黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立與應(yīng)用.pdf

Journal of Northeast Agricultural University 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第 51 卷 第 3 期 5 1 3 8 17 2020 年 3 月 March 2020 黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法的建立與應(yīng)用 張艷菊 劉齊月 張 笛 陶 磊 王春龍 劉行風(fēng) 李雪蓮 馬 天 劉 東 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 哈爾濱 150030 摘 要 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 是 近 年 來 生 產(chǎn) 中 流 行 的 一 種 氣 傳 病 害 易 與 霜 霉 病 炭 疽 病 等 病 害 混 淆 具 有 傳 播 迅 速 難 以 防 治 的 特 點(diǎn) 嚴(yán) 重 威 脅 黃 瓜 生 產(chǎn) 研 究 旨 在 開 發(fā) 一 種 快 速 靈 敏 的 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 方 法 用 于 定 量 檢 測 葉 片 中 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 Corynespora cassiicola 并 應(yīng) 用 于 田 間 監(jiān) 測 基 于 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 的 actin 序 列 設(shè) 計(jì) 并 合 成 一 對 特 異 性 引 物 CAF 2 CAR 2 以 標(biāo) 準(zhǔn) 品 DNA 構(gòu) 建 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 并 優(yōu) 化 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 反 應(yīng) 體 系 當(dāng) 退 火 溫 度 60 DNA 模 板 量 3 L 10 ng L 1 引 物 量 0 2 L 10 mmol L 1 時(shí) 為 最 佳 體 系 條 件 此 方 法 檢 測 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 DNA 最 低 濃 度 為 1 36 10 6 ng L 1 驗(yàn) 證 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 體 系 組 內(nèi) 與 組 間 重 復(fù) 性 和 穩(wěn) 定 性 其 變 異 系 數(shù) 均 小 于 2 應(yīng) 用 所 建 立 的 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 體 系 檢 測 5 種 不 同 抗 性 黃 瓜 品 種 接 種 棒 孢 葉 斑 病菌后 不同時(shí) 間葉片 中病菌 動(dòng)態(tài)變 化 發(fā)現(xiàn) 4 8 h Cq 值 30 時(shí) 黃瓜棒 孢葉斑 病菌開 始侵染 高感和 感病品 種 8 12 h 時(shí) 開 始 侵 染 中 抗 抗 病 和 高 抗 品 種 且 隨 時(shí) 間 延 續(xù) 侵 染 量 逐 漸 增 加 根 據(jù) 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 病 情 分 級(jí) 標(biāo) 準(zhǔn) 當(dāng) Cq 值 21 時(shí) 病 情 級(jí) 別 為 1 Cq 值 19 時(shí) 病 情 級(jí) 別 為 2 Cq 值 17 病 情 級(jí) 別 為 3 Cq 值 14 病 情 級(jí) 別 為 4 研 究為黃瓜棒孢葉斑病診斷及監(jiān)測提供技術(shù)支持 關(guān)鍵詞 黃瓜棒孢葉斑病 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 動(dòng)態(tài)監(jiān)測 中圖分類號(hào) S 436 5 Q 789 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1005 9 369 2020 03 0008 10 張 艷 菊 劉 齊 月 張 笛 等 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR 方 法 的 建 立 與 應(yīng) 用 J 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 2020 51 3 8 17 DOI 10 19720 ki issn 1005 9369 2020 03 002 Zhang Yanju Liu Qiyue Zhang Di et al Development and application of a real time fluorescence quantitative PCR assay for detection of cucumber target leaf spot J Journal of NortheastAgricultural University 2020 51 3 8 17 in Chinese with English abstract DOI 10 19720 ki issn 1005 9369 2020 03 002 Development and application of a real time fluorescence quantitative PCR assay for detection of cucumber target leaf spot ZHANG Yanju LIU Qiyue ZHANG Di TAO Lei WANG Chunlong LIU Xingfeng LI Xuelian MA Tian LIU Dong School ofAgriculture NortheastAgricultural University Harbin 150030 China Abstract As a airborne disease on cucumber cucumber target leaf spot has the characteristics of spreading rapidly andcontrolling difficultly which seriously threatens cucumber production The aim of this study was to develop a real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction system for rapid and sensitive detection and quantification of C o r yn e s p o r a ca s s i i c o l a in cucumber leaves A pair of specific primers CAF 2 CAR 2 was designed based on the actin sequence of C o r y n e sp o r a c a s si i c o l a with a standard curve was constructed by standard DNA and the real time fluorescence quantitative PCR reaction system were optimized The results showed that when the annealing temperature was 60 the amount of DNA template was 3 L 10 ng L 1 and the amount of primer was 0 2 L 10 收稿日期 2020 01 27 基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金 項(xiàng)目 318 01871 中國博士后面上資助 項(xiàng)目 2018M 631 906 作者簡介 張艷菊 1 968 女 教授 博士 博士生導(dǎo)師 研究方向?yàn)槭卟瞬『C合防治 E mail zhangyanju 1968 163 com 張艷菊等 黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法的建立與應(yīng)用 第 3 期 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 又 稱 褐 斑 病 靶 斑 病 1906 年 首 次 在 歐 洲 發(fā) 現(xiàn) 1 目 前 中 國 2 美 國 3 日 本 4 韓 國 5 等 地 均 有 發(fā) 生 和 報(bào) 道 近 年 來 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 在 我 國 黃 瓜 種 植 區(qū) 發(fā) 生 嚴(yán) 重 成 為 黃 瓜 生 產(chǎn) 主 要 病 害 之 一 6 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 一 般 在 田 間 葉 片 發(fā) 病 率 為 10 25 嚴(yán) 重 時(shí) 可 達(dá) 70 甚 至 100 7 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 侵 染 破 壞 力 強(qiáng) 極 易 變 異 防 治 難 度 超 過 黃 瓜 霜 霉 病 已 由 次 要 病 害 上 升 至 世 界 主 要 病 害 8 當(dāng) 前 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 在 黑 龍 江 地 區(qū) 黃瓜保護(hù)地生產(chǎn)中十分常見 危害較重 引 起 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 病 原 菌 為 多 主 棒 孢 Co rynesporacassiico la Berk the Cq value 19 the disease level was 2 the Cq value 17 the disease level was 3 the Cq value 14 the disease level was 4 The study provided a technical assay for the prediction and the prevention of cucumber target leaf spot Key words c u c u m b e r t a r g e t l e a f s p o t r e a l t i m e f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v e P C R e p i d e m i o l o g i c a l p r e d i c t i o n 9 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第 51 卷 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 C ca ssiicola 黃 瓜 黑 斑 病 菌 A cucumerina 黃 瓜 黑 星 病 菌 C cucumeri nu m 黃 瓜 炭 疽 病 菌 C orbiculare 培 養(yǎng) 于 馬 鈴 薯 葡 萄 糖 瓊 脂 PDA 平 板 黃 瓜 枯 萎 病 菌 F oxysporum 培 養(yǎng) 于 馬 鈴 薯 蔗 糖 瓊 脂 PSA 平 板 黃 瓜 霜 霉 病 菌 P cuben sis 黃 瓜 白 粉 病 菌 S cucurbitae 收 集 于 新 鮮 黃 瓜 葉 片 黃 瓜 角 斑 病 菌 P syringae 置 于 28 King B 培 養(yǎng) 基 中 120 r min 1 搖 動(dòng) 生 長 收 集 培 養(yǎng) 后 菌 株 利 用 CTAB 法 提 取 供 試 真 菌 及 卵 菌 基 因 組 DNA 14 細(xì) 菌 基 因 組 DNA 采 用 改 良 CTAB 法 提 取 15 1 2 特異性引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證 參 考 Wu 等 列 舉 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 保 守 肌 動(dòng) 蛋 白 序 列 actin 16 選 定 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 actin 參 考 序 列 GenBank MH 511656 1 及 其 他 供 試 病 原 菌 ac tin 序 列 GenBank HM 148567 KF 178566 JQ 965663 JQ 671742 1 利 用 DNAMAN 軟 件 比 對 Primier 6 0 軟 件 設(shè) 計(jì) 10 對 特 異 性 引 物 引 物 序 列 見 表 2 由 吉 林 省 庫 美 生 物 科 技 有 限 公 司 合 成 使用時(shí)將引物用 ddH 2 O 稀釋至 10 m ol L 1 將 上 述 引 物 分 別 以 供 試 菌 株 基 因 組 DNA 10 ng L 1 為 模 板 作 普 通 PCR 擴(kuò) 增 檢 測 該 引 物 對 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 是 否 存 在 特 異 性 普 通 PCR 反 應(yīng) 體 系 為 25 L Premix Taq 12 5 L 上 下 游 引 物 10 mol L 1 各 0 5 L 模 板 D NA 10 ng L 1 1 L 和 ddH 2 O 10 5 L 陰 性 對 照 無 DNA 擴(kuò) 增 條 件 為 94 預(yù) 變 性 5 min 94 變 性 1 min 56 退 火 1 min 72 延 伸 1 min 35 個(gè) 循 環(huán) 72 延 伸 10 min 利 用 EPS 600 型 電 泳 儀 Jel Doc 2001 型 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) BIO RAD 美 國 1 瓊 脂 糖 凝 膠電泳檢測結(jié)果 1 3 標(biāo)準(zhǔn)品制備 標(biāo) 準(zhǔn) 品 為 提 純 的 目 的 基 因 片 段 用 于 制 作 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 普 通 PCR 反 應(yīng) 體 系 為 50 L Premix Taq 25 L 上 下 游 引 物 10 mol L 1 各 1 L 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 基 因 組 D NA 10 ng L 1 2 L 和 ddH 2 O 21 L 擴(kuò) 增 條 件 為 94 預(yù) 變 性 5 min 94 變 性 1 min 56 退 火 1 min 72 延 伸 1 min 35 個(gè) 循 環(huán) 72 延 伸 10 min 制 備 1 含 EB 瓊 脂 糖 凝 膠 取 4 L PCR 產(chǎn) 物 各 加 入 2 L 溴 酚 蘭 溶 液 用 DL 2000 DNA Marker 作 對 照 恒 壓 電 泳 30 min 全 自 動(dòng) 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) 觀 察 并 拍 照 將 PCR 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 膠 回 收 南 京 維 諾 贊 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司 回 收 產(chǎn) 物 經(jīng) 1 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測 是 否 存 在 目 的 基 因 條 帶 若 條 帶 存 在 則 將 膠 回 收 產(chǎn) 物 送 吉 林 庫 美 生 物 有 限 責(zé) 任 公 司 測序 1 4 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 菌 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 體 系 建 立 與優(yōu)化 1 4 1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化 為 建 立 適 合 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 反 應(yīng) 體 系 優(yōu) 化 退 火 溫 度 模 板 濃 度 及 引 物 濃度 編號(hào) Code 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 病菌 Pathogen 黃瓜棒孢葉斑病菌 C cassiicola 黃瓜棒孢葉斑病菌 C cassiicola 黃瓜棒孢葉斑病菌 C cassiicola 黃瓜棒孢葉斑病菌 C cassiicola 黃瓜棒孢葉斑病菌 C cassiicola 黃瓜霜霉病菌 P cubensis 黃瓜白粉病菌 S cucurbitae 黃瓜角斑病菌 P syringae 黃瓜枯萎病菌 F oxysporum 黃瓜黑斑病菌 A cucumerina 黃瓜黑星病菌 C cucumerinum 黃瓜炭疽病菌 C orbiculare 菌株代碼 Isolate code Cc gm Cc yy Cc dm Cc hl Cc ya Pc yy Sc yy Ps Fo Ac Cc Co 來源 Origin 黑龍江省哈爾濱市光明村 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院 黑龍江省齊齊哈爾市大民鎮(zhèn) 黑龍江省齊齊哈爾市花力村 黑龍江省綏化市永安鎮(zhèn) 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室 表 1 供試菌株名稱和來源 Table 1 Codes and origin of the isolates used in this study 10 張艷菊等 黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法的建立與應(yīng)用 第 3 期 退 火 溫 度 將 退 火 溫 度 設(shè) 置 為 57 58 60 62 4 個(gè)退火溫度 模 板 濃 度 根 據(jù) 不 同 濃 度 模 板 DNA 對 產(chǎn) 物 擴(kuò) 增 效 率 及 反 應(yīng) 熒 光 吸 收 強(qiáng) 度 的 影 響 設(shè) 置 模 板 含 量 為 1 2 3 L 10 ng L 1 確 定 合 適 體 系 DNA 模板濃度 引 物 濃 度 根 據(jù) 反 應(yīng) 熔 解 曲 線 和 產(chǎn) 物 擴(kuò) 增 效 率 將 引 物 含 量 設(shè) 置 為 0 2 0 3 0 4 L 10 mol L 1 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 反 應(yīng) 體 系 為 20 L 10 L Taq SYBR Green qPCR Premix 0 2 0 4 L 上 下 游 混 合 引 物 10 mol L 1 1 3 L 10 ng L 1 模 板 DNA ddH 2 O 補(bǔ) 齊 至 20 L 擴(kuò) 增 條 件 為 94 預(yù) 變 性 3 min 94 變 性 10 s 52 58 退 火 30 s 72 延伸 15 s 40 個(gè)循環(huán) 72 延伸 5 min 1 4 2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 將 標(biāo) 準(zhǔn) 品 10 倍 梯 度 稀 釋 得 到 濃 度 梯 度 依 次 為 1 36 10 1 1 36 10 7 ng L 1 模 板 DNA 每 個(gè) 濃 度 3 次 重 復(fù) 空 白 對 照 為 滅 菌 ddH 2 O 利 用 已 篩 選 反 應(yīng)程 序及 反應(yīng) 體系 作實(shí) 時(shí)熒 光定 量 PCR 以起 始濃 度 對 數(shù) 值 為 X 軸 以 Cq 值 為 Y 軸 構(gòu) 建 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 標(biāo)準(zhǔn)曲線由實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 軟件自動(dòng)生成 1 4 3 靈敏度與重復(fù)性試驗(yàn) 將 10 倍 梯 度 稀 釋 的 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 標(biāo) 準(zhǔn) 品 作為 模板 作實(shí) 時(shí)熒 光定 量 PCR 確定 該體 系檢 測黃 瓜棒孢葉斑病菌最小濃度 將 3 個(gè) 稀 釋 濃 度 標(biāo) 準(zhǔn) 品 作 批 次 內(nèi) 和 批 次 間 重 復(fù) 性 試 驗(yàn) 驗(yàn) 證 該 檢 測 方 法 穩(wěn) 定 性 批 內(nèi) 重 復(fù) 試 驗(yàn) 可 對 同 一 樣 品 同 時(shí) 測 定 3 次 重 復(fù) 批 間 重 復(fù) 可 在 不 同 時(shí) 間 對 同 一 樣 品 模 板 測 定 3 次 重 復(fù) SPSS 16 0 統(tǒng) 計(jì) 軟 件 計(jì) 算 Cq 值 得 到 相 應(yīng) 標(biāo) 準(zhǔn) 差 SD 及 變 異 系 數(shù) CV 變 異 系 數(shù) CV 小 于 2 時(shí) 認(rèn) 為 該 反 應(yīng) 體 系 重 復(fù)性與穩(wěn)定性良好 1 5 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 定 量 檢 測 黃 瓜 葉 片 棒 孢 葉 斑病菌潛伏侵染量動(dòng)態(tài)變化 1 5 1 供試菌株及作物 供 試 菌 株 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 Corynespora cassiicola 采 自 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 園 藝 實(shí) 驗(yàn) 站 供 試 作 物 品 種 黃 瓜 高 抗 品 種 D 9320 H R 抗 病 品 種 美 國 小 黃 瓜 R 中 抗 品 種 北 京 301 MR 感 病 品 種 D 805 S 高 感 品 種 D 040 1 H S 由 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué)黃瓜課題組提供 1 5 2 育苗及接種 將 5 個(gè) 不 同 品 種 黃 瓜 種 子 播 種 于 育 苗 穴 盤 中 7 d 后 子 葉 展 平 時(shí) 將 幼 苗 移 入 營 養(yǎng) 缽 內(nèi) 每 缽 留 1 株 白 天 25 夜 晚 15 正 常 管 理 待 黃 瓜 第 1 片 真 葉 展 平 時(shí) 取 下 將 真 葉 打 成 直 徑 20 mm 葉 盤 配 制 濃 度 為 1 10 5 個(gè) mL 1 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 孢 子 懸 浮 液 每 個(gè) 葉 盤 接 種 3 滴 濃 度 1 10 5 個(gè) 孢 子 mL 1 菌 懸 液 每 滴 10 L 每 個(gè) 處 理 15 個(gè) 葉 盤 3 次 重 復(fù) 接種 ddH 2 O 設(shè)為對照 接菌后注意保濕避光 1 5 3 采集樣品并調(diào)查病情指數(shù) 接 種 2 4 8 12 24 36 48 96 和 120 h 后 各 取 樣 1 次 每 次 不 同 品 種 各 采 集 3 個(gè) 葉 盤 3 次 重 復(fù) 清 水 反 復(fù) 沖 洗 后 置 于 離 心 管 中 備 用 同 時(shí) 調(diào) 查 發(fā) 病 情 況 病 情 分 級(jí) 標(biāo) 準(zhǔn) 為 17 0 級(jí) 無 病 癥 1 級(jí) 病 斑 面 積 占 葉 面 積 5 以 下 2 級(jí) 病 斑 面 積 占 葉 盤 面 積 5 25 3 級(jí) 病 斑 面 積 占 葉 盤 面 積 25 50 4 級(jí) 病斑面積占葉盤面積 50 以上 1 5 4 提取樣品 DNA 并檢測侵染量 將 收 集 的 葉 盤 剪 碎 混 勻 稱 取 0 1 g 利 用 CTAB 法 提 取 黃 瓜 葉 片 基 因 組 DNA 以 得 到 的 基 因 組 DNA 為 模 板 應(yīng) 用 已 優(yōu) 化 的 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 體 系 檢 測 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 侵 染 黃 瓜 葉 片 侵 染 量 根 據(jù) 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 計(jì) 算 每 個(gè) 時(shí) 段 黃 瓜 葉 片 內(nèi) 棒 孢葉 斑病菌濃度 2 結(jié)果與分析 2 1 黃 瓜棒孢葉斑病菌引物特異性檢測 提 取 供 試 菌 株 基 因 組 DNA 經(jīng) 1 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測 結(jié) 果 如 圖 1 所 示 病 原 菌 DNA 條 帶 清 晰 明 亮 提 取 的 DNA 具 有 較 高 濃 度 和 純 度 可 用 作 底物模板以滿足下一步試驗(yàn)要求 表 2 為 10 對 引 物 特 異 性 檢 測 結(jié) 果 表 示 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測 有 條 帶 表 示 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測 無 條 帶 結(jié) 果 顯 示 引 物 CAF 2 CAR 2 對 黃 瓜 棒孢葉斑病菌具有良好特異性 引 物 CAF 2 5 GCCT CGAGCTGTTTTC C G T A A G T 3 C A R 2 5 C C G A T C A T G A T A C T G G C A G T GGTC 3 擴(kuò) 增 的 來 自 不 同 地 區(qū) 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 和 其 他 黃 瓜 病 原 菌 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 結(jié) 果 見 圖 2 可 見 僅 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 擴(kuò) 增 出 186 bp 特 異 性 條 帶 而 其 他 黃 瓜 病 害 病 原 菌 無 條 帶 表 明 引 物 CAF 2 CAR 2 可 用作黃瓜棒孢葉斑病菌特異性引物 11 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第 51 卷 M DL 2000 DNA Ladder 1 5 為黃瓜棒孢葉斑病菌 6 12 分別為黃瓜霜霉病菌 黃瓜白粉病菌 黃瓜角斑病菌 黃瓜黑星病菌 黃瓜黑斑病菌 黃瓜炭疽病菌和黃瓜枯萎病菌 M DL 2000 DNA Ladder 1 5 C cassiicola 6 12 P cubensis S cucurbitae P syringae C cucumerinum A cucumerina C orbiculare and F oxysporum respectively 圖 1 病原菌 DNA 檢測電泳結(jié)果 Fig 1 Electrophoresis results of pathogen DNA 引物 Primer 18S F 18S R 18 S 2 F 18S 2 R 18 S 3 F 18S 3 R CAF 1 CAR 1 CAF 2 CAR 2 CIF 6 CIR 6 CIF 7 CIR 7 CIF 8 CIR 8 CIF 9 CIR 9 CIF 10 CIR 10 序列 5 3 Sequence GTGAAGTGCATACGTCGGTG TTGATGGCTGAGGAGTCGTT GGCGCTGCGTTGACATGAGAG GTTGATGGCTGAGGAGTCGTTGG AACGCAGCGAAATGCGATAA GGGTTGAAATGACGCTCGAA CCTGTTCTTTGTTCCCTCA TTTGTGATCCAAGGATAGGG GCCTCGAGCTGTTTTCCGTAAGT CCGATCATGATACTGGCAGTGGTC CATTATCGTAGGGGCCTCGC CCTGCCGAGGAAACGAGAG TGTTTATGAGCACCTCTCGT TACAATGGGTTTGTGGTGGG ATTATCGTAGGGGCCTCGCC CTGCCGAGGAAACGAGAGGT AACGGATCTCTTGGTTCTGG GGCTTGAGGGTTGAAATGAC AACGCAGCGAAATGCGATAA GGGTTGAAATGACGCTCGAA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 注 1 5 為 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 6 12 分 別 為 黃 瓜 霜 霉 病 菌 黃 瓜 白 粉 病 菌 黃 瓜 角 斑 病 菌 黃 瓜 黑 星 病 菌 黃 瓜 黑 斑 病 菌 黃 瓜 炭 疽 病菌和黃瓜枯萎病菌 Note 1 5 C cassiicola 6 12 P cubensis S cucurbitae P syringae C cucumerinum A cucumerina C orbiculare and F oxysporum respectively 表 2 引物特異性檢測結(jié)果 Table 2 Primer pairs used in this study and the specific test result 圖 2 引物 CAF 2 CAR 2 對黃瓜棒孢葉斑病菌特異性檢測結(jié)果 Fig 2 Specific detection results of cucumber target leaf spot by primer CAF 2 CAR 2 M DL 2000 DNA Ladder 1 5 為黃瓜棒孢葉斑病菌 6 12 分別為黃瓜霜霉病菌 黃瓜白粉病菌 黃瓜角斑病菌 黃瓜黑星病菌 黃瓜黑斑病菌 黃瓜炭疽病菌和黃瓜枯萎病菌 M DL 2000 DNA Ladder 1 5 C cassiicola from different areas 6 12 P cubensis S cucurbitae P syringae C cucumerinum A cucumerina C orbicula re and F oxysporum respectively M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp 10 11 12 12 張艷菊等 黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法的建立與應(yīng)用 第 3 期 2 2 目的基因鑒定 將 膠 回 收 純 化 后 見 圖 3 目 的 基 因 產(chǎn) 物 送 至 吉 林 庫 美 生 物 有 限 責(zé) 任 公 司 測 序 結(jié) 果 表 明 CAF 2 CAR 2 擴(kuò) 增 出 的 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 目 的 基 因 為 1 8 6 b p 其 序 列 如 下 CTTAACCGTAAACTATGCCGA CTAGGGATCGGGCGATGTTTCTATCTTGACTCGCT CGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCT GGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAG AAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCC TGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAA 2 3 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 體 系 建 立與優(yōu)化 2 3 1 退火溫度 3 種 濃 度 模 板 在 退 火 溫 度 為 57 58 60 和 62 下 平 均 Cq 值 和 熒 光 信 號(hào) 強(qiáng) 度 見 表 3 可 見 模 板 濃 度 相 同 時(shí) 退 火 溫 度 60 Cq 值 最 小 對 應(yīng) 熒 光 信 號(hào) 強(qiáng) 度 最 強(qiáng) 表 明 該 反 應(yīng) 在 60 時(shí) 具 有 較 高 擴(kuò) 增 效 率 而 在 其 他 退 火 溫 度 下 反 應(yīng) 擴(kuò) 增 效 率 低 不 穩(wěn) 定 因 此 當(dāng) 退 火 溫 度 為 60 時(shí) 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)最穩(wěn)定 2 3 2 模板濃度 將 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 DNA 模 板 分 別 以 1 2 和 3 L 10 mol L 1 添 加 至 反 應(yīng) 體 系 根 據(jù) 熔 解 曲 線 穩(wěn) 定 性 確 定 合 適 的 DNA 模 板 濃 度 如 圖 4 所 示 當(dāng) 模 板 加 入 量 為 3 L 時(shí) 曲 線 總 體 穩(wěn) 定 加 入 量 為 1 或 2 L 時(shí) 熔 解 曲 線 與 3 L 濃 度 相 比 表 達(dá) 不 穩(wěn) 定 因 此 當(dāng) 檢 測 系 統(tǒng) 中 DNA 模 板 量 為 3 L 時(shí) 更有利于樣品基因表達(dá) 退火溫度 Annealing temperature 57 58 60 62 Cq 值 Cq value 模板濃度 1 Concentration 1 14 65 15 01 12 80 13 21 模板濃度 2 Concentration 2 17 77 16 51 15 23 15 95 模板濃度 3 Concentration 3 19 23 19 71 16 63 18 87 熒光強(qiáng)度 Intensity of fluorescence 102 56 104 33 108 52 103 94 圖 3 膠回收電泳結(jié)果 Fig 3 Gel recovery product detection electropherogram 表 3 不同退火溫度下實(shí)時(shí)熒光定量 PCR Cq 值和熒光強(qiáng)度 Table 3 Cq value and intensity of fluorescence signal in different annealing temperature A B C 加入 DNA 模板濃度分別為 1 2 和 3 L 10 mol L 1 A B and C showed t hat the amount of DNA template was 1 2 and 3 L 10 mol L 1 respectively 圖 4 不同 DNA 濃度熔解曲線 Fig 4 Melting curves of different DNA concentrations A B C 溫度 T emperature 60 70 80 90 溫度 T emperature 60 70 80 90 溫度 T emperature 60 70 80 90 熒光強(qiáng)度 A U Intensity of fluorescence M 1 2 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 13 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第 51 卷 2 3 3 引物濃度 引 物 以 0 2 0 3 和 0 4 L 10 mol L 1 添 加 到 反 應(yīng) 系 統(tǒng) 中 時(shí) 可 根 據(jù) 熔 解 曲 線 確 定 適 合 引 物 量 見圖 5 由 圖 5 可 知 當(dāng) 體 系 中 引 物 量 為 0 2 L 10 mol L 1 時(shí) 熔 解 曲 線 表 達(dá) 最 穩(wěn) 定 當(dāng) 引 物 添 加 量 為 0 3 或 0 4 L 時(shí) 反 應(yīng) 熔 解 曲 線 明 顯 不 一 致 且 曲 線 導(dǎo) 數(shù) 不 同 當(dāng) 引 物 添 加 0 2 L 時(shí) 熔 解 曲 線 顯 示 相 同 趨 勢 反 應(yīng) 過 程 更 穩(wěn) 定 因 此 體 系 中引物最適添加量為 0 2 L 10 mol L 1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度 ng L 1 Concentration of standard DNA 1 36 10 7 1 36 10 6 1 36 10 5 1 36 10 4 1 36 10 3 1 36 10 2 1 36 10 1 1 36 10 0 1 36 10 1 Cq 值 Cq value 30 62 28 22 22 92 20 08 16 92 13 02 9 36 7 17 1 8 A B C 加入的引物濃度分別為 0 2 0 3 和 0 4 L 10 mol L 1 A B and C were primers added 0 2 0 3 and 0 4 L 10 mol L 1 respectively 圖 5 不同引物濃度熔解曲線 Fig 5 Melting curves of different primer concentrations A B C 溫度 T emperature 60 70 80 90 溫度 T emperature 60 70 80 90 溫度 T emperature 60 70 80 90 2 4 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線建立 應(yīng) 用 上 述 優(yōu) 化 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 體 系 對 濃 度 梯 度 為 1 36 10 1 1 36 10 7 ng L 1 標(biāo) 準(zhǔn) 品 作 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 處 理 獲 得 各 自 Cq 值 見 表 4 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 見 圖 6 由 于 1 36 10 1 1 36 10 7 ng L 1 間 濃 度 拷 貝 數(shù) 與 其 對 應(yīng) Cq 值 具 有 良 好 線 性 關(guān) 系 因 此 選 擇 此 濃 度 梯 度 為 模 板 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 相 關(guān) 系 數(shù) R 2 為 0 995 0 9 5 斜 率 為 3 54 3 58 3 10 擴(kuò) 增 效 率 為 108 2 3 90 110 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 公 式 為 y 28 06 3 54 x 2 5 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 靈 敏 度 穩(wěn) 定 性 和 可 重 復(fù) 性 檢 驗(yàn) 選 擇 1 36 10 1 1 36 10 7 ng L 1 10 倍 濃 度 梯 度 的 7 個(gè) 標(biāo) 準(zhǔn) 品 作 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 P CR 反 應(yīng) 如 圖 7 所 示 檢 測 到 標(biāo) 準(zhǔn) 品 DNA 最 小 濃 度 為 1 36 10 6 ng L 1 為 驗(yàn) 證 該 體 系 可 重 復(fù) 性 和 穩(wěn) 定 性 測 試 3 個(gè) 濃 度 標(biāo) 準(zhǔn) 品 批 次 內(nèi) 和 批 次 間 重 復(fù) 性 表 5 所 示 為 反 應(yīng) Cq 值 標(biāo) 準(zhǔn) 差 和 變 異 系 數(shù) 其 中 組 內(nèi) 和 組 間 重 復(fù) 變 異 系 數(shù) 均 小 于 2 說 明 該 體 系 具 有 良 好 的 可 重 復(fù)性和穩(wěn)定性 圖 6 黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig 6 Standard curve of Corynespora cassiicola using real timefluorescence quantitativePCR 表 4 濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng) Cq 值 Table 4 Cq value of concentration gradient standard DNA y 3 5435 x 28 061 R 2 0 9954 Log genomic DNA quality fg L 1 Cq 值 Cq value 0 2 4 6 8 2 35 30 25 20 15 10 5 0 熒光強(qiáng)度 A U Intensity of fluorescence 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 14 張艷菊等 黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法的建立與應(yīng)用 第 3 期 2 6 應(yīng) 用 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 檢 測 黃 瓜 葉 片 中 棒 孢 葉斑病菌潛伏侵染量動(dòng)態(tài)變化 2 6 1 黃瓜接種后發(fā)病情況 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 點(diǎn) 滴 接 種 黃 瓜 真 葉 葉 盤 后 將 溫 度 控 制 在 17 25 相 對 濕 度 80 以 上 參 考 黃 瓜 棒 孢 葉 斑 病 菌 病 情 分 級(jí) 標(biāo) 準(zhǔn) 17 發(fā) 病 癥 狀 及 病 情 級(jí) 別 如 圖 8 所 示 其 中 A 表 示 0 級(jí) 發(fā) 病 植 株 葉 片 癥 狀 B 表 示 1 級(jí) 發(fā) 病 植 株 葉 片 癥 狀 C 表 示 2 級(jí) 發(fā) 病 植 株 葉 片 癥 狀 D 表 示 3 級(jí) 發(fā) 病 植 株 葉 片 癥 狀 E 表示 4 級(jí)發(fā)病植株葉片癥狀 組內(nèi) Intra assay 組間 Inter assay 標(biāo)準(zhǔn)品濃度 ng L 1 Concentration 濃度 1 濃度 2 濃度 3 濃度 1 濃度 2 濃度 3 Cq 值 Cq value 1 18 41 22 61 27 01 18 67 22 71 27 08 2 18 49 22 69 27 09 18