溫室黃瓜連作對(duì)土壤真菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的影響.pdf

華 北 農(nóng) 學(xué) 報(bào) 2020 35 1 194 204 收 稿 日 期 2019 10 09 基 金 項(xiàng) 目 國(guó) 家 自 然 科 學(xué) 基 金 項(xiàng) 目 41601250 作 者 簡(jiǎn) 介 李 玉 嬌 1985 女 河 南 商 丘 人 在 讀 碩 士 主 要 從 事 土 壤 微 生 物 生 態(tài) 學(xué) 研 究 通 訊 作 者 劉 星 1987 男 河 南 信 陽(yáng) 人 講 師 博 士 主 要 從 事 植 物 營(yíng) 養(yǎng) 學(xué) 和 土 壤 微 生 物 學(xué) 研 究 吳 大 付 1965 男 河 南 確 山 人 教 授 博 士 主 要 從 事 農(nóng) 業(yè) 環(huán) 境 保 護(hù) 與 可 持 續(xù) 發(fā) 展 的 教 學(xué) 與 研 究 溫 室 黃 瓜 連 作 對(duì) 土 壤 真 菌 數(shù) 量 和 群 落 結(jié) 構(gòu) 的 影 響 李 玉 嬌 1 劉 星 1 吳 大 付 1 陳 碧 華 2 任 秀 娟 1 唐 蛟 1 1 河 南 科 技 學(xué) 院 資 源 與 環(huán) 境 學(xué) 院 河 南 新 鄉(xiāng) 453003 2 河 南 科 技 學(xué) 院 園 藝 園 林 學(xué) 院 河 南 新 鄉(xiāng) 453003 摘 要 長(zhǎng) 期 集 約 化 種 植 帶 來(lái) 的 連 作 障 礙 問(wèn) 題 已 成 為 限 制 設(shè) 施 蔬 菜 行 業(yè) 可 持 續(xù) 發(fā) 展 的 重 要 瓶 頸 闡 明 設(shè) 施 蔬 菜 長(zhǎng) 期 連 作 條 件 下 的 土 壤 障 礙 因 子 類(lèi) 型 是 發(fā) 展 形 成 高 效 連 作 障 礙 克 服 技 術(shù) 的 前 提 以 豫 北 地 區(qū) 設(shè) 施 黃 瓜 連 作 生 產(chǎn) 系 統(tǒng) 為 研 究 對(duì) 象 通 過(guò) 采 集 具 有 不 同 黃 瓜 連 作 年 限 的 土 壤 樣 品 1 5 10 15 20a 應(yīng) 用Real timePCR 和 高 通 量 測(cè) 序 的 手 段 探 討 了 溫 室 黃 瓜 連 作 對(duì) 土 壤 真 菌 數(shù) 量 和 群 落 結(jié) 構(gòu) 的 影 響 結(jié) 果 表 明 溫 室 黃 瓜 連 作 顯 著 改 變 了 土 壤 真 菌 數(shù) 量 隨 著 連 作 年 限 延 長(zhǎng) 真 菌 數(shù) 量 呈 先 增 加 后 降 低 的 趨 勢(shì) 且 在 連 作10a 土 壤 中 達(dá) 到 峰 值 土 壤 真 細(xì) 比 變 化 趨 勢(shì) 與 真 菌 數(shù) 量 一 致 高 通 量 測(cè) 序 分 析 進(jìn) 一 步 表 明 黃 瓜 連 作 顯 著 影 響 了 真 菌 群 落 的 多 樣 性 而 非 多 樣 性 隨 著 連 作 年 限 延 長(zhǎng) 真 菌 群 落 中 獨(dú) 有 的OTU 數(shù) 量 逐 漸 減 少 子 囊 菌 門(mén) Ascomycota 是 門(mén) 水 平 下 連 作 土 壤 真 菌 群 落 的 優(yōu) 勢(shì) 成 員 但 其 平 均 相 對(duì) 豐 度 對(duì) 黃 瓜 連 作 響 應(yīng) 不 敏 感 在 目 水 平 小 囊 菌 目 Microascales 盤(pán) 菌 目 Pezizales 未 分 類(lèi) 子 囊 菌 Norank p Ascomycota 和 糞 殼 菌 目 Sordariales 是 真 菌 群 落 優(yōu) 勢(shì) 成 員 在 屬 水 平 假 埃 希 氏 菌 屬 Pseudallescheria Lasiobolidium 赭 霉 屬 Ochroconis 和 毛 殼 菌 屬 Chaetomium 是 真 菌 群 落 優(yōu) 勢(shì) 成 員 這 些 優(yōu) 勢(shì) 真 菌 目 和 屬 的 平 均 相 對(duì) 豐 度 受 溫 室 黃 瓜 連 作 影 響 顯 著 且 多 數(shù) 與 土 壤 理 化 因 子 存 在 顯 著 的 線 性 相 關(guān) 關(guān) 系 冗 余 分 析 證 明 土 壤 硝 態(tài) 氮 速 效 鉀 和 有 機(jī) 質(zhì) 含 量 是 驅(qū) 動(dòng) 溫 室 黃 瓜 連 作 土 壤 真 菌 群 落 結(jié) 構(gòu) 變 化 的 主 要 因 子 總 的 來(lái) 看 溫 室 黃 瓜 長(zhǎng) 期 連 作 顯 著 影 響 了 土 壤 真 菌 數(shù) 量 和 群 落 結(jié) 構(gòu) 關(guān) 鍵 詞 黃 瓜 連 作 真 菌 數(shù) 量 群 落 結(jié) 構(gòu) 中 圖 分 類(lèi) 號(hào) S642 2 S154 3 文 獻(xiàn) 標(biāo) 識(shí) 碼 A 文 章 編 號(hào) 1000 7091 2020 01 0194 11 d o i 10 7668 hbnxb 20190712 EffectsofContinuousCroppingofGreenhouseCucumberonSoilFungal AbundanceandCommunityStructureProvince LIYujiao 1 LIUXing 1 WUDafu 1 CHENBihua 2 RENXiujuan 1 TANGJiao 1 1 SchoolofResourcesandEnvironment HenanInstituteofScienceandTechnology Xinxiang 453003 China 2 SchoolofHorticultureLandscapeArchitecture HenanInstitute ofScienceandTechnology Xinxiang 453003 China Abstract Continuouscroppingobstaclescausedbylong termintensivecultivationhasbecomeanimportant bottleneckrestrictingthesustainabledevelopmentofgreenhousevegetableindustry Increasingtheknowledgeavail ableregardingthesoilmechanismsbehindcontinuouscroppingobstaclesisbeneficialtodeveloptheeffectiveap proachestoovercomethisdifficultproblempresentinintensivegreenhousevegetableproduction Here basedona continuousgreenhousecucumbercroppingsystemlocatedatNorthHenanProvinceofChina weevaluatedthechan gesinsoilfungalabundanceandcommunitystructurewithincreasingcucumbercultivationhistory theduration from1to20yearswiththeintervalof5yearspertreatment throughReal timePCRandhigh throughputsequen cing Continuouscroppingofgreenhousecucumbersignificantlyalteredsoilfungalabundance Inbrief fungala bundanceinitiallyincreasedandthendecreasedasincreasinggreenhousecultivationhistory andthepeakoccurred atthetenthyearaftercontinuouscroppingofgreenhousecucumber Thetendencyoftheratioofsoilfungaltobac terial abundance with increasing greenhouse cultivation history was in line with soil fungal abundance High 1 期 李 玉 嬌 等 溫 室 黃 瓜 連 作 對(duì) 土 壤 真 菌 數(shù) 量 和 群 落 結(jié) 構(gòu) 的 影 響 195 throughputsequencingrevealedthatthe diversityratherthan diversityofsoilfungalcommunitywasobviously alteredbycontinuouscroppingofgreenhousecucumber Increasinggreenhousecucumbercultivationhistorylowered thenumbersofuniqueOTUinfungalcommunity Atphylumlevel Ascomycotadominatedsoilfungalcommunity anditsaveragerelativeabundancewasinsensitivetocontinuouscroppingofgreenhousecucumber Atorderlevel Microascales Pezizales Norank p AscomycotaandSordarialestogetherdominatedfungalcommunity Atgenuslev el Pseudallescheria Lasiobolidium OchroconisandChaetomiumwerethepredominantmembersinfungalcommuni ty Continuouscroppingofgreenhousecucumbersignificantlychangedaveragerelativeabundancesofthesedomi nantcommunitymembers Meanwhile mostofthesedominantcommunitymemberssignificantlycorrelatedtosoil physicochemicalvariables RDAanalysisindicatedthatsoilnitrateandavailablepotassiumandorganicmatercon tentswerethemostimportantcontributorstothealterationofsoilfungalcommunitystructure Inconclusion there sultsdemonstratedsoilfungalabundanceandcommunitystructureasaffectedbycontinuouscroppingofgreenhouse cucumber Keywords Cucumber Continuouscropping Fungiabundance Communitystructure 設(shè) 施 蔬 菜 栽 培 是 現(xiàn) 代 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 的 重 要 組 成 部 分 能 夠 顯 著 提 高 自 然 資 源 利 用 效 率 增 加 農(nóng) 民 經(jīng) 濟(jì) 收 益 1 中 國(guó) 是 全 世 界 最 大 的 設(shè) 施 蔬 菜 生 產(chǎn) 國(guó) 且 種 植 規(guī) 模 仍 以 每 年10 左 右 的 速 度 增 長(zhǎng) 2014 年 全 國(guó) 設(shè) 施 蔬 菜 種 植 面 積 達(dá) 到386 10 4 hm 2 產(chǎn) 值 超7000 億 元 從 業(yè) 人 員4000 萬(wàn) 以 上 2 根 據(jù) 農(nóng) 業(yè) 農(nóng) 村 部 全 國(guó) 設(shè) 施 蔬 菜 重 點(diǎn) 區(qū) 域 發(fā) 展 規(guī) 劃 2015 2020 年 到2020 年 全 國(guó) 將 新 增 設(shè) 施 蔬 菜 生 產(chǎn) 面 積7 0 10 4 hm 2 總 產(chǎn) 值 超 過(guò)10000 億 元 其 收 入 占 農(nóng) 民 人 均 純 收 入10 以 上 在 近 年 來(lái) 農(nóng) 業(yè) 供 給 側(cè) 結(jié) 構(gòu) 性 改 革 的 大 背 景 下 促 進(jìn) 設(shè) 施 蔬 菜 行 業(yè) 的 提 質(zhì) 增 效 和 健 康 發(fā) 展 對(duì) 于 解 決 三 農(nóng) 問(wèn) 題 促 進(jìn) 返 鄉(xiāng) 就 業(yè) 和 實(shí) 現(xiàn) 鄉(xiāng) 村 振 興 的 戰(zhàn) 略 目 標(biāo) 具 有 重 要 意 義 然 而 就 整 個(gè) 設(shè) 施 蔬 菜 產(chǎn) 業(yè) 鏈 而 言 在 生 產(chǎn) 環(huán) 節(jié) 由 于 長(zhǎng) 期 集 約 化 種 植 所 帶 來(lái) 的 連 作 障 礙 問(wèn) 題 依 然 是 限 制 我 國(guó) 設(shè) 施 蔬 菜 產(chǎn) 業(yè) 可 持 續(xù) 發(fā) 展 的 重 要 瓶 頸 之 一 3 因 此 迫 切 需 要 闡 明 設(shè) 施 蔬 菜 連 作 障 礙 形 成 機(jī) 理 集 約 化 設(shè) 施 蔬 菜 栽 培 呈 現(xiàn) 土 壤 耕 作 頻 繁 復(fù) 種 指 數(shù) 高 和 水 肥 供 應(yīng) 量 大 的 顯 著 特 點(diǎn) 菜 農(nóng) 受 利 益 驅(qū) 使 長(zhǎng) 期 連 作 種 植 導(dǎo) 致 土 壤 惡 化 病 蟲(chóng) 害 猖 獗 經(jīng) 濟(jì) 產(chǎn) 量 降 低 和 品 質(zhì) 下 降 等 嚴(yán) 重 問(wèn) 題 健 康 的 土 壤 環(huán) 境 是 作 物 高 產(chǎn) 高 效 和 農(nóng) 業(yè) 可 持 續(xù) 發(fā) 展 的 基 礎(chǔ) 盡 管 不 同 作 物 品 種 或 地 區(qū) 之 間 的 連 作 障 礙 機(jī) 理 可 能 存 在 差 別 但 主 要 源 自 土 壤 4 土 壤 是 組 分 多 樣 化 具 有 高 度 異 質(zhì) 性 和 復(fù) 雜 性 且 易 于 擾 動(dòng) 的 生 態(tài) 系 統(tǒng) 長(zhǎng) 期 連 作 常 常 導(dǎo) 致 土 壤 性 質(zhì) 劣 變 并 對(duì) 作 物 生 長(zhǎng) 發(fā) 育 形 成 負(fù) 反 饋 調(diào) 節(jié) 5 6 闡 明 設(shè) 施 蔬 菜 連 作 條 件 下 土 壤 障 礙 因 子 類(lèi) 型 是 理 清 連 作 障 礙 機(jī) 理 并 發(fā) 展 形 成 高 效 的 連 作 土 壤 障 礙 因 子 消 減 技 術(shù) 的 重 要 前 提 早 前 的 學(xué) 者 也 從 設(shè) 施 連 作 土 壤 理 化 和 生 化 性 質(zhì) 變 化 角 度 得 到 了 大 量 研 究 結(jié) 論 諸 如 土 壤 物 理 結(jié) 構(gòu) 惡 化 土 壤 板 結(jié) 和 團(tuán) 聚 體 穩(wěn) 定 性 降 低 養(yǎng) 分 不 均 衡 吸 收 和 作 物 根 區(qū) 養(yǎng) 分 虧 缺 土 壤 酸 化 和 次 生 鹽 漬 化 土 壤 酶 活 性 衰 減 化 感 自 毒 作 用 土 傳 致 病 菌 滋 生 和 根 結(jié) 線 蟲(chóng) 富 集 等 7 8 微 生 物 是 土 壤 生 態(tài) 系 統(tǒng) 的 重 要 成 員 其 在 遺 傳 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 上 具 有 高 度 的 多 樣 性 有 效 驅(qū) 動(dòng) 著 有 機(jī) 質(zhì) 分 解 養(yǎng) 分 循 環(huán) 污 染 物 降 解 和 能 量 流 動(dòng) 等 一 系 列 土 壤 生 物 學(xué) 過(guò) 程 同 時(shí) 在 抑 制 土 傳 病 害 和 維 持 作 物 健 康 方 面 發(fā) 揮 重 要 作 用 隨 著 分 子 生 物 學(xué) 技 術(shù) 的 進(jìn) 步 和 組 學(xué) 技 術(shù) 的 應(yīng) 用 土 壤 微 生 物 及 其 群 落 組 成 和 結(jié) 構(gòu) 在 連 作 種 植 條 件 下 的 行 為 變 化 特 征 越 來(lái) 越 受 到 研 究 者 的 關(guān) 注 研 究 業(yè) 已 證 明 長(zhǎng) 期 連 作 能 夠 顯 著 改 變 土 壤 中 微 生 物 數(shù) 量 和 群 落 結(jié) 構(gòu) 表 現(xiàn) 為 降 低 土 壤 微 生 物 多 樣 性 并 隨 著 連 作 年 限 延 長(zhǎng) 土 壤 微 生 物 群 落 結(jié) 構(gòu) 顯 著 改 變 從 細(xì) 菌 型 向 真 菌 型 轉(zhuǎn) 變 土 傳 病 害 顯 著 增 加 9 15 進(jìn) 一 步 研 究 顯 示 長(zhǎng) 期 連 作 導(dǎo) 致 土 壤 微 生 物 群 落 結(jié) 構(gòu) 受 到 破 壞 種 間 互 作 呈 現(xiàn) 無(wú) 序 和 弱 化 的 狀 態(tài) 且 有 益 微 生 物 或 具 有 潛 在 生 防 能 力 的 微 生 物 豐 度 降 低 對(duì) 土 傳 致 病 菌 的 競(jìng) 爭(zhēng) 能 力 下 降 16 24 然 而 微 生 物 受 作 物 種 類(lèi) 品 種 土 壤 類(lèi) 型 質(zhì) 地 地 理 環(huán) 境 和 氣 候 耕 作 和 栽 培 條 件 養(yǎng) 分 供 應(yīng) 等 各 種 因 素 影 響 較 大 不 同 地 區(qū) 間 土 壤 微 生 物 種 類(lèi) 數(shù) 量 多 樣 性 和 組 成 結(jié) 構(gòu) 等 存 在 明 顯 差 異 因 而 其 對(duì) 連 作 種 植 的 響 應(yīng) 特 征 可 能 存 在 差 別 豫 北 地 區(qū) 是 河 南 省 劃 定 的 蔬 菜 種 植 產(chǎn) 業(yè) 優(yōu) 勢(shì) 區(qū) 但 區(qū) 域 內(nèi) 設(shè) 施 蔬 菜 連 作 障 礙 的 土 壤 微 生 態(tài) 學(xué) 機(jī) 理 迄 今 為 止 鮮 有 報(bào) 道 鑒 于 此 以 黃 瓜 這 一 傳 統(tǒng) 的 設(shè) 施 蔬 菜 主 栽 作 物 為 研 究 對(duì) 象 通 過(guò) 采 集 具 有 不 同 黃 瓜 連 作 年 限 的 土 壤 樣 品 結(jié) 合Real timePCR 和 高 通 量 測(cè) 序 等 技 術(shù) 手 段 研 究 了 設(shè) 施 黃 瓜 連 作 對(duì) 土 壤 真 菌 數(shù) 量 和 群 落 結(jié) 構(gòu) 的 影 響 旨 在 為 196 華 北 農(nóng) 學(xué) 報(bào) 35 卷 闡 明 區(qū) 域 內(nèi) 設(shè) 施 蔬 菜 連 作 障 礙 機(jī) 理 和 發(fā) 展 相 關(guān) 的 連 作 土 壤 障 礙 因 子 消 減 技 術(shù) 提 供 幫 助 1 材 料 和 方 法 1 1 試 驗(yàn) 區(qū) 概 況 研 究 區(qū) 域 為 河 南 省 新 鄉(xiāng) 市 牧 野 區(qū) 朱 莊 屯 村 地 理 坐 標(biāo)35 21 12 N 113 55 2 E 平 均 海 拔 約 56m 供 試 土 壤 為 壤 質(zhì) 潮 土 該 區(qū) 地 處 黃 河 中 下 游 屬 于 暖 溫 帶 大 陸 性 季 風(fēng) 氣 候 四 季 分 明 雨 熱 同 季 降 水 集 中 年 均 氣 溫14 全 年 無(wú) 霜 期220d 年 均 降 水 量573 4mm 水 資 源 豐 富 土 層 深 厚 土 壤 肥 沃 設(shè) 施 蔬 菜 方 面 主 要 栽 培 黃 瓜 番 茄 辣 椒 和 茄 子 等 種 植 結(jié) 構(gòu) 相 對(duì) 單 一 且 大 多 處 于 長(zhǎng) 期 連 續(xù) 種 植 狀 態(tài) 連 作 障 礙 問(wèn) 題 突 出 枯 萎 病 黃 萎 病 和 青 枯 病 等 土 傳 病 害 較 為 普 遍 1 2 試 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) 和 樣 品 采 集 在 試 驗(yàn) 區(qū) 內(nèi) 選 擇 連 作 年 限 分 別 為1 5 10 15 20a 的 黃 瓜 種 植 大 棚 各3 個(gè) 用 土 鉆 按 五 點(diǎn) 取 樣 法 在 每 個(gè) 棚 內(nèi) 采 集 混 合 樣 品1 個(gè) 采 樣 深 度 為0 20cm 即 每 個(gè) 連 作 年 限 處 理 下 共 得 到 了 相 當(dāng) 于3 次 重 復(fù) 的 土 壤 樣 本 5 個(gè) 連 作 年 限 處 理 分 別 用CC1 CC5 CC10 CC15 和CC20 表 示 CC1 地 塊 前 茬 作 物 為 玉 米 2017 年 春 季 開(kāi) 始 轉(zhuǎn) 為 溫 室 黃 瓜 生 產(chǎn) 土 樣 采 集 在2017 年 秋 季 黃 瓜 收 獲 時(shí) 進(jìn) 行 以 盡 可 能 排 除 植 株 根 系 和 其 他 一 些 農(nóng) 業(yè) 管 理 措 施 對(duì) 土 壤 樣 本 的 潛 在 影 響 將 采 集 的 新 鮮 土 樣 去 除 石 塊 動(dòng) 植 物 殘 體 等 雜 質(zhì) 后 裝 入 干 凈 的 密 封 袋 帶 回 實(shí) 驗(yàn) 室 過(guò) 1mm 篩 將 過(guò) 篩 后 土 壤 分 成3 份 一 份 儲(chǔ) 存 于 80 冰 箱 內(nèi) 用 于 后 續(xù) 的 微 生 物 分 子 生 物 學(xué) 分 析 一 份 在 室 溫 下 風(fēng) 干 用 于 測(cè) 定 土 壤 常 規(guī) 理 化 性 質(zhì) 另 一 份 立 刻 用 于 測(cè) 定 土 壤 礦 質(zhì) 氮 含 量 和 相 關(guān) 生 化 性 質(zhì) 供 試 土 壤 理 化 和 生 化 性 質(zhì) 測(cè) 定 方 法 見(jiàn)Liu 等 25 的 報(bào) 道 為 最 大 限 度 地 消 除 不 同 地 塊 和 年 份 間 種 植 和 管 理 措 施 對(duì) 土 壤 取 樣 和 后 續(xù) 數(shù) 據(jù) 分 析 的 影 響 本 研 究 中 所 有 溫 室 地 塊 均 來(lái) 自 相 同 的 農(nóng) 民 種 植 合 作 社 彼 此 相 距 較 近 且 一 直 采 用 當(dāng) 地 統(tǒng) 一 的 耕 作 種 植 和 農(nóng) 藝 管 理 方 法 具 體 細(xì) 節(jié) 見(jiàn) 文 獻(xiàn) 25 1 3 土 壤 真 菌 數(shù) 量 測(cè) 定 按 產(chǎn) 品 說(shuō) 明 書(shū) 上 的 步 驟 使 用PowerSoilDNA 試 劑 盒 提 取 微 生 物 總DNA 采 用1 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 和 分 光 光 度 法 檢 測(cè)DNA 的 質(zhì) 量 和 純 度 將 提 取 的DNA 溶 解 在50 L 洗 脫 緩 沖 液 中 并 于 20 冰 箱 中 保 存 備 用 真 菌PCR 擴(kuò) 增 采 用18SrRNA 基 因 V5 V7 區(qū) 特 異 性 通 用 引 物 對(duì)SSU0817F 1196R 26 熒 光 定 量PCR 采 用ABI7500 實(shí) 時(shí) 定 量PCR 儀 進(jìn) 行 每 個(gè) 土 樣 重 復(fù)3 次 擴(kuò) 增 體 系 20 L 如 下 10 0 L ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 2 引 物 各0 8 L 5 mol L 2 LDNA 模 板 6 4 LddH 2 O 擴(kuò) 增 條 件 為 95 5min 預(yù) 變 性 94 5s 55 30s 72 40s 30 個(gè) 循 環(huán) 在 每 一 循 環(huán) 退 火 階 段 收 集 熒 光 實(shí) 時(shí) 檢 測(cè) 反 應(yīng) 并 且 記 錄 熒 光 信 號(hào) 變 化 得 出 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 熔 解 曲 線 所 得 產(chǎn) 物 用 1 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測(cè) 擴(kuò) 增 片 段 大 小 為425bp 通 過(guò) 熔 解 曲 線 驗(yàn) 證 擴(kuò) 增 專(zhuān) 一 性 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 經(jīng) 純 化 后 并 連 接 至pMD18 T 克 隆 載 體 上 轉(zhuǎn) 化 大 腸 桿 菌 挑 取 轉(zhuǎn) 化 后 平 板 上 的 白 色 單 克 隆 提 取 質(zhì) 粒 測(cè) 序 確 定 插 入DNA 片 段 是 否 正 確 采 取10 倍 梯 度 稀 釋 標(biāo) 準(zhǔn) 質(zhì) 粒 用10 2 10 7 稀 釋 液 制 備 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 確 定 閾 值 和 基 線 繪 制 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 橫 坐 標(biāo) 為 基 因 拷 貝 數(shù) 的 常 用 對(duì) 數(shù) 縱 坐 標(biāo) 為 熒 光 定 量PCR 測(cè) 得 的Ct 值 PCR 擴(kuò) 增 效 率93 96 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線R 2 為0 9994 通 過(guò)Ct 值 計(jì) 算 待 測(cè) 樣 品 中 真 菌 數(shù) 量 并 進(jìn) 一 步 計(jì) 算 各 土 壤 樣 品 的 真 菌 和 細(xì) 菌 數(shù) 量 比 值 細(xì) 菌 數(shù) 量 已 在 前 期 文 獻(xiàn) 中 報(bào) 道 25 此 處 不 再 重 復(fù) 1 4 土 壤 真 菌 群 落 結(jié) 構(gòu) 和 生 物 信 息 學(xué) 分 析 采 用 高 通 量 擴(kuò) 增 子 測(cè) 序 方 法 Illumina Miseq PE300 高 通 量 測(cè) 序 平 臺(tái) 評(píng) 估 不 同 連 作 年 限 處 理 下 土 壤 真 菌 的 多 樣 性 和 群 落 結(jié) 構(gòu) 以 土 壤 微 生 物 總DNA 為 模 板 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增 擴(kuò) 增 引 物 對(duì) 為SSU0817F 1196R 26 PCR 擴(kuò) 增 體 系 20 L 為 4 L FastPfu Buffer 5 2 LdNTPs 2 5mmol L 0 4 LFast PfuPolymerase 0 2 LBovineserumalbumin 引 物 各0 8 L 5 mol L 10ng 模 板DNA 和11 2 L ddH 2 O PCR 擴(kuò) 增 反 應(yīng) 條 件 為 95 預(yù) 變 性3min 95 變 性30s 55 退 火30s 72 延 伸40s 35 個(gè) 循 環(huán) 最 后72 再 延 伸10min PCR 產(chǎn) 物 經(jīng) 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 驗(yàn) 證 采 用AgaroseGelDNA 純 化 試 劑 盒 進(jìn) 行 純 化 并 用 分 光 光 度 計(jì) 測(cè) 定 濃 度 最 后 將PCR 產(chǎn) 物 等 量 混 合 送 上 海 美 吉 生 物 醫(yī) 藥 科 技 有 限 公 司 進(jìn) 行 高 通 量 測(cè) 序 將 高 通 量 測(cè) 序 下 機(jī) 原 始 序 列 進(jìn) 行 雙 端 序 列 拼 接 和 質(zhì) 量 過(guò) 濾 使 用QIIME 軟 件 分 析 27 對(duì) 序 列 進(jìn) 行 質(zhì) 控 刪 除 尾 部 質(zhì) 量 值20 以 下 長(zhǎng) 度 小 于200bp 的 序 列 根 據(jù) 序 列 首 尾 兩 端 的 標(biāo) 簽 和 引 物 區(qū) 分 樣 品 并 調(diào) 整 序 列 方 向 序 列 標(biāo) 簽 允 許 的 錯(cuò) 配 數(shù) 為0 最 大 引 物 錯(cuò) 配 數(shù) 為2 將 序 列 分 配 至 不 同 處 理 樣 品 使 用Uclust 的 方 法 按 照97 的 相 似 度 進(jìn) 行 可 操 作 分 類(lèi) 單 元 OperationaltaxonomicunitsOTU 聚 類(lèi) 每 個(gè)OTU 中 數(shù) 量 最 多 的 序 列 被 挑 選 為 代 表 序 列 為 得 到 每 個(gè)OTU 對(duì) 應(yīng) 的 物 種 分 類(lèi) 信 息 采 用RDPclassi 1 期 李 玉 嬌 等 溫 室 黃 瓜 連 作 對(duì) 土 壤 真 菌 數(shù) 量 和 群 落 結(jié) 構(gòu) 的 影 響 197 fier 貝 葉 斯 算 法 對(duì)97 相 似 水 平 的OTU 代 表 序 列 進(jìn) 行 分 類(lèi) 學(xué) 比 對(duì) 以Silva128 18S Eukaryota 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 為 參 考 對(duì)OTU 代 表 序 列 進(jìn) 行 比 對(duì) 分 類(lèi) 鑒 定 分 類(lèi) 置 信 度 閾 值 為70 本 研 究15 個(gè) 土 壤 樣 本 總 計(jì) 獲 得642 481 條 高 質(zhì) 量 序 列 序 列 平 均 長(zhǎng) 度 為 401bp 對(duì) 所 得 到 的 高 質(zhì) 量 序 列 按 最 小 樣 本 序 列 數(shù) 抽 平 每 個(gè) 土 壤 樣 本31374 條 序 列 用 于 后 續(xù) 的 多 樣 性 和 多 樣 性 分 析 根 據(jù)OTU 列 表 中 各 樣 品 物 種 豐 度 情 況 應(yīng) 用 軟 件MOTHUR 計(jì) 算 菌 群 多 樣 性 指 數(shù) 使 用QIIME 軟 件 對(duì)Weighted 的UniFrac 距 離 矩 陣 進(jìn) 行UPGMA 聚 類(lèi) 分 析 基 于Bray curtis 距 離 算 法 的 主 坐 標(biāo) 分 析 Principalcoordinatesanaly sis PCoA 用 于 比 較 不 同 處 理 土 壤 真 菌 群 落 結(jié) 構(gòu) 差 異 并 利 用 相 似 度 分 析 Analysisofsimilarities ANO SIM 檢 驗(yàn) 處 理 間 真 菌 群 落 結(jié) 構(gòu) 的 差 異 顯 著 性 對(duì) 少 數(shù) 平 均 豐 度 較 高 且 在Silva 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 未 能 充 分 比 對(duì) 的 OTU 在NCBIGenBank 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 進(jìn) 行 手 工 比 對(duì) 通 過(guò)Canoco4 5 軟 件 對(duì) 土 壤 理 化 性 質(zhì) 和 真 菌 群 落 結(jié) 構(gòu) 及 多 樣 性 進(jìn) 行 冗 余 分 析 Redundancyanalysis RDA 1 5 數(shù) 據(jù) 處 理 試 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 計(jì) 算 和 圖 表 繪 制 在Microsoft Excel 2007 和SigmaPlot12 0 軟 件 上 進(jìn) 行 使 用SPSS21 0 軟 件 進(jìn) 行 處 理 間 差 異 的 顯 著 性 檢 驗(yàn) One way P 0 05 圖 表 中 試 驗(yàn) 結(jié) 果 采 用 平 均 值 標(biāo) 準(zhǔn) 差 表 示 n 3 不 同 數(shù) 據(jù) 間 的 相 關(guān) 性 分 析 采 用 常 見(jiàn) 的 一 元 回 歸 模 型 進(jìn) 行 真 菌 豐 度 采 用 常 用 對(duì) 數(shù) 轉(zhuǎn) 換 來(lái) 表 示 本 研 究 所 獲 得 原 始 測(cè) 序 數(shù) 據(jù) 已 上 傳 至NCBI SRA 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 登 錄 號(hào) 為SRP145523 2 結(jié) 果 與 分 析 2 1 設(shè) 施 黃 瓜 連 作 對(duì) 土 壤 真 菌 豐 度 和 真 細(xì) 比 的 影 響 溫 室 黃 瓜 連 作 顯 著 改 變 了 土 壤 真 菌 數(shù) 量 圖1 較CC1 相 比 CC10 和CC15 真 菌 數(shù) 量 分 別 顯 著 增 加 4 42 和4 18 但CC5 和CC20 處 理 均 無(wú) 顯 著 差 異 各 處 理 土 壤 真 細(xì) 比 變 化 趨 勢(shì) 與 真 菌 數(shù) 量 一 致 CC10 和CC15 處 理 較CC1 分 別 顯 著 增 加3 45 和 3 77 同 時(shí) 回 歸 分 析 證 明 土 壤 真 菌 數(shù) 量 和 真 細(xì) 比 均 表 現(xiàn) 出 隨 連 作 年 限 延 長(zhǎng) 先 增 加 后 降 低 的 拋 物 線 趨 勢(shì) P 0 05 不 同 小 寫(xiě) 字 母 表 示 差 異 顯 著 P 0 05 表1 4 同 Differentsmalllettersmeansignificantdifference at0 05level ThesameasTab 1 4 圖1 溫 室 黃 瓜 連 作 對(duì) 土 壤 真 菌 數(shù) 量 和 真 細(xì) 比 的 影 響 Fig 1 Effectsofcontinuouscroppingcucumber onsoilfungalabundanceandtheratiooffungitobacteria 2 2 設(shè) 施 黃 瓜 連 作 對(duì) 土 壤 真 菌 群 落 多 樣 性 和 多 樣 性 的 影 響 由 表1 可 知 CC5 CC20 處 理 土 壤 真 菌 群 落 OTU 數(shù) 量 和 群 落 的Shannon Simpson Ace 和Chao1 指 數(shù) 總 體 上 與CC1 均 無(wú) 顯 著 差 異 表 明 真 菌 群 落 的 多 樣 性 并 不 受 溫 室 黃 瓜 長(zhǎng) 期 連 作 影 響 但 從 群 落 OTU 組 成 上 來(lái) 看 圖2 CC1 CC20 各 處 理 真 菌 群 落 共 享 的OTU 數(shù) 量 為118 個(gè) 獨(dú) 有 的OTU 數(shù) 量 5 個(gè) 處 理 依 次 為8 3 1 2 2 個(gè) 分 別 占 總 觀 測(cè) 到OTU 數(shù) 量 的 5 52 2 12 0 73 1 48 和1 31 隨 著 溫 室 黃 瓜 連 作 年 限 延 長(zhǎng) 群 落 中 獨(dú) 有 的OTU 比 例 降 低 顯 示 溫 室 黃 瓜 連 作 改 變 了 真 菌 群 落 組 成 層 級(jí) 聚 類(lèi) 圖3 A 和PCoA 分 析 圖3 B 證 明 溫 室 黃 瓜 連 作 顯 著 改 變 了 真 菌 群 落 的 多 樣 性 且 各 連 作 年 限 處 理 間 真 菌 群 落 結(jié) 構(gòu) 差 異 達(dá) 到 顯 著 水 平 表1 溫 室 黃 瓜 連 作 對(duì) 土 壤 真 菌 群 落 多 樣 性 的 影 響 Tab 1 EffectsofcontinuouscroppingcucumberonOTU based diversityofsoilfungalcommunity 處 理 Treatment OTU 數(shù) 量 NumberofobservedOTUs 多 樣 性 指 數(shù) diversityindex Shannon Simpson Ace Chao1 CC1 145 0 7 0ab 2 87 0 09ab 0 110 0 013ab 162 2 7 3a 164 0 10 5a CC5 141 0 2 6ab 2 81 0 02b 0 117 0 009a 168 6 3 6a 174 4 7 2a CC10 137 0 11 1b 2 88 0 05ab 0 111 0 007ab 159 9 18 0a 167 4 24 4a CC15 135 7 7 1b 3 00 0 09a 0 090 0 009c 149 7 8 0a 149 0 8 5a CC20 153 7 9 2a 3 01 0 13a 0 093 0 009bc 169 0 10 3a 168 6 10 4a 198 華 北 農(nóng) 學(xué) 報(bào) 35 卷 圖2 不 同 溫 室 黃 瓜 連 作 年 限 下 土 壤 真 菌 群 落 共 有 和 獨(dú) 有 的OTU 數(shù) 目 Fig 2 NumbersofsharedanduniqueOTUsin soilfungalcommunitiesintheconditionof variousyearsofcontinuouscroppingcucumber 2 3 設(shè) 施 黃 瓜 連 作 對(duì) 土 壤 真 菌 群 落 成 員 的 影 響 真 菌 群 落 中 平 均 相 對(duì) 豐 度 超 過(guò)1 的 真 菌 門(mén) 分 別 為 子 囊 菌 門(mén) 未 分 類(lèi) 真 菌 Unclassified k Fungi 未 分 類(lèi) 真 菌 Norank k Fungi 擔(dān) 子 菌 門(mén) 纖 毛 門(mén) 和 未 分 類(lèi) 真 核 生 物 Unclassified d Eukaryota 這6 個(gè) 門(mén) 共 占 總 回 收 序 列 量 的98 48 表2 其 中 子 囊 菌 門(mén) 是 所 有 供 試 土 壤 中 最 具 優(yōu) 勢(shì) 的 真 菌 門(mén) 其 平 均 相 對(duì) 豐 度 占 到 總 回 收 序 列 的87 22 但 各 連 作 年 限 處 理 下 子 囊 菌 門(mén) 的 平 均 相 對(duì) 豐 度 并 無(wú) 顯 著 差 異 與 CC1 相 比 CC5 CC20 處 理 擔(dān) 子 菌 門(mén) 平 均 相 對(duì) 豐 度 無(wú) 顯 著 變 化 CC20 處 理 纖 毛 門(mén) 平 均 相 對(duì) 豐 度 較CC1 顯 著 增 加302 20 但CC5 CC15 無(wú) 顯 著 差 異 在 目 水 平 下 群 落 中 平 均 相 對(duì) 豐 度 超 過(guò)0 01 的 真 菌 目 共 有18 個(gè) 占 總 回 收 序 列 量 的98 20 表3 平 均 相 對(duì) 豐 度 超 過(guò)10 的 真 菌 目 共 有4 個(gè) 分 別 為 小 囊 菌 目 盤(pán) 菌 目 未 分 類(lèi) 子 囊 菌 Norank p Ascomycota 和 糞 殼 菌 目 占 總 回 收 序 列 量 的 70 05 小 囊 菌 目 平 均 相 對(duì) 豐 度 在CC5 CC20 下 較CC1 分 別 顯 著 增 加159 35 148 99 85 20 和60 20 且 整 體 上 隨 連 作 年 限 延 長(zhǎng) 先 增 加 后 降 低 溫 室 黃 瓜 連 作 顯 著 降 低 了 未 分 類(lèi) 子 囊 菌 平 均 相 對(duì) 豐 度 CC5 CC20 與CC1 相 比 降 幅 分 別 達(dá) 到 54 62 40 45 55 46 和40 37 糞 殼 菌 目 平 均 相 對(duì) 豐 度 表 現(xiàn) 出 隨 連 作 年 限 延 長(zhǎng) 先 降 低 后 增 加 的 趨 勢(shì) CC5 CC10 和CC15 處 理 與CC1 相 比 分 別 顯 著 降 低59 05 55 06 和30 27 而CC20 處 理 則 顯 著 增 加34 54 與 此 同 時(shí) 爪 甲 團(tuán) 囊 菌 目 肉 座 菌 目 和Conthreep 的 平 均 相 對(duì) 豐 度 也 均 隨 著 連 作 年 限 延 長(zhǎng) 呈 現(xiàn) 顯 著 變 化 圖3 土 壤 真 菌 群 落 在OTU 水 平 的 層 級(jí) 聚 類(lèi) A 和 主 成 分 分 析 B Fig 3 OTU basedhierarchicalclustering A andPCoAanalysis B ofsoilfungalcommunity 表2 溫 室 黃 瓜 連 作 對(duì) 門(mén) 水 平 下 土 壤 真 菌 群 落 成 員 平 均 相 對(duì) 豐 度 的 影 響 Tab 2 Effectsofcontinuouscroppingcucumberonaveragerelativeabundancesoffungalcommunitymembersatphylumlevel 門(mén) Phylum 平 均 相 對(duì) 豐 度Averagerelativeabundance CC1 CC5 CC10 CC15 CC20 平 均Mean 子 囊 菌 門(mén)Ascomycota 87 32 4 32a 89 36 0 48a 86 79 1 56a 86 69 1 38a 85 97 2 75a 87 22 未 分 類(lèi) 真 菌Unclassified k Fungi 4 15 2 52ab 1 26 0 55c 5 77 0 89a 3 14 0 70bc 1 80 0 23bc 3 22 未 分 類(lèi) 真 菌Norank k Fungi 3 43 1 62a 1 80 0 56b 3 73 0 2