小菜蛾共生真菌棒曲霉XCE02的代謝產(chǎn)物及抗菌活性.pdf

丁唯嘉 李明哲 陳澤林 等 小菜蛾共生真菌棒曲霉 XCE02的代謝產(chǎn)物及抗菌活性 J 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2020 41 2 76 81 DING Weijia LI Mingzhe CHEN Zelin et al Metabolites of a symbiotic fungus Aspergillus clavatus XCE02 from Plutella xylostella and their antifungal activities J Journal of South China Agricultural University 2020 41 2 76 81 小菜蛾共生真菌棒曲霉 XCE02的 代謝產(chǎn)物及抗菌活性 丁唯嘉 李明哲 陳澤林 蔡佳純 張梓娜 李月婷 孫晨昊 李春遠(yuǎn) 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 材料與能源學(xué)院 廣東 廣州 510642 摘要 目的 研究小菜蛾共生真菌棒曲 霉 Aspergillus clavatus XCE02代謝產(chǎn)物及其抗植物病原真菌的活性 方法 柱層析技術(shù)分離純 化 XCE02代謝產(chǎn)物 并運(yùn)用波譜技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu) 濾紙片擴(kuò)散法測(cè)試代謝產(chǎn)物對(duì)香蕉炭疽 菌和小麥赤霉菌的抑菌活性 結(jié)果 分離鑒定 出 gliomasolide A Sch725674 gliomasolide C clavatustide A clavatustide B 20 羥基麥角甾 4 6 8 14 22 四烯 3 酮 黃嘌呤 麥角甾醇 過氧化麥角甾醇和丁二 酸 10個(gè)化合物 在 250 g mL 時(shí) gliomasolide A Sch725674和 gliomasolide C對(duì)香蕉炭疽菌和小麥赤霉菌顯示了高度抗菌活性 clavatustide A和 clavatustide B對(duì)香蕉炭疽菌和小麥赤霉菌顯示了中度抗菌活性 20 羥基麥角甾 4 6 8 14 22 四烯 3 酮對(duì) 小麥赤霉菌顯示了中度抗菌活性 結(jié)論 從曲霉屬分離到 了 gliomasolide A gliomasolide C和 20 羥基麥角甾 4 6 8 14 22 四烯 3 酮 gliomasolide A Sch725674和 gliomasolide C可作為相應(yīng)抗菌農(nóng)藥先導(dǎo)化合物開展深入 研究 關(guān)鍵詞 昆蟲共生真菌 棒曲霉 代謝產(chǎn)物 抗菌活性 柱層析技術(shù) 波譜技術(shù) 濾紙片擴(kuò)散法 中圖分類號(hào) O629 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001 411X 2020 02 0076 06 Metabolites of a symbiotic fungus Aspergillus clavatus XCE02 from Plutella xylostella and their antifungal activities DING Weijia LI Mingzhe CHEN Zelin CAI Jiachun ZHANG Zina LI Yueting SUN Chenhao LI Chunyuan College of Materials and Energy South China Agricultural University Guangzhou 510642 China Abstract Objective To study the metabolites of a symbiotic fungus Aspergillus clavatus XCE02 from Plutella xylostella and their antifungal activities against plant pathogens Method The metabolites were isolated and purified by column chromatography Their structures were elucidated by spectral analysis The antifungal activities of the metabolites against Colletotrichum musae and Fusarium graminearum were investigated using paper disc agar diffusion method Result Ten compounds were isolated and identified as gliomasolide A Sch725674 gliomasolide C clavatustide A clavatustide B 20 hydroxyergosta 4 6 8 14 22 tetraen 3 one xanthine ergosterol ergosterol peroxide and butanedioic acid At the concentration of 250 g mL gliomasolide A Sch725674 and gliomasolide C exhibited high inhibitory activities against C musae and F graminearum 收稿日期 2019 04 28 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)時(shí)間 2020 01 07 11 38 26 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)地址 作者簡(jiǎn)介 丁唯嘉 1979 女 講師 博士 E mail dwjzsu 李明哲 1998 男 E mail 2069409284 對(duì)本文貢獻(xiàn)相同 通信作者 李春遠(yuǎn) 1978 男 教授 博士 E mail chunyuanli 基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金 21102049 廣東省自然科學(xué)基金 2018A030313582 2015A030313405 廣東省科技計(jì)劃公 益研究與能力建設(shè)專項(xiàng) 2016A020222019 教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金 2015 311 廣州市科技計(jì)劃項(xiàng) 目 201707010342 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) Journal of South China Agricultural University 2020 41 2 76 81 DOI 10 7671 j issn 1001 411X 201904034 clavatustide A and clavatustide B showed moderate inhibitory activities against C musae and F graminearum and 20 hydroxyergosta 4 6 8 14 22 tetraen 3 one showed moderate inhibitory activity against F graminearum Conclusion Gliomasolide A gliomasolide C and 20 hydroxyergosta 4 6 8 14 22 tetraen 3 one have been obtained from the genus Aspergillus in this study Gliomasolide A Sch725674 and gliomasolide C can be used as leading compounds for developing antifungal pesticide Key words insect symbiotic fungus Aspergillus clavatus metabolite antifungal activity column chromatography spectral analysis paper disc agar diffusion method 真菌引起的植物病害對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品保藏 造成了嚴(yán)重的危害 如香蕉炭疽病使香蕉果實(shí)變 黑 腐爛 1 小麥赤霉病引起小麥植株出現(xiàn)苗枯 莖 腐 稈腐和穗腐等癥狀 2 化學(xué)農(nóng)藥是目前防治植 物真菌病害的主要手段 但也造成病原菌抗藥性增 強(qiáng) 農(nóng)藥殘留等問題 3 微生物天然產(chǎn)物因具有易 降解 毒性低等特點(diǎn) 是化學(xué)農(nóng)藥替代品的重點(diǎn)研 究對(duì)象 已知的昆蟲種類達(dá)90萬種 預(yù)測(cè)可能有 200 3 000萬種 4 而幾乎所有昆蟲都有共生菌 昆 蟲共生菌分布于昆蟲體內(nèi) 大部分是酵母類 真菌 類和細(xì)菌類共生菌 5 相對(duì)于植物共生菌 目前對(duì) 昆蟲共生菌代謝產(chǎn)物的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足 6 小菜蛾 Plutella xylostella屬鱗翅目菜蛾科 1年可傳17代 在我國(guó)南方尤為泛濫 主要危害甘藍(lán) 青花菜 白 菜 油菜 蘿卜等十字花科植物 7 小菜蛾以蔬菜為 食 因此會(huì)接觸到植物病原菌 其共生菌對(duì)植物病 原菌可能有選擇性抑制作用 在前期對(duì)小菜蛾共生 真菌的研究中 發(fā)現(xiàn)分離自腸道的棒曲霉Aspergillus clavatus XCE02菌株在大米固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí) 其代謝產(chǎn)物乙醇提取物為 1 mg mL時(shí)對(duì)植物病原 菌小麥赤霉菌Fusarium graminearum和香蕉炭疽 菌Colletotrichum musae顯示了較好的抗菌活性 抑 菌圈直徑分別約為15 61和14 35 mm 本文研究棒 曲霉菌株XCE02代謝產(chǎn)物的分離 鑒定及抗菌活 性 以期尋找到相應(yīng)的抗菌先導(dǎo)化合物 1 材料與方法 1 1 材料 AV 600核磁共振波譜儀 瑞士BrukerBiospin AG MDS SCIEX APCI 2000液質(zhì)聯(lián)用儀 Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀 德國(guó)Thermo Fisher Scientific Inc SEPA 300旋光儀 GF254和柱層析 硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn) 為99 的多菌靈購 于上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司 試驗(yàn)所用其他試 劑均為分析純 棒曲霉XCE02分離自小菜蛾腸道 8 植物病原 菌小麥赤霉菌和香蕉炭疽菌引種自華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 以上菌株均保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能 源學(xué)院 1 2 菌種鑒定及發(fā)酵 將XCE02菌株劃線接種于馬鈴薯蔗糖瓊脂 PSA 培養(yǎng)基 26 恒溫黑暗條件下培養(yǎng)10 d后 觀察其生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài) 并進(jìn)行初步鑒定 參考文獻(xiàn) 9 的方法PCR擴(kuò)增真菌核糖體 ITS基因區(qū)段鑒定真菌 用CTAB法提取菌株總 DNA 10 用rDNA ITS序列通用引物ITS1 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 與ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 11 進(jìn)行PCR反 應(yīng) 反應(yīng)體系與文獻(xiàn) 12 相同 具體為 Taq Plus PCR MasterMix 天根生化 北京 科技有限公司 25 L 上游和下游引物各2 L 模板DNA 10 ng 1 L dd H2O 20 L 總體積50 L 反應(yīng)程序?yàn)?95 預(yù)變性5 min 95 變性30 s 55 退火30 s 72 延伸35 s 共30個(gè)循環(huán) 72 延伸10 min PCR產(chǎn)物送至廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn) 行測(cè)序 已測(cè)序的核苷酸序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行 BLAST相似性比對(duì) 發(fā)酵培養(yǎng) 在1 000 mL錐形瓶中裝入100 g秈 米 100 mL H2O 于121 高溫高壓滅菌30 min后 接種菌株XCE02 28 條件下靜置培養(yǎng)30 d 共培 養(yǎng)100瓶 1 3 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離 發(fā)酵產(chǎn)物用95 乙醇溶液浸泡3次 減壓 濃縮除去水后用乙酸乙酯萃取3次 減壓濃縮 經(jīng) 硅膠柱層析 以石油醚 乙酸乙酯 體積比為100 0 0 100 溶液 乙酸乙酯 甲醇 體積比為100 0 80 20 溶液系統(tǒng)梯度洗脫 得到10種化合物 1 4 結(jié)構(gòu)鑒定 通過分析化合物的氫譜 1H NMR 碳譜 13C NMR 電噴霧質(zhì)譜 ESIMS 電噴霧高分辨質(zhì)譜 HRESIMS 等試驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)或與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照等 方法 鑒定10種化合物的結(jié)構(gòu) 1 5 抗菌活性試驗(yàn)及數(shù)據(jù)處理 采用濾紙片擴(kuò)散法 12 13 測(cè)試結(jié)構(gòu)較為新穎的化 第 2 期 丁唯嘉 等 小菜蛾共生真菌棒曲霉 XCE02的代謝產(chǎn)物及抗菌活性 77 合物對(duì)香蕉炭疽菌 小麥赤霉菌的抗菌活性 28 條件下香蕉炭疽菌和小麥赤霉菌分別培養(yǎng)48和24 h 以多菌靈和溶解樣品的溶劑 為5 的二甲基亞 砜 DMSO 分別作為陽性對(duì)照和空白對(duì)照 鑒于所 得樣品數(shù)量較少 配制的溶液濃度較低 多菌靈和 待測(cè)樣品均為250 g mL 用十字交叉法量取抑菌 圈直徑 每種樣品 同一植物病原菌在每個(gè)培養(yǎng)皿 上測(cè)試2組抑菌圈直徑 重復(fù)3次 共得到6組抑 菌圈數(shù)據(jù) 最終結(jié)果以6組抑菌圈數(shù)據(jù)的平均 值 標(biāo)準(zhǔn)誤表示 用SPSS 17 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因 素方差 One way ANOVA 和相關(guān)性分析 2 結(jié)果與分析 2 1 菌株鑒定 菌株在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后菌落表面呈 藍(lán)灰綠色 基層有較多分生孢子 菌落邊緣有一薄 層白色菌絲緊貼基質(zhì)生長(zhǎng) 背面暗黃色 孢子穗圓 筒形 小梗單層 孢子梗寬為7 5 15 0 m 頂囊棍棒 形 分生孢子橢圓形 2 5 3 5 m 2 8 3 9 m 表面光滑 壁稍厚序列 符合曲霉屬棒曲霉特征 14 進(jìn)一步用PCR擴(kuò)增真菌核糖體ITS序列的方法驗(yàn) 證菌株的種屬 DNA測(cè)序結(jié)果與NCBI BLAST數(shù) 據(jù)庫中編號(hào)為KY765893 1的棒曲霉序列相似性為 100 與編號(hào)為AY373847 1 NR121482 1 KF669481 1的棒曲霉序列相似性均為99 此結(jié) 果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果吻合 表明該菌株屬于棒曲 霉 該菌株的GenBank登錄號(hào)為MK828108 1 2 2 化合物的鑒定及波譜數(shù)據(jù) 分離鑒定了10種化合物 在V 石油醚 V 乙酸 乙酯 85 15時(shí)得到化合物1 5 mg 在V 石油 醚 V 乙酸乙酯 70 30時(shí)得到化合物2 2 mg 在 V 石油醚 V 乙酸乙酯 60 40時(shí)得到化合物3 3 mg 在V 石油醚 V 乙酸乙酯 30 70得到化合 物4 3 5 mg 和5 2 5 mg 在V 石油醚 V 乙酸乙酯 75 25 時(shí)得到化合物6 10 mg 在V 乙酸乙酯 V 甲醇 90 10時(shí)分離得到化合物7 18 mg 在V 石油 醚 V 乙酸乙酯 65 35時(shí)得到化合物8和9的粗 品 再經(jīng)重結(jié)晶得到化合物8 12 mg 和9 4 mg 在 V 石油醚 V 乙酸乙酯 45 55時(shí)得到化合物10 7 mg 鑒定化合物1 10分別為gliomasolide A Sch725674 gliomasolide C clavatustide A clavatustide B 20 羥基麥角甾 4 6 8 14 22 四 烯 3 酮 黃嘌呤 麥角甾醇 過氧化麥角甾醇和丁 二酸 其中化合物1 7的波譜數(shù)據(jù)如下 25D 化合物1 無色晶體 V 甲醇 V 三氯甲烷 1 1 熔點(diǎn) 89 91 30 5 c 0 15 MeOH HRESIMS m z 313 238 4 M H 1H NMR 600 MHz CD3OD 6 82 dd 15 8 7 8 Hz 1H 5 97 dd 15 8 1 0 Hz 1H 4 99 m 1H 4 32 ddd 12 0 7 8 5 0 Hz 1H 3 65 m 1H 1 87 m 1H 1 75 m 2H 1 63 m 1H 1 57 m 1H 1 50 m 1H 1 32 1 43 m 13H 1 23 m 2H 1 14 m 1H 0 90 t 7 2 Hz 3H 13C NMR 150 MHz CD3COCD3 168 0 151 2 123 3 77 3 72 7 70 9 36 1 36 0 34 3 32 8 32 4 31 3 29 7 26 4 25 9 24 9 23 6 14 3 25D 化合物2 無色晶體 25 7 c 0 5 MeOH HRESIMS m z 329 233 0 M H 1H NMR 600 MHz CD3OD 6 87 dd 15 8 6 0 1H 6 08 dd 15 8 1 6 1H 4 95 dddd 9 8 7 5 5 0 2 2 1H 4 49 ddd 6 0 3 0 1 6 1H 3 99 q 6 5 1H 3 85 ddd 6 0 4 7 3 0 1H 1 83 ddd 14 7 6 5 6 0 1H 1 71 m 1H 1 65 m 1H 1 61 m 1H 1 58 m 1H 1 54 m 1H 1 30 1 45 m 11H 1 19 m 2H 1 16 m 1H 0 90 t 6 8 3H 13C NMR 150 MHz CD3OD 168 6 149 5 123 3 77 8 76 1 72 9 69 6 38 4 36 9 36 6 34 2 32 9 29 7 27 1 26 5 25 9 23 9 14 6 25D 化合物3 黃色固體 38 0 c 0 15 MeOH HRESIMS m z 343 212 4 M H 1H NMR 600 MHz CD3OD 6 95 dd 15 8 4 8 1H 6 18 dd 16 0 1 5 1H 5 02 m 1H 4 60 br s 1H 4 10 ddd 7 6 5 4 1 5 1H 4 00 dd 3 5 3 0 1H 3 37 br s 1H 1 77 m 1H 1 68 m 1H 1 61 m 1H 1 55 m 1H 1 33 1 49 m 11H 1 13 m 2H 1 10 m 1H 0 92 t 7 2 3H 13C NMR 150 MHz CD3OD 168 5 147 6 123 3 77 9 77 4 73 7 71 2 71 3 36 3 34 7 32 9 32 8 30 4 27 8 26 5 26 4 23 7 14 6 25D 化合物4 黃色固體 22 6 c 0 10 MeOH ESIMS m z 472 2 M H HRESIMS 472 187 2 M H 1H NMR 600 MHz CDCl3 10 22 s 1H 8 55 d 8 4 Hz 1H 8 05 s 1H 7 64 d 7 8 Hz 1H 7 58 d 7 8 Hz 1H 7 52 t 7 8 Hz 1H 7 45 t 7 8 Hz 1H 7 35 7 38 m 5H 7 30 m 1H 7 21 d 7 8 Hz 1H 7 09 t 7 8 Hz 1H 5 51 dd 8 4 6 6 Hz 1H 5 26 d 15 0 Hz 1H 3 94 m 1H 3 43 dd 13 8 8 4 Hz 1H 3 29 d 1H 15 0 Hz 3 27 m 1H 3 25 m 1H 1 02 t 7 2 Hz 3H 13C NMR 150 MHz CDCl3 169 6 167 9 167 4 167 4 138 1 135 7 134 5 132 6 132 3 129 7 129 8 128 8 127 8 127 4 126 7 126 3 125 9 123 2 123 1 122 0 71 7 51 4 43 4 37 7 13 9 78 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 第 41 卷 化合物5 黃色無定形固體 HRESIMS m z 458 172 8 M H 1H NMR 600 MHz CDCl3 10 15 s 1H 8 56 s 1H 8 50 d 8 4 Hz 1H 7 64 d 7 8 Hz 1H 7 56 d 7 8 Hz 1H 7 44 t 7 8 Hz 1H 7 41 t 7 8 Hz 1H 7 32 7 35 m 5H 7 31 m 1H 7 20 d 7 8 Hz 1H 7 05 s 1H 5 53 t 7 6 Hz 1H 5 27 d 14 8 Hz 1H 3 42 dd 13 6 7 6 Hz 1H 3 27 dd 13 6 7 6 Hz 1H 3 12 d 14 8 Hz 1H 3 03 s 3H 13C NMR 150 MHz CDCl3 169 9 167 6 167 5 167 4 138 2 135 6 135 0 132 8 132 4 129 9 129 8 128 9 127 5 127 4 126 7 126 6 126 3 123 4 123 3 122 1 71 7 54 4 37 4 35 9 25D 化合物6 黃色油狀物 HRESIMS m z 409 309 7 M H 115 6 c 0 15 MeOH 1H NMR 600 MHz CDCl3 6 63 d 9 5 Hz 1H 6 05 d 9 5 Hz 1H 5 75 s 1H 5 58 m 1H 5 57 m 1H 2 58 m 1H 2 54 m 1H 2 52 m 1H 2 47 m 1H 2 23 m 1H 2 02 m 1H 1 96 m 1H 1 89 m 1H 1 87 m 1H 1 77 m 1H 1 73 m 1H 1 64 m 1H 1 61 m 1H 1 53 m 1H 1 49 m 1H 1 38 m 1H 1 29 s 3H 1 06 s 3H 0 98 s 3H 0 96 d 6 8 Hz 3H 0 88 d 6 8 Hz 3H 0 86 d 6 8 Hz 3H 13CNMR 150 MHz CDCl3 199 7 164 5 155 6 136 7 133 9 130 6 124 8 124 4 123 1 74 8 59 1 44 4 44 3 42 7 36 8 36 1 34 3 34 2 33 2 30 7 18 9 24 9 22 5 20 6 20 2 19 9 16 8 17 3 化合物7 白色粉末 HRESIMS m z 153 041 6 M H 1H NMR 600 MHz DMSO d6 13 32 s 1H 11 53 s 1H 10 84 s 1H 7 92 s 1H 13C NMR 150 MHz DMSO d6 155 5 151 4 149 1 140 6 106 6 麥角甾醇 化合物8 過氧化麥角甾醇 化合 物9 和丁二酸 化合物10 為真菌中常見化合物 數(shù)據(jù)略 2 3 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物113C NMR 168 0表明存在1個(gè)酯羰 基 151 2 123 3結(jié)合1H NMR 6 82 dd 15 8 7 8 Hz 1H 5 97 dd 15 8 1 0 Hz 1H 的低場(chǎng)化學(xué)位移提 示有1個(gè)和羰基共軛的雙鍵 13C NMR 77 3 72 7 70 9結(jié)合1H NMR 4 99 4 32 3 65的信號(hào)表明存 在3個(gè)連氧的 CH基團(tuán) 提示除了酯羰基外 可能 有2個(gè)連 CH的羥基 1H NMR 0 90 t 7 0 3H 和中高場(chǎng)區(qū)重疊的質(zhì)子信號(hào)及碳譜 36 3 32 9 26 4 23 7 14 6 表明化合物的分子中存在鏈 狀結(jié)構(gòu)單元 根據(jù)高分辨質(zhì)譜313 238 4 M H 的 分子離子峰 結(jié)合碳譜 氫譜及以上分析推導(dǎo)出化 合物的分子式為C18H32O4 除去羰基和雙鍵的不飽 和度 表明分子存在1個(gè)單環(huán) 說明化合物屬于大 環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)類型 查閱文獻(xiàn) 15 對(duì)照波譜數(shù)據(jù) 比旋 光度等 化合物1鑒定為gliomasolide A 結(jié)構(gòu)見圖1 化合物2的13C NMR和1H NMR和化合物1非 常相似 表明其具有與化合物1相同的碳骨架 化 合物2的13C NMR 77 8 76 1 72 9 69 6結(jié)合1H NMR 4 95 4 49 3 99 3 85表明其有4個(gè)連氧的 CH 比化合物1多了1個(gè) 而且化合物2的質(zhì)譜 顯示其相對(duì)分子質(zhì)量比化合物1多16 由此推測(cè)化 合物2是化合物1取代了1個(gè)羥基的衍生物 查閱 文獻(xiàn) 16 對(duì)照波譜數(shù)據(jù) 比旋光度等 化合物2鑒 定為Sch725674 結(jié)構(gòu)見圖1 化合物31H NMR和13C NMR和化合物2相 似 表明其也具有和化合物2類似的大環(huán)內(nèi)酯骨 架 兩者區(qū)別在于化合物3有 77 9 77 4 73 7 71 2 71 3 5個(gè)連氧的 CH 比化合物2多1個(gè) 同時(shí)化 合物3的質(zhì)譜顯示其相對(duì)分子質(zhì)量比化合物2多 16 由此推測(cè)化合物3在化合物2基礎(chǔ)上多取代了 1個(gè)羥基 查閱文獻(xiàn) 15 對(duì)照波譜數(shù)據(jù) 比旋光度 O O OH HO R2 R1 化合物1 R1 H R2 H Compound 1 化合物2 R1 OH R2 H Compound 2 化合物3 R1 OH R2 OH Compound 3 O O O NH HN ON O R 化合物4 R CH3 Compound 4 化合物5 R H Compound 5 O H OH 化合物6 Compound 6 N N O H O H N N H 化合物7 Compound 7 圖 1 化合物1 7的分子結(jié)構(gòu) Fig 1 Structures of compounds 1 7 第 2 期 丁唯嘉 等 小菜蛾共生真菌棒曲霉 XCE02的代謝產(chǎn)物及抗菌活性 79 等數(shù)據(jù) 化合物3鑒定為gliomasolide C 結(jié)構(gòu)見圖1 化合物4 HRESIMS分子離子信號(hào)472 187 2 M H 可知其分子式C27H25N3O5 不飽和度為 17 13C NMR 169 6 167 9 167 4 167 4顯示4個(gè) 碳基碳 16個(gè)苯環(huán)區(qū)碳 122 0 138 1 信號(hào) 同時(shí) 1HNMR顯示13個(gè)苯環(huán)區(qū)氫信號(hào) 結(jié)合耦合常數(shù) 表明其分子中存在1個(gè)單取代苯環(huán)和2個(gè)二取代 苯環(huán) 扣除這些單元后剩余的不飽和度表明化合 物4存在環(huán)狀結(jié)構(gòu) 進(jìn)一步觀察1H NMR發(fā)現(xiàn) 10 22 s 1H 8 05 s 1H 有2個(gè)NH信號(hào) 13C NMR 43 4 13 9是典型的連接在酰胺氮上的乙基 結(jié)構(gòu)單元信號(hào) 結(jié)合 71 7的1個(gè)連氧碳信號(hào) 推測(cè) 化合物4為2個(gè)鄰氨基苯甲酸 1個(gè)2 羥基苯丙酸 以及1個(gè)N 乙基甘氨酸組成的環(huán)內(nèi)酰胺類物質(zhì) 在此基礎(chǔ)上查閱文獻(xiàn) 17 對(duì)照波譜數(shù)據(jù) 比旋光度 等 化合物4鑒定為clavatustide A 分子結(jié)構(gòu)見圖1 化合物5 13C NMR數(shù)據(jù)和化合物4十分類似 表明具有相同的環(huán)狀碳架結(jié)構(gòu) 化合物5的1H NMR 和化合物4相比少了 1 02 t 7 2 Hz 3H 的三重 峰甲基信號(hào) 多了 3 03 s 3H 的氮甲基碳信號(hào) 同時(shí)化合物5的13C NMR比化合物4少了1個(gè)高 場(chǎng)區(qū)的 43附近的碳 質(zhì)譜少了14 相當(dāng)于CH2的 質(zhì)量單元 這些結(jié)果表明二者不同僅在于化合物 4連接在酰胺氮上的乙基單元在化合物5中變成了 甲基結(jié)構(gòu) 查閱文獻(xiàn) 17 對(duì)照波譜數(shù)據(jù) 比旋光度 等 化合物5鑒定為clavatustide B 分子結(jié)構(gòu)見圖1 化合物6 1H NMR和13C NMR提示其屬于甾醇 類 1H NMR 0 96 d 6 8 Hz 3H 0 88 d 6 8 Hz 3H 0 86 d 6 8 Hz 3H 是連在 CH上的甲基 1 29 s 3H 1 06 s 3H 0 98 s 3H 是連在季碳上 的甲基 1H NMR 6 63 d 9 5 Hz 1H 6 05 d 9 5 Hz 1H 5 75 s 1H 5 58 m 1H 5 57 m 1H 及 13C NMR 164 5 155 6 136 7 133 9 130 6 124 8 124 4 123 1說明有4個(gè)雙鍵 13C NMR 199 7的 信號(hào)表明化合物6存在1個(gè) 不飽和羰基 74 8 的連氧碳信號(hào) 無對(duì)應(yīng)的1H NMR信號(hào) 表明化合 物6有1個(gè)連季碳的羥基 在此基礎(chǔ)上查閱文獻(xiàn) 波譜數(shù)據(jù)和比旋光度與文獻(xiàn) 18 中的基本一致 化 合物6鑒定為20 羥基麥角甾 4 6 8 14 22 四烯 3 酮 結(jié)構(gòu)見圖1 化合物7 1H NMR顯示 13 32 s 1H 11 53 s 1H 10 84 s 1H 3個(gè)NH信號(hào)以及7 92 s 1H 的雙鍵CH信號(hào) 結(jié)合13C NMR 155 5 151 4 149 1 140 6 106 6的信號(hào)表明化合物7可能是嘌 呤類化合物 查閱文獻(xiàn) 19 并對(duì)照波譜數(shù)據(jù)等 化 合物7鑒定為黃嘌呤 麥角甾醇 化合物8 過氧化麥角甾醇 化合 物9 和丁二酸 化合物10 的結(jié)構(gòu)通過與實(shí)驗(yàn)室標(biāo) 準(zhǔn)品進(jìn)行核磁共振波譜 薄層層析對(duì)照確定 2 4 化合物對(duì)植物病原菌的抗菌活性 采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)試了部分化合物對(duì)香蕉 炭疽菌和小麥赤霉菌的活性 根據(jù)文獻(xiàn) 12 抑菌 圈直徑為 6 11 11 15 和 15 20 mm分別表示 對(duì)該菌株有輕度 中度和高度抗菌作用 由表1可知 表 1 化合物的抗植物病原菌活性1 Table 1 Antifungal activities of compounds against plant pathogens 測(cè)試化合物 Tested compound d 抑菌圈 Inhibition zone mm香蕉炭疽菌 Calletotrichum musae小麥赤霉菌 Fusarium graminearum gliomasolide A 18 19 0 43eE 15 45 0 41eE Sch725674 17 18 0 36dD 17 02 0 35gG gliomasolide C 18 18 0 46eE 16 22 0 54fF clavatustide A 13 75 0 42cC 13 46 0 36cC clavatustide B 13 66 0 24cC 14 47 0 27dD 20 羥基麥角甾 4 6 8 14 22 四烯 3 酮10 54 0 43bB 12 37 0 53bB 20 hydroxyergosta 4 6 8 14 22 tetraen 3 one 多菌靈 Positive control 26 53 0 20fF 18 57 0 18hH 空白對(duì)照 Negative control 0aA 0aA 1 表中數(shù)據(jù)為平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤 同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示組間 0 05水平差異顯著 不同大寫字母表示組間 0 01水平差異 顯著 Duncan s法 1 The data in the table are average values standard errors and different lowercase letters in the same column indicate significant differences among groups at 0 05 level different capital letters in the same column indicate significant differences among groups at 0 01 level Duncan s method 80 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 第 41 卷 在濃度為250 g mL時(shí) gliomasolide A Sch725674和 gliomasolide C對(duì)香蕉炭疽菌和小麥赤霉菌均顯示 了高度抗菌活性 且Sch725674 gliomasolide C對(duì) 小麥赤霉菌的抗菌活性與多菌靈接近 clavatustide A clavatustide B對(duì)香蕉炭疽菌和小麥赤霉菌顯示 中度抗菌作用 20 羥基麥角甾 4 6 8 14 22 四烯 3 酮對(duì)小麥赤霉菌中度抗菌 對(duì)香蕉炭疽輕度抗 菌 但化合物對(duì)2種植物病原真菌抗菌活性均弱于 陽性對(duì)照多菌靈 3 結(jié)論與討論 從棒曲霉菌株XCE02的發(fā)酵液中共分離鑒定 出gliomasolide A gliomasolide C 20 羥基麥角甾 4 6 8 14 22 四烯 3 酮等10種化合物 結(jié)構(gòu)類型 包括有大環(huán)內(nèi)酯 環(huán)脂肽 生物堿 甾醇等 濾紙片 擴(kuò)散法抗菌活性測(cè)試結(jié)果表明 在濃度為250 g mL 時(shí) 化合物gliomasolide A Sch725674和gliomasolide C對(duì)香蕉炭疽菌和小麥赤霉菌顯示了高度抗菌活 性 推測(cè)它們是菌株提取物顯示對(duì)植物病原菌抗性 的重要原因之一 可作為抗菌農(nóng)藥先導(dǎo)化合物開展 深入研究 此外clavatustide A clavatustide B和 20 羥基麥角甾 4 6 8 14 22 四烯 3 酮也對(duì)香蕉 炭疽菌和小麥赤霉菌顯示了中度或輕度抗菌活性 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道 gliomasolide A可以抑制人宮頸癌細(xì)胞 的增殖 15 Sch725674對(duì)釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae和白色念珠菌Candida albicans具有強(qiáng)抑 制活性 16 clavatustide A和clavatustide B 具有抑制 3種人肝癌細(xì)胞HepG2 SMMC 7721和Bel 7402增殖的活性 17 但鮮見這些化合物對(duì)植物病 原菌抗菌活性的研究報(bào)道 本研究結(jié)果豐富了昆蟲 天然共生真菌源抗菌農(nóng)藥先導(dǎo)化合物庫 參考文獻(xiàn) INTAN SAKINAH M A SUZIANTI I V LATIFFAH Z Phenotypic and molecular characterization of Colleto trichum species associated with anthracnose of banana Musa spp in Malaysia J Genet Mol Res 2014 13 2 3627 3637 1 AVOZANI A REIS E M TONIN R B In vitro sensitiv ity reduction of Fusarium graminearum to DMI and QoI fungicides J Summa Phytopathol 2014 40 4 358 364 2 MAHLO S M MCGAW L J ELOFF J N Antifungal 3 activity of leaf extracts from South African trees against plant pathogens J Crop Prot 2010 29 12 1529 1533 劉高強(qiáng) 魏美才 昆蟲資源開發(fā)與利用的新進(jìn)展 J 西 北林學(xué)院學(xué)報(bào) 2008 23 6 142 146 4 譚周進(jìn) 肖啟明 謝丙炎 等 昆蟲內(nèi)共生菌研究概 況 J 微生物學(xué)通報(bào) 2005 32 4 140 143 5 戈惠明 譚仁祥 共生菌 新活性天然產(chǎn)物的重要來 源 J 化學(xué)進(jìn)展 2009 21 1 30 46 6 馬春森 馬罡 楊和平 小菜蛾在溫帶地區(qū)越冬研究進(jìn) 展 J 生態(tài)學(xué)報(bào) 2010 30 13 3628 3636 7 周丹麗 徐嘉欣 朱新偉 等 小菜蛾內(nèi)生菌Bacillus sp B03產(chǎn)生的Iturin類代謝產(chǎn)物的研究 C 中國(guó)化學(xué) 會(huì) 第十一屆全國(guó)天然有機(jī)化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議 上海 中國(guó) 化學(xué)會(huì) 2016 344 8 孫靜 謝淑娜 劉佳中 等 河南省玉米莖基部鐮刀菌的 形態(tài)和分子鑒定 J 植物病理學(xué)報(bào) 2014 44 1 8 16 9 王娜 錢冠蘭 李曉捷 等 海帶配子體克隆中一株鐮刀 菌的分離鑒定 J 微生物學(xué)通報(bào) 2010 37 10 1491 1494 10 郭鵬豪 劉秀麗 崔穎鵬 等 真菌通用引物ITS1和 ITS4在絲狀真菌鑒定中的價(jià)值評(píng)價(jià) J 中國(guó)微生態(tài)學(xué) 雜志 2013 25 8 922 924 11 李文生 周丹麗 陸盈池 等 1株紅樹內(nèi)生真菌Fusari um sp 代謝產(chǎn)物的研究 J 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2017 38 3 64 69 12 CHEN M ZHOU J R LI C Y et al Isolation identifica tion and bioactivity of allele chemicals of Streptomyces sp strain 6803 J Allelopathy J 2009 23 2 411 424 13 章婷 BEDELKHAN A 鄭婕施 等 高產(chǎn)洛伐他汀棒曲 霉菌株的篩選 鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化 J 工業(yè)微生物 2016 46 6 24 33 14 ZHANG J LIN X P LI L