固體培養(yǎng)基上，每處理重復3皿。1.2.3 葡萄灰霉病菌拮抗細菌、放線菌、霉菌以及酵母菌的分離培養(yǎng)和純化保存。將上述涂布接種完畢的培養(yǎng)皿，倒置28恒溫培養(yǎng)，24d開始挑菌，一直培養(yǎng)10d。細菌分離在培養(yǎng)2448h開始，將單菌落轉接到NA培養(yǎng)基上，純化培養(yǎng)2次后斜面4保存。放線菌分離在培養(yǎng)5d開始，將單菌落轉接到高氏一號固體培養(yǎng)基進行平板劃線培養(yǎng)，一般純化培養(yǎng)14d，待生長成熟后終止培養(yǎng)，4保存?zhèn)溆?。霉菌分離在培養(yǎng)3d開始，將單菌落轉接到PDA固體培養(yǎng)基進行平板劃線培養(yǎng)，純化培養(yǎng)23次后于4保存。酵母菌分離在培養(yǎng)3d開始，將單菌落轉接到YPD固體培養(yǎng)基進行平板劃線培養(yǎng)，純化培養(yǎng)23次后于4保存。1.2.4 葡萄灰霉病菌拮抗真菌的篩選。將灰霉病病原菌在直徑9cmPDA固體培養(yǎng)基上活化，沿菌落邊緣用直徑5mm打孔器打孔，將菌餅置于空白PDA平板中央。培養(yǎng)皿四周呈“十”字形點接獲得的各拮抗菌液（108CFU/mL），距培養(yǎng)皿中心30mm，每處理重復3皿，設不接種菌液的相應空白液體培養(yǎng)基處理為對照。28恒溫培養(yǎng)7d，觀察菌株的抑菌效果，對其在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)進行初步的形態(tài)學鑒定。1.2.5 灰霉病孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制試驗。取葡萄灰霉病孢子懸浮液（106個 /mL）20L，加20L拮抗菌發(fā)酵液，以0.5%葡萄糖液作對照，置無菌潔凈載玻片上，28培養(yǎng)8h后觀察孢子萌發(fā)，計算拮抗菌發(fā)酵液對病菌孢子萌發(fā)的抑制率；取灰霉病菌孢子懸浮液0.5mL加入PDA培養(yǎng)基中。將直徑為5mm滅菌濾紙片蘸上發(fā)酵液，以無菌水作對照，28恒溫培養(yǎng)3d后測量抑菌圈直徑，計算拮抗菌發(fā)酵液對菌絲生長的抑制率。3 結果3.1 病原菌的篩選和鑒定從感染灰霉病的紅提葡萄果實表面，分離純化出1株病原菌，命名為JD2016- 8。此菌株在PDA培養(yǎng)基上可以正常生長，生長溫度為22。菌絲生長初期為灰白色，貼著培養(yǎng)基生長，生長速度較快，5d左右可長滿培養(yǎng)皿，顯微鏡下觀察，病原菌分生孢子梗為灰褐色，有隔膜，頂端膨大，其上著生大量分生孢子，形似葡萄穗狀，分生孢子為單孢，近圓形或橢圓形，無色或淡色。按照真菌鑒定手冊，初步確定了JD2016- 8為灰葡萄孢菌。以病原菌JD2016- 8基因組DNA為模板，利用真菌通用擴增引物 ITS1（F）和ITS4（R）對病原菌 JD2016- 8進行 PCR擴增，目的條帶并進行回收純化測序，該菌的ITS序列測序結果在NCBI上進行比對分析，結合形態(tài)特征和ITS序列分析，確定是灰葡萄孢菌。3.2 拮抗菌篩選結果經過對所采集的18份土壤樣品進行梯度稀釋法分離，共篩選得到了64株不同菌株，其中細菌有20株，分離率占31.25%；放線菌有19株，分離率占29.69%；霉菌有15株，分離率占23.44%；酵母菌有10株，分離率占15.63%。采用平板對峙法對分離得到的上述64株不同菌株進行拮抗性復篩，只有8株菌株表現(xiàn)出對灰霉病菌有抑制作用。其中，得到1株高效拮抗菌SW- W8，其發(fā)酵濾液抑菌圈直徑達25.5mm，其對葡萄灰霉病病菌孢子和菌絲的抑菌率分別為 100%和紅提葡萄灰霉病8株不同生防菌的篩選及鑒定趙海霞1孟慶月2李 濤1（1銀川能源學院化學與生物工程學院；2寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏 永寧 750100）摘 要：將從紅提葡萄病果表面成功分離的灰霉病病原菌灰葡萄孢菌作為指示菌，通過平板對峙法、孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制試驗，篩選得到8株不同種屬的拮抗菌。關鍵詞：灰霉??；拮抗菌基金項目：銀川能源學院（銀川大學）科學技術研究項目（2013- KY- Z- 13）、寧夏區(qū)級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（NXCX2015364）資助。作者簡介：趙海霞（1985-），女，碩士，講師，主要從事微生物資源與開發(fā)方向的教學與科研工作。E- mail：zhaohx0216163.com。試驗研究4- -DOI:10.14051/j.cnki.xdyy.2019.04.0012019年第2期 現(xiàn)代園藝13.17%。在復篩過程中，隨培養(yǎng)時間延長，菌株SW- W8對病原菌的拮抗作用幾乎不變。3.3 拮抗菌初步鑒定結果3.3.1 拮抗細菌：菌株NX- X3、JM- X8、JM- X17均在NA平板上生長，單菌落呈近圓形，邊緣整齊，半透明，表面光滑，中間有突起，近白色。革蘭氏染色結果表明，該菌株為革蘭氏陽性，芽孢呈橢圓形中生，菌體不具抗酸性，可產生異染粒，菌體生長物向四周呈云霧狀擴散。綜合菌株的形態(tài)特征和生理生化特性，對照伯杰氏細菌鑒定手冊和常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊進行檢索，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。3.3.2 拮抗放線菌：光學顯微鏡觀察結果表明，菌株NY- F5、SW- F9基內菌絲無橫隔，不斷裂，氣生菌絲多分枝；孢子絲長，頂端呈23圈螺旋狀，分生孢子圓柱形。初步判斷菌株NY- F5、SW- F9菌體形態(tài)符合鏈霉菌屬特征，結合形態(tài)特征及參照鏈霉菌鑒定手冊方法進行，參照放線菌的分類和鑒定初步鑒定為鏈霉菌。3.3.3 拮抗霉菌：菌株NX- M2、JM- M6通過光學顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)菌絲生長緩慢，初期菌落表面平鋪，菌落稀疏，成熟區(qū)分生孢子區(qū)白色至灰綠色，菌絲無色，壁平滑，頂端不孕菌絲鞭狀，粗而長，厚垣孢子形成于菌絲交結處，偶爾在菌絲末端，分生孢子梗簇生。結合形態(tài)學特征，參照真菌鑒定手冊初步鑒定為木霉菌。3.3.4 拮抗酵母菌：菌株SW- W8菌落為圓形、白色、不透明，表面光滑濕潤，中間隆起，邊緣整齊，不產生可溶性色素。通過光學顯微鏡觀察菌體形態(tài)初步確定為酵母菌。4 討論與展望查閱大量相關文獻，灰霉病拮抗菌中拮抗細菌報道相對較多，NX- X3、JM- X8、JM- X17三株拮抗細菌在其他研究中已有大量相關資料；拮抗放線菌NY- F5、SW- F9；拮抗木霉菌NX- M2、JM- M6；拮抗酵母菌SW- W8相關研究資料相對缺少甚至無，對比不同拮抗菌的拮抗性能，下一步進行田間生物防治效果研究工作，并通過分子生物學手段進行菌種鑒定。（責任編輯禾初）適宜的土壤養(yǎng)分、土壤水分等條件，可以促進苗木的健康快速生長，從而達到林木的速生、豐產和優(yōu)質的目的1。華北落葉松是塞罕壩機械林場的主要造林樹種，其在生長過程中要求土壤肥力適中，目前華北落葉松人工林造林地多為二代林。而最近研究表明，一代林生長后會使土壤出現(xiàn)不同程度的酸化、弱化以及地力衰退等問題2-6。馬云波等對冀北山區(qū)華北落葉松人工林土壤化學性質研究發(fā)現(xiàn)該地區(qū)華北落葉松人工林土壤有輕微酸化趨勢7。因而，通過嘗試用施復合肥的方法來補償?shù)亓λネ?、酸化的問題，來檢驗在相同立地條件下施復合肥對苗木生長的影響，以期為合理的經營措施提供依據(jù)。1 試驗地概況本試驗地位于塞罕壩機械林場總場，該場位于河北圍場滿族蒙古族自治縣北部，海拔在10181940m。塞罕壩機械林場主要有高原和壩緣山地2種地貌，此次試驗地位于高原地貌上。該地區(qū)主要氣候特點是寒冷，干燥多風，年平均氣溫為- 1.5，年均降水量為460mm。2 試驗方法2.1 試驗地選擇本研究主要選擇在塞罕壩機械林場總場第3鄉(xiāng)林場莫里莫營林區(qū)的華北落葉松人工林造林地，造林時苗木是2a生，試驗時已經生長了4a。在造林地隨機選擇6塊樣地，樣地面積設置為20m×30m。2.2 試驗方法隨機挑選其中的3塊樣地，對苗木施復合肥，施肥時間為6月末、7月初，肥料為復合肥，其他3塊常規(guī)處理。施肥后，秋季樹木停止生長后對施肥和未施肥的樣地分別調查苗木的樹高（cm）、基徑（cm）、冠幅（cm）、主干 15年生枝的枝長（cm）和基徑（cm）。3 結果與分析3.1 施復合肥后樹高生長情況從圖1可以看出，未施肥的華北落葉松苗高為1.89m，施復合肥后苗高為2.25m，施復合肥后苗木高比未施復合肥苗高高出0.36m，這說明施復合肥可以促進苗木的高生長。施復合肥對華北落葉松苗木生長的影響張 菲（河北省塞罕壩機械林場總場，河北 圍場 068466）摘 要：華北落葉松是塞罕壩機械林場的主要造林樹種，其在生長過程中要求土壤肥力適中，為了更好地促進華北落葉松人工林前期苗木的生長，對6a生華北落葉松苗木施復合肥，并與相同立地條件下未施肥和施肥后苗木生長情況進行對比分析。結果表明，施復合肥后華北落葉松苗木的樹高、基徑、冠幅分別增長了0.36m、5.97cm和14.6cm，主干枝條的生長也快于未施肥的苗木。這說明施復合肥可以促進華北落葉松苗木的生長。關鍵詞：復合肥；華北落葉松；苗木；生長作者簡介：張菲（1987-），女，河北圍場人，林業(yè)工程師，從事林業(yè)科研工作。試驗研究5- -</p>