黑龍江省黃瓜棒孢葉斑病分布及病菌生物學特性.pdf

北 方 園 藝 研究論文 第一作者簡介 張笛 女 碩士研究生 研究方向為 植物病原生物學 責任作者 張艷菊 女 博士 教授 現(xiàn)主要從事植 物病原生物學及有害生物綜合治理等研究工作 基金項目 國家自然科學基金資助項目 黑龍 江省自然科學基金重點資助項目 收稿日期 黑龍江省黃瓜棒孢葉斑病分布及 病菌生物學特性 張 笛 劉 齊 月 劉 東 陶 磊 王 春 龍 張 艷 菊 東北農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院 黑龍江 哈爾濱 摘 要 對黑龍江省保護地發(fā)生的黃瓜棒孢葉斑病的發(fā)生情況進行調(diào)查 對疑似該病的 致病菌進行形態(tài)學及分子生物學鑒定 同時以鑒定出的黃瓜棒孢葉斑病菌菌株 為 試驗材料 采用菌落生長法和玻片法對病原菌的生物學特性進行測定 結(jié)果表明 黃瓜棒孢 葉斑病菌的病原菌為多主棒孢霉 該病在黑龍 江省哈爾濱 齊齊哈爾 牡丹江等多地均有發(fā)生 病原菌菌絲生長的最適溫度為 最 適碳源為甘露醇 最適氮源為甘氨酸 最適 為 光照條件有利于菌絲的生長 菌絲致死 溫度為 分生孢子致死溫度為 分生孢子在 時萌發(fā)率最高 關(guān)鍵詞 黃瓜 棒孢葉斑病 多主棒孢霉 分布 生物學特性 中圖分類號 文獻標識碼 文章編號 由 半 知 菌 絲 孢 目 棒 孢 屬 多 主 棒 孢 霉 侵 染引起的棒孢葉斑病是近年流行的一種新病害 對黃瓜生產(chǎn)造成的損失日益嚴重 多主棒孢霉于 年在歐洲首次報道 年在中國報道該 病菌可 侵 染 黃 瓜 但 因 侵 染 數(shù) 量 少 未 引 起 重 視 年黃瓜棒孢葉斑病在遼寧省瓦房店 市大面積發(fā)生 成為當?shù)乇Ｗo地黃瓜的主要病 害 近 年 來 該 病 在 我 國 山 東 河 南 河 北 上海 甘肅 廣東 寧夏 等地均有 發(fā)生 給黃瓜生產(chǎn)造成嚴重損失 嚴重時甚至高達 該病菌寄主廣泛 不僅可以侵染 黃瓜 還能夠侵染甜瓜 木瓜 橡膠 番茄 大豆等 余種植物 該病菌主要以菌絲體或分生 孢子隨種子 病殘體在土壤中或其它寄主植物上 越冬 田間分生孢子通過氣流和雨水傳播 進行多 次重復(fù)侵染 發(fā)病嚴重時可造成葉片干枯 提早 拉秧 年張艷菊等 在黑龍江省哈爾濱市發(fā) 現(xiàn)棒孢葉斑病疑似病株 并對黑龍江省哈爾濱 齊 齊哈爾 牡丹江和佳木斯等地黃瓜棒孢葉斑病發(fā) 生情況進行調(diào)查 結(jié)果只在哈爾濱發(fā)現(xiàn)有棒孢葉 斑病危害 而在齊齊哈爾 牡丹江和佳木斯均未發(fā) 現(xiàn)棒孢葉斑病 由于病菌可隨種子及氣流進行傳 播 經(jīng)過幾年時間 該病是否已經(jīng)傳播到了黑龍江 省其他地區(qū)以及危害情況如何不得而知 因此課 題組于 年對黑龍江省黃瓜保護地棒孢葉斑 病發(fā)生 分布及危害情況進行調(diào)查 并對黃瓜多主 棒孢霉生物學特性進行了研究 以期為科學指導 黃瓜棒孢葉斑病的防治提供參考依據(jù) 材料與方法 試驗材料 供試菌株為 年采自黑龍江省黃瓜種植 區(qū)分離得到的致病性最強的黃瓜棒孢葉斑病菌 株 命名為 試驗方法 黃瓜棒孢葉斑病發(fā)生情況調(diào)查 于 年 月 對黑龍江省哈爾濱 齊齊哈 爾 牡丹江 佳木斯和綏化 個黃瓜主栽區(qū) 個 村的 個黃瓜種植大棚黃瓜棒孢葉斑病的發(fā)生 情況進行調(diào)查 每個大棚調(diào)查 株 統(tǒng)計該病 在這些地區(qū)的發(fā)病率及病情指數(shù) 對于疑似病株 帶回實驗室進行病菌分離 鑒定及致病性測定 發(fā)病率 該地區(qū)發(fā)病大棚數(shù) 該地區(qū)調(diào) 查大棚數(shù) 病情指數(shù) 各級病株數(shù) 各級值 調(diào)查總 株數(shù) 最高級值 病原菌的分離與純化 疑似病葉用常規(guī)組織分離法進行病原菌的分 離 取病健交界處大小為 的葉片 組織 依次經(jīng) 酒精浸泡 升汞消毒 無菌水沖洗 次后用無菌濾紙吸干 置于 培養(yǎng)基平板上 恒溫培養(yǎng) 致病性測定 將純化后的菌種轉(zhuǎn)移到 培養(yǎng)基上擴繁 培養(yǎng) 用無菌的涂棒將菌絲刮下并加入無菌水 配制成濃度為 個 的孢子懸液 選 用感病黃瓜品種 由東北農(nóng)業(yè)大學黃瓜育 種研究室提供 用噴霧法 對其葉片進行接種 接種后套袋保濕 后觀察發(fā)病情況 根 據(jù)柯赫氏法則測定其致病性 病原菌形態(tài)鑒定 將病原菌在 平板上培養(yǎng) 觀察其形 態(tài) 用滅菌鉤挑取少許霉層 于 顯微鏡下觀察并拍照 并測量分生孢子的大小 病原菌的分子鑒定 菌塊在 上培養(yǎng)一周 刮下菌絲 采用改 良的 法 提取各菌株的 用真菌通 用引物 和特異性引物 進行 擴增 將擴增產(chǎn)物送往上 海生工公司進行測序 測序結(jié)果進行同源性比較 生物學特性測定 溫度對菌絲生長的影響 取 培 養(yǎng) 的 菌落 用滅 菌 的 打 孔 器 取 直 徑 的菌塊移 至 平板上 然后分別置于 和 恒溫培養(yǎng) 十字交叉法測量培 養(yǎng) 的菌落直徑 每個處理重復(fù) 次 碳源對菌絲生長的影響 以 培養(yǎng) 基為基礎(chǔ) 將其中的蔗糖分別按比例替換成葡萄 糖 果糖 淀粉 乳糖 甘露醇 共 種不同碳源的 培養(yǎng)基 每個處理 次重復(fù) 取培養(yǎng) 的菌落 用滅菌的打孔器取直徑 的菌塊移至培養(yǎng)基 平板上 恒溫無光照培養(yǎng) 測量方法同上 氮源對菌絲生長的影響 以 培養(yǎng) 基為基礎(chǔ) 將其中的硝酸鈉分別按比例替換成蛋 白胨 酵母浸粉 磷酸氫二銨 甘氨酸 種不同氮 源的培養(yǎng)基 每個處理 次重復(fù) 取培養(yǎng) 的 菌落 用滅菌的打孔器取直徑 的菌塊移至 培養(yǎng)基平板上 恒溫無光照培養(yǎng) 測量方法 同上 對菌絲生長的影響 用 的 和 的 將 培養(yǎng)基分 別調(diào)成 為 共 個處理 取培養(yǎng) 的菌落 用滅 菌的打孔器取直徑 的菌塊移至不同 的 培養(yǎng)基平板上 恒溫無光照培養(yǎng) 測量方法 同上 光照對菌絲生長的影響 取直徑 的 菌塊放入 培養(yǎng)基 分別置于 連續(xù)光照 培養(yǎng) 完全黑暗培養(yǎng) 明暗交替 種光 照 條件培養(yǎng)下 測量方法同上 菌絲致死溫度和時間測定 取直徑 菌塊裝入無菌 管中 放入恒溫水浴鍋中分別 在 處理 后迅速 冷卻 將菌絲挑取出并置于 培養(yǎng)基上 后觀察菌絲生長情況 每個處理重復(fù) 次 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響 將病原菌在 平板上培養(yǎng) 后 用無菌水將培養(yǎng)基表面 的菌絲刮下 于 倍顯微鏡下配制成濃度為 每個視野 個孢子的懸浮液 用移液槍取 滴入凹玻片中 放置于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿 內(nèi) 分別于 恒溫培 養(yǎng) 后鏡檢孢子萌發(fā)情況 每處理重復(fù) 次 北 方 園 藝 月 上 分生孢子致死溫度和時間測定 將病原菌 在 平板上培養(yǎng) 后 用無菌水將培養(yǎng)基表 面的菌絲刮下 于 倍顯微鏡下配制成濃度 為每個視野 個孢子的懸浮液 取 菌懸液裝入無菌 管中 在 的恒溫水浴鍋中分別處理 后迅速冷 卻 用移液槍取 不同處理的菌懸液布于 平板上 于 培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng) 后 觀察培養(yǎng)基上是否生成菌落 每處理重復(fù) 次 數(shù)據(jù)分析 采用 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理及 分析 結(jié)果與分析 黑龍江省黃瓜棒孢葉斑病發(fā)生情況 由表 可知 在調(diào)查的 個村中 只有齊齊 哈爾的大民村 小花力村和大花力村沒有發(fā)現(xiàn)黃 瓜棒孢葉斑病 其他村均發(fā)生黃瓜棒孢葉斑病危 害 牡丹江和佳木斯地區(qū)發(fā)病率較高 而齊齊哈爾 和哈爾濱地區(qū)發(fā)病率較低 發(fā)病較為嚴重的地區(qū) 為齊齊哈爾市的小五福馬村 佳木斯的臨江村和 亨利村 病情指數(shù)分別為 和 表 黑龍江省各地區(qū)黃瓜棒孢葉斑病發(fā)病率及病情指數(shù) 地區(qū) 大棚數(shù) 棟 發(fā)病棚數(shù) 棟 每棚調(diào)查植株數(shù) 株 病棚病情指數(shù) 哈爾濱市 光明村 大民村 齊齊哈爾市 小花力村 大花力村 小五福馬村 新勝村 鐵嶺河 牡丹江市 夾信子屯 新興村 大莫村 富華村 佳木斯市 臨江村 亨利村 范家村 小康村 綏化市 廂紅五村 展望村 病原菌分離及形態(tài)鑒定 對采集的疑似病斑分離 獲得棒孢葉斑病菌 菌株 株 菌落在 培養(yǎng)基上形態(tài)基本一致 為近圓 形 氣 生 菌 絲 呈 灰 白 色 絨 毛 狀 且 茂 密 圖 培養(yǎng)基內(nèi)菌絲呈黑褐色 邊緣顏色較淺 圖 分生孢子梗細長 直立或彎曲 有 個層出梗 分生孢子多隔膜 大小范圍在 呈圓柱狀 直立或彎曲的 倒棍棒狀 分生孢子單生或串生 顏色呈褐色 具 有 個隔膜 多集中在 個 圖 將制備好的孢子懸浮液接種在黃瓜感病品種 第一片真葉上 后產(chǎn)生直徑約為 的病斑 圖 與田間癥狀相似 將病斑進行組 織分離培養(yǎng)后 獲得多主棒孢病菌 故確定該菌為 致病菌 分子鑒定 使用真菌 通用引物和黃瓜多主 棒孢霉特異性引物 以 個菌株的基 因組 為模板進行 擴增 均獲得長度約 為 圖 和 圖 的特異性片 段 選擇致病性最強的菌株 對其擴增 產(chǎn)物進行回收 測序 得到的 片段大小分別 為 和 圖 將序列放在 上 進行 分析 與多主棒孢病菌相似性達到 第 期 北 方 園 藝 該 菌 株 登 錄 號 分 別 為 和 進而在分子水平上確定該病菌為 多 主 棒 孢 霉 注 氣生菌絲 基內(nèi)菌絲 圖 菌株在 上的菌落形態(tài) 注 分生孢子單生倒棍棒狀 分生孢子圓柱狀 分生孢子串生倒棍棒狀 分生孢子梗 圖 菌株的分生孢子及分生孢子梗 注 對照組 處理組 圖 病原菌致病性測定 北 方 園 藝 月 上 注 通用引物 特異性引物 圖 菌株 擴增結(jié)果 圖 序列比對結(jié)果 病原菌的生物學特性 溫度對菌絲生長的影響 不同溫度下在 培養(yǎng)基上菌落生長的平 均直徑大小見圖 在 下培養(yǎng)菌絲生 長較快 其中 最為突出 但 個溫度下差異 不顯著 在 時生長速度相對緩慢 時菌絲生長速度最慢 表明溫度過高或過低 均不利于菌絲生長 碳源對菌絲生長的影響 菌絲在供試 種碳源培養(yǎng)基上均能生長 由 圖 可知 其中在以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基生長 速度最快 其次為蔗糖和乳糖 但與甘露醇的差異 不顯著 以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長速度 最慢 與其余 種培養(yǎng)基上菌絲生長表現(xiàn)為顯著 性差異 氮源對菌絲生長的影響 菌絲在供試 種氮源培養(yǎng)基上均能生長 由 圖 可知 其中在以甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基上生長 注 字母代表 水平下組間顯著異性 下同 圖 不同溫度對菌絲生長的影響 速度最快 與其余 種培養(yǎng)基上菌絲生長相比表現(xiàn) 為顯著性差異 在以磷酸氫二銨為氮源 的培養(yǎng)基上生長速度最慢 但在以酵母浸粉為氮 源的培養(yǎng)基上形成的菌落較厚 其余均較薄 第 期 北 方 園 藝 圖 不同碳源對菌絲生長的影響 圖 不同氮源對菌絲生長的影響 對菌絲生長的影響 菌絲在 均可生長 由圖 可知 時菌絲的生長速率差異性不顯著 但在 為 的時候菌絲生長速率最快 說明 在接 近中性的時候最利于菌絲的生長 圖 不同 對菌絲生長的影響 光照對菌絲生長的影響 由圖 可知 菌絲在全光照條件下生長速度 最快 且與全黑暗條件下菌絲的生長速度差異顯 著 說明光照有利于菌絲的生長 圖 不同光照對菌絲生長的影響 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響 由圖 可知 分子孢子 均能萌發(fā) 和 孢子萌發(fā)率相對較高 其中 時 孢子萌發(fā)率最高 近 由此可見溫度過高過 低都不利于孢子的萌發(fā) 圖 不同溫度對分生孢子萌發(fā)的影響 菌絲及分生孢子致死溫度的測定 菌絲在 處理 后 有 個重復(fù)無菌 落生成 在 處理 后 個重復(fù)均未有 菌落產(chǎn)生 分生孢子在 處理 后未有孢 子萌發(fā) 表明菌絲的致死溫度為 分生孢子的致死溫度為 表 北 方 園 藝 月 上 表 菌絲致死溫度及時間 處理溫度 菌絲生長情況 注 表示生長 表示不生長 個 或 表示 次重復(fù) 下同 表 分生孢子致死溫度及時間 處理溫度 菌絲生長情況 討論與結(jié)論 試驗研究結(jié)果表明 黃瓜棒孢葉斑病在黑龍 江省多個黃瓜保護地區(qū)均有發(fā)病 牡丹江和佳木 斯地區(qū)發(fā)病率較高 齊齊哈爾市的小五福馬村 佳 木斯的臨江和享利村發(fā)病較為嚴重 年黃 瓜棒孢葉斑病僅在黑龍江省哈爾濱市發(fā)生 而 到 年在齊齊哈爾市 牡丹江市 佳木斯市和 綏化市均有發(fā)生 該病菌可通過種表附著或種內(nèi) 潛伏休眠菌絲在黃瓜上進行種子傳播 在種表 附著狀態(tài)下可存活 個月以上 翌年產(chǎn)生分生孢 子成為田間初侵染菌源 初侵染后的病斑產(chǎn) 生的分生孢子可繼續(xù)憑借氣流向其它黃瓜植株傳 播 從而完成再侵染 這也是造成黃瓜棒孢葉斑病 在黑龍江普遍發(fā)生的主要原因 病原菌菌絲生長的最適溫度為 與 木薯 豇豆 甜瓜 廣藿香 和香蕉 的 多主棒孢霉的最適溫度基本一致 但茄子和香蕉 的多主棒孢霉最適生長溫度的范圍更大 菌絲及 分生孢子的致 死 溫 度 分 別 為 和 與木薯 和茄子 多主棒孢霉的 結(jié)論一致 分生孢子在 時孢子萌發(fā)率最高 較甜瓜 和節(jié)瓜 上的相關(guān)研究相差不多 但 與二者不同溫度的產(chǎn)孢率存在差異 該病原菌菌 絲對酸堿度不敏感 在 時均可生長 最 適 為 但香蕉 上的多主棒孢霉對酸堿 度敏感 僅在 接近中性時可生長 最適碳源 為甘露醇 最適氮源為甘氨酸 光照條件有利于 菌絲的生長 但影響不顯著 但光照對甜瓜 上 的多主棒孢霉的生長影響顯著 不同作物上多主 棒孢霉生物學特性研究的差異 可能因寄主與地 理來源不同而產(chǎn)生 菌絲及分生孢子的致死溫度分別為 和 因此可在播種前對種子進 行熱處理來減少病害的初侵染源 此外 在 月 黃瓜拉秧后 及時進行病殘體的清理 并用塑料薄 膜覆蓋 使溫度超過 通過高溫殺死病菌 防 止菌絲及分生孢子越夏 減少下一茬種植的初侵 染源 黑龍江省黃瓜種植面積大 黃瓜棒孢葉斑 病是近年來黃瓜種植區(qū)的主要病害之一 未發(fā)生 該病害的地區(qū)更應(yīng)加強防范 拉秧后徹底及時清 除病殘體 目前在黑龍江省黃瓜棒孢葉斑病已由 次要病害變?yōu)橹饕『?危害日益嚴重 由于多主 棒孢霉的寄主范圍廣 而且主要通過氣流傳播 因 此今后應(yīng)在加強黃瓜棒孢葉斑病的防治的基礎(chǔ) 上 密切注意在其它寄主上的發(fā)生及危害 參考文獻 戚佩坤 白金愷 朱桂香 吉林省栽培植物真菌病害志 北京 科學出版社 李龍生 李寶聚 劉永春 等 黃瓜褐斑病的診斷與防治 中國蔬菜 許遠 張子君 鄒慶道 等 黃瓜褐斑病的藥劑防治研究 遼寧農(nóng)業(yè)科學 李長松 張眉 李林 等 山東省黃瓜棒孢葉斑病 褐斑病 病原菌鑒定和防治 中國蔬菜 王潤初 河南省溫棚蔬菜病害發(fā)生動態(tài)與綜合防治 植 物醫(yī)生 劉智慧 倪守煜 劉會清 張家口市保護地黃瓜靶斑病的發(fā) 生與防治 植物保護 曾蓉 陸金萍 戴富明 上海地區(qū)黃瓜靶斑病病原鑒定及 的分析 上海交通大學學報 農(nóng)業(yè)科學版 柳曉玲 魏周玉 王安士 等 幾種藥劑防治日光溫室黃瓜靶 第 期 北 方 園 藝 斑病田間效果 甘肅農(nóng)林科技 藍國兵 譚耀華 何自福 等 黃瓜褐斑病 在廣東首次報道 植物保護 查仙芳 朱猛蒙 王國珍 等 寧夏首次發(fā)現(xiàn)黃瓜靶斑病 寧夏農(nóng)林科技 楊雙娟 顧興芳 張圣平 等 黃瓜棒孢葉斑病 的研究概況 中國蔬菜 張艷菊 劉東 馬柏壯 等 黑龍江省黃瓜棒孢葉斑病發(fā)生情 況調(diào)查及 病 原 鑒 定 東北農(nóng)業(yè)大學學報 潘羨心 彭建華 劉先寶 等 不同來源橡膠樹多主棒孢病菌 致病性及基礎(chǔ)生物學特性的比較 熱帶作物學報 王爽 黃貴修 李博勛 等 甜瓜棒孢葉斑病病原菌鑒定及其 生物學特性研究 熱帶作物學報 番華彩 郭志祥 白亭亭 等 香蕉棒孢霉葉斑病病原菌生物 學特性測定 南方農(nóng)業(yè)學報 陳旭玉 甘炳春 隋春 等 廣藿香棒孢霉葉斑病病原菌生物 學特性及藥劑篩選 農(nóng)藥 王爽 黃貴修 李博勛 等 海南茄子棒孢霉葉斑病病原菌鑒 定及生物學特性研究 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 陸寧海 吳利民 田雪亮 等 黃瓜褐斑病菌侵染條件及致病 性研究 安徽農(nóng)業(yè)科學 劉麗 黃瓜霜霉菌致病型 交配型的測定及 遺傳多樣 性分析 哈爾濱 東北農(nóng)業(yè)大學 裴月令 時濤 蔡吉苗 等 木薯棒孢霉葉斑病病原鑒定及其 生物學特性測定 熱帶作物學報 劉志恒 李健冰 安心 等 遼寧省豇豆輪紋病病原菌鑒定及 其生物學特性 中國蔬菜 韓小爽 高葦 傅俊范 等 李寶聚博士診病手記 三十五 黃瓜棒孢葉斑病的診斷與防治 中國蔬菜 曾永三 孫偉 梁關(guān)生 等 節(jié)瓜枯萎病病原鑒定及生物學特 性研究 仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學院學報 北 方 園 藝 月 上