一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用.pdf

19 中華人民共和國 國家知識產(chǎn)權(quán)局 12 發(fā)明專利申請 10 申請公布號 43 申請公布日 21 申請?zhí)?202010403070 7 22 申請日 2020 05 13 83 生物保藏信息 CGMCC No 6628 2012 09 26 71 申請人 南京農(nóng)業(yè)大 學(xué) 地址 210043 江 蘇省南京市棲霞區(qū)八卦洲 街道江蘇省棲霞現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園區(qū)南 京農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代園藝產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新中 心 72 發(fā)明人 楊天杰 韓崗 徐陽春 韋中 沈 其 榮 74 專利代理機構(gòu) 南京 天華專利代理有限責(zé)任 公司 32 218 代理人 徐冬濤 邢賢冬 51 Int Cl C12N 1 20 2006 01 A01N 63 20 2020 01 A01P 1 00 2006 01 C12R 1 01 2006 01 54 發(fā)明名稱 一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳 青枯病的應(yīng)用 57 摘要 本發(fā)明公開了一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合 防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用 采用灌根法將環(huán)絲 氨酸與有益菌施入土壤 其中 有益菌為菌株 NJQL A6 分類命 名為皮氏 羅爾斯通氏 菌 Ralstonia pickettii 2012年9月26日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心 保藏單位地址 北京市朝陽區(qū)大屯路 菌種保 藏號為CGMCC No 6628 本發(fā)明通過資源調(diào)控的 方式可以增強有益菌抑制土傳青枯病的能力 同 時施用有益菌和環(huán)絲氨酸 以環(huán)絲氨酸作為資源 物質(zhì) 不僅能夠促進(jìn)有益菌生長 還能顯著提高 有 益菌對青枯菌的抑制能力 從而減少番茄青枯 病的發(fā)病率 防控 番 茄土傳病害 權(quán)利要求書1頁 說明書4頁 附圖2頁 CN 111607535 A 2020 09 01 CN 111607535 A 1 一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用 其中 有益菌為菌株NJQL A6 分類命名為皮氏羅爾斯通氏菌 Ralstonia pickettii 2012年9月26日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏單位地址 北京市朝陽區(qū)大屯路 菌種保藏 號為CGMCC No 6628 2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用 其特征在于采用灌根法將環(huán)絲氨酸與有益菌施入土壤 3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用 其特征在于環(huán)絲氨酸的終濃度為0 1 1mmol kg土 4 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用 其特征在于有益菌的終濃度為 107 1 109CFU g土 5 一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的方法 其特征在于包括 番茄幼 苗移栽7 10天后 以灌根法將環(huán)絲氨酸與有益菌菌懸液加入土壤中 環(huán)絲氨酸的終濃度為 0 1 1mmol kg土 有益菌NJQL A6的終濃度為10 7 10 9CFU g土 6 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法 其特征在于有益菌菌懸液的濃度為1 107 1 109CFU mL 7 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法 其特征在于有益菌菌懸液由以下方法制得 菌株NJQL A6采用NA固體培養(yǎng)基活化 挑取NJQL A6單菌落于NA液體培養(yǎng)基 30 170rpm培養(yǎng)過夜 取 新鮮菌液4500rpm 常溫離心5min 收集菌體 用無菌生理鹽水洗滌菌體 除去培養(yǎng)基 用無 菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1 107 1 109CFU mL 得到NJQL A6菌懸液 權(quán) 利 要 求 書 1 1 頁 2 CN 111607535 A 一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域 0001 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域 涉及一種資源配合有益菌防控番茄青枯病的應(yīng)用 具體涉及一種環(huán)絲氨酸和有益菌NJQL A6配合防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用 背景技術(shù) 0002 番茄青枯病是由茄科勞爾氏菌 Ralstonia solanacearum 簡稱青枯菌 引起的一 種土傳病害 多發(fā)于我國東部和南部地區(qū) 可導(dǎo)致番茄發(fā)生不可逆的萎蔫 死亡 造成番茄 嚴(yán)重減產(chǎn) 制約農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展 施用農(nóng)藥或熏蒸等傳統(tǒng)方式可在短時間內(nèi)殺滅土傳青枯 菌 有效減緩病害的發(fā)生 但上述方法也會殺滅土壤中土著微生物 減少土壤物種多樣性或 豐度 0003 目前 施用有益菌是較為綠色 可持續(xù)的防控番茄青枯病措施 可抑制土傳青枯菌 的生長 在一定程度上減少病害的發(fā)生 在篩選有益菌以及驗證其抑菌效果的過程中 人們 往往使用營養(yǎng)較為豐富的培養(yǎng)基 有益菌可大量增殖或表現(xiàn)出很好的抑菌能力 而土壤中 資源種類和數(shù)量都相對有限 有益菌施入土壤后 無法獲得足夠以及合適的資源 從而生長 減緩 甚至無法在土壤環(huán)境中存活 其生防效率必然下降 0004 因此 需要找尋一種能夠促進(jìn)有益菌生長的資源 為有益菌在土壤提供一個適宜 生長的資源環(huán)境 并增強其抑制土傳青枯菌的能力 發(fā)明內(nèi)容 0005 本發(fā)明的目的在于針對土壤中養(yǎng)分有限 施用有益菌防控番茄土傳病害時 有益 菌往往難以在土壤中大量增殖并發(fā)揮應(yīng)有防效的問題 發(fā)明人發(fā)現(xiàn) 室內(nèi)微孔板系統(tǒng)中 環(huán) 絲氨酸可以促進(jìn)有益菌NJQL A6生長 還可顯著提高有益菌對青枯菌的抑制能力 溫室盆栽 實驗中 環(huán)絲氨酸與有益菌NJQL A6同時以灌根法施入土壤中 可降低番茄土傳青枯病的病 情指數(shù) 說明通過資源調(diào)控的方式可以增強有益菌抑制土傳青枯病的能力 同時施用有益 菌和環(huán)絲氨酸 以環(huán)絲氨酸作為資源物質(zhì) 不僅能夠促進(jìn)有益菌生長 還能顯著提高有益菌 對青枯菌的抑制能力 從而減少番茄青枯病的發(fā)病率 防控番茄土傳病害 0006 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的 0007 一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用 其中 有益菌為菌株 NJQL A6 分類命名為皮氏羅爾斯通氏菌 Ralstonia pickettii 2012年9月26日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏單位地址 北京市朝陽區(qū)大屯路 菌種 保藏號為CGMCC No 6628 0008 菌株NJQL A6具體見申請人于2012年12月19日申請的發(fā)明專利申請 發(fā)明名稱為 一種能防治番茄青枯病的微生物植物疫苗 申請?zhí)?201210466659 7 0009 作為本發(fā)明環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用的優(yōu)選技術(shù)方案 采用灌根法 同時將環(huán)絲氨酸與有益菌施入土壤 環(huán)絲氨酸的終濃度為0 1 1mmol kg土 有益菌的終濃度為1 107 1 109CFU g土 說 明 書 1 4 頁 3 CN 111607535 A 0010 本發(fā)明的另一個目的是提供一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的 方法 包括 3 5片真葉的番茄幼苗移栽7 10天后 以灌根法同時將環(huán)絲氨酸與有益菌菌 懸液加入土壤中 環(huán)絲氨酸的終濃度為0 1 1mmol kg土 有益菌NJQL A6的終濃度為10 7 109CFU g土 0011 所述的有益菌菌懸液的濃度為1 107 1 109CFU mL 0012 所述的有益菌菌懸液由以下方法制得 菌株NJQL A6采用NA固體培養(yǎng)基活化 挑取 NJQL A6單菌落于NA液體培養(yǎng)基 30 170rpm培養(yǎng)過夜 取新鮮菌液4500rpm 常溫離心 5min 收集菌體 用無菌生理鹽水洗滌菌體 除去培養(yǎng)基 用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1 107 1 109CFU mL 得到NJQL A6菌懸液 附圖說明 0013 圖1為環(huán)絲氨酸對有益菌NJQL A6生長的影響 其中 圖1A為環(huán)絲氨酸對有益菌 NJQL A6 48h生物量的影響 圖1B為環(huán)絲氨酸對有益菌NJQL A6最大生長速率的影響 0014 圖2為環(huán)絲氨酸對有益菌NJQL A6抑制土傳青枯菌生長的影響 0015 圖3為環(huán)絲氨酸對番茄土傳青枯病病情指數(shù)的影響 0016 生物材料保藏信息 0017 菌株NJQL A6 分類命名為皮氏羅爾斯通氏菌 Ralstonia pickettii 2012年9月 26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏單位地址 北京市朝陽 區(qū)大屯路 菌種保藏號為CGMCC No 6628 具體實施方式 0018 下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明 0019 實施例1 0020 環(huán)絲氨酸促進(jìn)有益菌生長的室內(nèi)效果 0021 NA液體培養(yǎng)基 葡萄糖10g 蛋白胨5g 牛肉浸膏3g 酵母膏0 5g 去離子水1000mL 調(diào)節(jié)pH 7 2 7 4 115 高壓滅菌30min 0022 NA固體培養(yǎng)基為NA液體培養(yǎng)基加2 3 w w 瓊脂 0023 菌株NJQL A6 分類名為皮氏羅爾斯通氏菌 保藏號CGMCC No 6628 0024 將甘油保存的NJQL A6在NA固體培養(yǎng)基上劃線 30 培養(yǎng)2d 挑取平板上的單菌落 轉(zhuǎn)接到NA液體培養(yǎng)基 30 170rpm培養(yǎng)過夜 取新鮮菌液4500rpm 常溫離心5min 收集菌 體 用無菌生理鹽水 0 85 NaCl 洗滌菌體3次 除去培養(yǎng)基 用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃 度為1 108CFU mL 獲得菌懸液 待用 0025 試驗設(shè)置2個處理 1 環(huán)絲氨酸組 加入環(huán)絲氨酸和有益菌NJQL A6 2 對照組 只添加有益菌NJQL A6 并以等體積水替代環(huán)絲氨酸 培養(yǎng)基為10 NA培養(yǎng)基 用無菌水將 NA液體培養(yǎng)基稀釋10倍 環(huán)絲氨酸終濃度為0 1mM 有益菌NJQL A6接種量為1 終濃度為 1 106CFU mL 在30 170rpm下震蕩培養(yǎng)48h 在酶標(biāo)儀上測定OD 600 考察有益菌NJQL A6 的生長情況 0026 環(huán)絲氨酸對有益菌生長的促進(jìn)作用見圖1和表1 結(jié)果表明 與對照組相比 環(huán)絲氨 酸可顯著促進(jìn)有益菌NJQL A6生物量和生長速率的增加 P 0 05 說 明 書 2 4 頁 4 CN 111607535 A 0027 表1 環(huán)絲氨酸對有益菌NJQL A6生物量和生長速率的影響 0028 0029 注 表中同列不同字母表示差異達(dá)到0 05的顯著水平 下同 0030 實施例2 0031 環(huán)絲氨酸增強有益菌抑制土傳青枯菌的室內(nèi)效果 0032 材料 分離自南京麒麟鎮(zhèn)的青枯菌QL Rs1115 1 其紅色熒光蛋白標(biāo)記菌株RS RFP 為本發(fā)明的模式入侵病原菌 該菌株是將紅色熒光蛋白基因mCherry通過質(zhì)粒pYC12轉(zhuǎn)入青 枯菌QL Rs1115 可以在30 g mL慶大霉素的NA培養(yǎng)基平板 2 上生長 命名為RS RFP 有益菌 NJQL A6篩選自南京麒麟鎮(zhèn) 可抑制青枯菌QL Rs1115的生長 0033 將甘油保存的有益菌NJQL A6在NA固體培養(yǎng)基上劃線 將平板置于30 培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)2d 直至出現(xiàn)單菌落 挑取平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到NA液體培養(yǎng)基 30 170rpm培養(yǎng)過 夜 取新鮮菌液4500rpm 常溫離心5min 收集菌體 用無菌生理鹽水 0 85 NaCl 洗滌菌體 3次 除去培養(yǎng)基 最后用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1 108CFU mL 獲得有益菌菌懸液 待用 0034 青枯菌RS RFP在含有30 g mL慶大霉素的NA固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇 將平板置于30 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d 直至出現(xiàn)單菌落 挑取平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到NA液體培養(yǎng)基 30 170rpm培養(yǎng)過夜 取新鮮菌液4500rpm 常溫離心5min 收集菌體 用無菌生理鹽水 0 85 NaCl 洗滌菌體3次 除去培養(yǎng)基 最后用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1 108CFU mL 獲得 青枯菌菌懸液 待用 0035 試驗設(shè)置2個處理 1 環(huán)絲氨酸組 加入環(huán)絲氨酸 有益菌和青枯菌 對照組 有 益菌和青枯菌 并以等體積水替代環(huán)絲氨酸 培養(yǎng)基為10 NA培養(yǎng)基 用無菌水將NA液體培 養(yǎng)基稀釋10倍 環(huán)絲氨酸終濃度為0 1mM 有益菌NJQL A6和青枯菌RS RFP接種量均為1 在30 170rpm下震蕩培養(yǎng)48h 在酶標(biāo)儀上測定OD 600和紅色熒光強度mCherry 發(fā)射光 587nm 吸收光 610nm 計算青枯菌相對生長量 log10 mCherry OD 600 0036 結(jié)果見圖2和表2 與對照組相比 環(huán)絲氨酸可顯著增強有益菌NJQL A6抑制青枯菌 的能力 P 0 05 0037 表2 環(huán)絲氨酸對有益菌NJQL A6抑制青枯菌的影響 0038 0039 實施例3 0040 環(huán)絲氨酸增強有益菌抑制土傳青枯菌的盆栽效果 0041 將有益菌NJQL A6接入NA液體培養(yǎng)基中 30 170rpm下震蕩培養(yǎng)48h 取新鮮菌液 說 明 書 3 4 頁 5 CN 111607535 A 4500rpm 常溫離心5min 收集菌體 用無菌的生理鹽水 0 85 NaCl 洗滌菌體3次 除去培 養(yǎng)基 最后用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1 108CFU mL左右 獲得有益菌菌懸液 待用 0042 將青枯菌QL Rs1115接入NA液體培養(yǎng)基中 30 170rpm下震蕩培養(yǎng)48h 取新鮮菌 液4500rpm常溫離心5min 收集菌體 用無菌的生理鹽水 0 85 NaCl 洗滌菌體3次 除去培 養(yǎng)基 最后用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1 108CFU mL左右 獲得青枯菌菌懸液 待用 0043 番茄品種 紅矮生番茄 0044 番茄種子經(jīng)表面消毒后 置于墊有無菌去離子水浸濕濾紙的無菌平板上 30 催 芽2d 取發(fā)芽均一的種子種植入裝有滅菌基質(zhì)50孔育苗盤中 待番茄長出3片真葉后 取長 勢一致的幼苗移栽至6孔育苗盤中 0045 試驗設(shè)置2個處理 1 環(huán)絲氨酸組 幼苗移栽7天后 采用灌根法同時將環(huán)絲氨酸 與有益菌NJQL A6菌懸液均勻澆入番茄根部附近 環(huán)絲氨酸終濃度為0 1mmol kg土 有益菌 NJQL A6終濃度為10 7CFU g土 7天后 同樣以灌根法接入青枯菌菌懸液 其終濃度為10 6CFU g土 2 對照組 幼苗移栽7天后 以灌根法接入有益菌NJQL A6菌懸液 并以等體積水替代 環(huán)絲氨酸 有益菌NJQL A6終濃度為10 7CFU g土 7天后 同樣以灌根法接入青枯菌菌懸液 其終濃度為10 6CFU g土 接入青枯菌后一旦番茄出現(xiàn)發(fā)病癥狀 開始記錄發(fā)病情況 0046 植株病情等級分為5級 3 0 沒有染病癥狀 1 1 25 的植株部位出現(xiàn)染病癥 狀 2 26 50 的植株部位出現(xiàn)染病癥狀 3 51 75 的植株部位出現(xiàn)染病癥狀 4 76 100 的植株部位出現(xiàn)染病癥狀或者是植株已經(jīng)死亡 用病情指數(shù)表征發(fā)病情況 計 算公式為 植株病情指數(shù) 各級病株數(shù) 相應(yīng)級數(shù) 調(diào)查總株數(shù) 最高級別值 0047 結(jié)果如圖3和表3 結(jié)果表明 添加環(huán)絲氨酸后 可顯著降低番茄土傳青枯病的病情 指數(shù) P 0 05 減少青枯病發(fā)病程度 0048 表3 環(huán)絲氨酸對有益菌NJQL A6抑制番茄土傳青枯病的影響 0049 0050 參考文獻(xiàn) 0051 1 Wei Z Yang X M Yin S X Shen Q R Ran W Xu Y C Efficacy of Bacillus fortified organic fertiliser in controlling bacterial wilt of tomato in the field Appl Soil Ecol 2011 48 152 159 0052 2 Tan S Y Gu Y Yang C L Dong Y Mei X L Shen Q R et al Bacillusamyloliquefaciens T 5may prevent Ralstonia solanacearum infection through competitive exclusion Biol Fertil Soils 2015 52 341 351 0053 3 Kempe J and L Sequeira Biogical control of bacterial wilt of potatoes attempts to induce resistance by treating tubers with bacteria Plant disease 1983 67 499 503 說 明 書 4 4 頁 6 CN 111607535 A 圖1 圖2 說 明 書 附 圖 1 2 頁 7 CN 111607535 A 圖3 說 明 書 附 圖 2 2 頁 8 CN 111607535 A