鳶尾種苗中截獲的草莓滑刃線蟲形態(tài)和分子鑒定.pdf

收 稿日期 修 訂日期 基 金項目 國家重點研發(fā)計劃 上海出入境檢驗檢疫科研項目 通 信作者 鳶尾種苗中截獲的草莓滑刃線蟲形態(tài)和分子鑒定 王 晨 俞 祿珍 宋 紹禕 李 友軍 田 沂民 上海東郁園林科技有限公司 上 海 中華人民共和國上海海關(guān) 上 海 摘 要 草莓滑刃線蟲是一種重要的葉和芽寄生線蟲 可侵染多種重要花卉 經(jīng)濟(jì)作物 被列入我國檢疫性有害生物 名錄 目前 草莓滑刃線蟲的鑒定以形態(tài)學(xué)鑒定為主 但一線口岸常分離不到雌蟲 鑒定困難 本研究采用形態(tài)特 征和分子特征相結(jié)合的方法對草莓滑刃線蟲進(jìn)行鑒定 對鳶尾種苗中截獲的滑刃屬線蟲群體雌蟲 雄蟲進(jìn)行形態(tài)觀 察和形態(tài)測計并與已報道文獻(xiàn)進(jìn)行比較 擴(kuò) 增該群體的 區(qū) 并測序 構(gòu)建基于 序列的系統(tǒng)發(fā)育 進(jìn) 化樹 采用草莓滑刃線蟲特異引物對該群體 樣 本進(jìn)行擴(kuò)增 結(jié)果表明 該群體與草莓滑刃線蟲俄羅斯種群 的測量值相接近 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析顯示 該群體與 公 布的草莓滑刃線蟲均處于同一進(jìn)化支 采用草莓滑刃 線蟲特異引物 擴(kuò)增可產(chǎn)生片段大小為 的 目的條帶 關(guān)鍵詞 草莓滑刃線蟲 形態(tài)學(xué)特征 系統(tǒng)發(fā)育分析 鑒定 中圖分類號 文 獻(xiàn)標(biāo)識碼 草 莓滑刃線蟲 是 一 種葉和芽寄生線蟲 可侵染多種重要花卉 經(jīng)濟(jì)作 物 造成葉片 幼芽 嫩枝嚴(yán)重?fù)p傷 是極具破壞性 的 具有重要經(jīng)濟(jì)意義的線蟲 草 莓是該線蟲典 型的寄主 感染該線蟲后 植株結(jié)果量大大減少且果 小 歪曲 嚴(yán)重影響草莓的品質(zhì)及產(chǎn)量 該 線蟲 還可侵染蕨類 百合科 石蒜科 鳶尾科 毛茛科 菊 科 報春花科等 多 種植物 其中涉及多種經(jīng)濟(jì)價 值較高的觀葉 觀花植物 已成為世界多個國家花卉 產(chǎn)業(yè)的重要威脅之一 該 線蟲被我國列入檢疫 性有害生物名錄 年 年 上 ?？诎抖啻?在進(jìn) 境 鈴 蘭 酢 漿 草 落 新婦 芍 藥 等 觀賞花卉種苗中截獲草莓滑刃線蟲 目 前 草莓滑刃線蟲的鑒定以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定為 主 但草莓滑刃線蟲及其近似種的形態(tài)特征極其相 似 采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法難以區(qū)分 且分離不 到雌蟲時 僅靠幼蟲或雄蟲無法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定 故該 法的使用局限性較大 本實驗室通過查閱國內(nèi)外文 獻(xiàn)并開展試驗摸索 建立了草莓滑刃線蟲形態(tài)學(xué)與 分子生物學(xué)相結(jié)合的鑒定技術(shù) 可供參考使用 現(xiàn)將 上?？诎哆M(jìn)境一批次鳶尾種苗中草莓滑刃線蟲的檢 疫過程報道如下 材 料與方法 線 蟲分離 口岸進(jìn)境的鳶尾種苗為繁殖材料 地下部分根 系稍修剪 地上部分修剪后高度僅 左 右 含基 部莖 葉及芽 剪 取鳶尾種苗的地上部分 采用淺 盤法進(jìn)行線蟲分離 次日 過 目網(wǎng)篩收集線蟲 在 體視顯微鏡下鏡檢 形 態(tài)學(xué)鑒定 挑取線蟲制成臨時玻片 在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行 形態(tài)觀察 拍照及測量 并采用 公 式對線蟲 進(jìn)行測計 分 子生物學(xué)鑒定 線蟲 提 取 用挑針挑取線蟲若干條 放入去離子水中洗滌 次 備用 挑取單條經(jīng)過洗滌的線蟲 用挑針捅破 或割 成 多 段 采 用 試 劑盒提取 通 用引物 擴(kuò) 增 采用線蟲 通 用引物對線蟲 進(jìn) 行 擴(kuò) 增 引物為 反 應(yīng) 體 系 包 括 引 物各 模 板 聚 合 酶 總 體積 擴(kuò) 增程序為 個 循環(huán) 擴(kuò) 增產(chǎn)物在 瓊 脂糖凝膠 緩 沖液中 電 泳 染 色 后 用 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) 分析 將所得 產(chǎn) 物送上海生工生物有限公司進(jìn) 行測序 測得的序列用 程 序比對后進(jìn)行校 對和拼接 并在 中 進(jìn) 行序列分 析 利用 軟 件以最大似然法 構(gòu) 建系統(tǒng)進(jìn)化樹 特異引物 擴(kuò) 增 采用草莓滑刃線蟲的特異引物對線蟲 進(jìn) 行 擴(kuò) 增 上 游 引 物 下 游 引 物 反 應(yīng) 體系同 擴(kuò) 增程序參照 等 預(yù) 期 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為 結(jié) 果與分析 形 態(tài)學(xué)描述 雌蟲 蟲體細(xì)長 熱殺死后蟲體直到彎 側(cè)區(qū)窄 側(cè)線 條 頭部稍高 光滑 前端平 略縊縮 口針 細(xì) 口針基部球小而明顯 食道體部呈細(xì)長管狀 中 食道球明顯 呈長卵圓形 食道腺長葉狀 背覆蓋 腸 陰門位于體中后部 陰門唇稍突起 陰門橫裂 陰道向前傾斜 陰道長約為陰門處體寬的 單 卵巢 前伸 卵母細(xì)胞單行排列 受精囊長卵圓形 通常有精子 后陰子宮囊長囊狀 長度超過肛陰距 的 常有精子 尾長圓錐形 末端尖細(xì) 中間有 一鈍的尾尖突 雄蟲 熱殺死后蟲體尾部向腹面彎曲 體前部與 雌蟲相似 單精巢 前伸 精母細(xì)胞單行排列 交合 刺玫瑰刺形 有中等發(fā)達(dá)的基頂和基喙 交合刺背緣 長 尾 部具 對尾乳突 分別位于 肛門后 尾中部和近尾端處 尾圓錐形 末端有 個 鈍的尾尖突 測 量值 本研究種群草莓滑刃線蟲雌蟲的形態(tài)測量值和 其他種群比較結(jié)果顯示 與 描 述的俄羅斯 種群相比 值 基本吻合 其他測量值體 長 口針長 尾長較長 但其數(shù)值范圍部分重疊 與 顧建鋒描述的荷蘭種群相比 值 及口針長一 致性較高 雖本種群體長較長 但在荷蘭種群的范圍 內(nèi) 值 存在一定差異 與國內(nèi)劉維志描述的種群 相比 值 口 針長 尾長較一致 值 較 大 但測量值均有重疊范圍 雄蟲測量值體長 口針 長較其他種群較長 值均與各種群測量 值范圍 大部分重疊 卷 第 期 王晨等 鳶尾種苗中截獲的草莓滑刃線蟲形態(tài)和分子鑒定 圖 草莓滑刃線蟲雌蟲形態(tài)特征 圖 草莓滑刃線蟲雄蟲形態(tài)特征 表 鳶尾種苗中截獲的草莓滑刃線蟲雌蟲與其他種群的測量值比較 形 態(tài)指標(biāo) 本 研究種群 中 國種群 荷 蘭種群 俄 羅斯種群 口 針長 尾 長 代 表樣本數(shù) 為 體長 為體長與最大體寬的比值 為體長與體前端至食道與腸連接處長度的比值 為 體長與尾長的比值 為 尾長 與肛門處體寬的比值 為體前端至陰門的距離 體 長 長度測量單位為 下 同 表 鳶尾種苗中截獲的草莓滑刃線蟲雄蟲與其他種群的測量值比較 形 態(tài)指標(biāo) 本 研究種群 中 國種群 荷 蘭種群 俄 羅斯種群 口 針長 交 合刺長 尾 長 圖 基于滑刃屬線蟲 區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹 區(qū) 系統(tǒng)進(jìn)化分析 采用引物 對 該種群線蟲的 區(qū) 域進(jìn)行擴(kuò)增 得到約 的 片段 經(jīng)雙向 測序及拼接得到 序 列 通過 比 對分 析 發(fā)現(xiàn)該序列 登 錄號為 與 草莓 滑刃線蟲 序 列相差 相 似 度達(dá) 系統(tǒng)發(fā)育樹顯 示該線 蟲與草莓滑刃線蟲位于同一分支 支持率為 其 中 本 線 蟲 群 體 與 俄 羅 斯 日 本 的種 群親緣關(guān)系更近 特 異引物檢測 采用草莓滑刃線蟲特異引物擴(kuò)增本研究種群雌 蟲 幼蟲 樣 本及陽性對照均獲得 的 特 異性片段 空白對照未發(fā)生特異性擴(kuò)增 圖 圖 草莓滑刃線蟲特異引物 擴(kuò)增凝膠電泳圖 卷 第 期 王晨等 鳶尾種苗中截獲的草莓滑刃線蟲形態(tài)和分子鑒定 綜 合形態(tài)學(xué)特征及分子鑒定結(jié)果 確認(rèn)鳶尾種 苗中截獲的線蟲為草莓滑刃線蟲 討 論 近 年來 我國花卉產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大 種球的進(jìn) 口需求量也大幅增加 據(jù)統(tǒng)計 我國已成為僅次于 美國的荷蘭花卉種球第二大進(jìn)口國 進(jìn) 口的種 球品種繁多 主要有百合 風(fēng)信子 郁金香 洋水仙 等 球根類花卉是多年生草本花卉 可在地下存活 多年 因此其根莖攜帶有害線蟲的風(fēng)險很高 近年 來 我國口岸多次在進(jìn)境種苗中截獲鱗球莖莖線蟲 腐爛莖線蟲 草莓滑刃線蟲 菊花滑刃線蟲等檢疫性 線蟲 草 莓滑刃線蟲是重要的檢疫性病原線蟲 該線 蟲世界分布范圍廣 歐洲 原蘇聯(lián)各成員國 日本 美 國 加拿大 新西蘭 澳大利亞等國均有報道 我國局 部地區(qū) 遼寧 廣東 云南等 有報道發(fā)生 該 線 蟲的遠(yuǎn)距離傳播主要依靠種苗的調(diào)運 因此口岸應(yīng) 加強(qiáng)對進(jìn)境種苗的線蟲檢疫工作 謹(jǐn)防檢疫性線蟲 隨種苗在國內(nèi)種植時擴(kuò)散 對我國農(nóng)林業(yè) 花卉業(yè)生 產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅 目前對草莓滑刃線蟲的鑒定主要依靠傳統(tǒng)的形 態(tài)學(xué)鑒定 但草莓滑刃線蟲及其近似種的形態(tài)特征 極其相似 傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法很難區(qū)分 如 等 都 曾在一段時間內(nèi)被認(rèn)為是草莓滑刃線蟲的同物異 名 本 實驗室采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合 的鑒定方法 可實現(xiàn)對樣品中的幼蟲進(jìn)行鑒定 且對 鑒定人員的專業(yè)性要求不高 適合一線口岸進(jìn)行 推廣 本次鳶尾種苗中截獲的草莓滑刃線蟲種群 其形態(tài)測量值與俄羅斯種群最接近 基于 區(qū) 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā) 育樹顯示 該種群與俄羅斯種群親 緣關(guān)系 更 近 這 可 能 與 該 批 鳶 尾 種 苗 來 自 于 荷 蘭相關(guān) 參 考文獻(xiàn) 國 家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局 草 莓滑刃線蟲 檢疫鑒定方法 北京 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社 劉 維 志 植 物 線 蟲 志 北 京 中國農(nóng)業(yè)出版社 張 紹升 植物線蟲病害診斷和治理 福州 福建科學(xué)技術(shù) 出版社 劉 維志 草莓葉芽線蟲病 新農(nóng)業(yè) 顧 建鋒 楊蘭英 徐瑛 進(jìn)口百合種球中截獲草莓滑刃線蟲 植物檢疫 李 艷梅 百合 市場仍需突破 中國花卉園藝 動植物檢驗檢疫 信息資源共享服務(wù)平臺 責(zé) 任編輯 田 喆 櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍 更 正 本 刊 年 第 期的 南方根結(jié)線蟲侵染下羅漢果 轉(zhuǎn)錄因子的鑒定分析 作 者李惠敏 李佳 慧 程穎 韋文瓊 李璐璐 陳玉梅 頁 表 中的 的 表達(dá)模式 應(yīng)無上標(biāo) 表 達(dá) 模式 則 有上標(biāo) 特此更正 并向作者和讀者致歉 植物保護(hù) 編輯部 年 月 日