花椰菜BraERF023a的克隆及在響應(yīng)鹽和干旱脅迫中的功能.pdf

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021 54 1 152 163 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2021 01 011 收稿日期 2020 04 12 接受日期 2020 06 29 基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金 31872115 天津市科技計(jì)劃種業(yè)科技重大專(zhuān)項(xiàng) 18ZXZYNC00160 國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng) 2018ZX08020003 001 003 聯(lián)系方式 通信作者李慧 E mail lihui 通信作者賀麗霞 E mail helx 開(kāi)放科學(xué) 資源服務(wù) 標(biāo)識(shí)碼 OSID 花椰菜 BraERF023a 的克隆及在響應(yīng)鹽和干旱脅迫 中的功能 李慧 1 韓占品 1 賀麗霞 2 楊亞苓 1 尤書(shū)燕 2 鄧琳 2 王春國(guó) 2 1 天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院 天津 300384 2 南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津 300071 摘要 目的 在前期從花椰菜中篩選 鑒定出多個(gè)逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)ERF Ethylene responsive factors 轉(zhuǎn)錄因子的基 礎(chǔ)上 對(duì)其中一個(gè)未知功能的轉(zhuǎn)錄因子 BraERF023a進(jìn)行克隆 并闡釋其在鹽及干旱脅迫條件下的表達(dá)特征及功能 方法 對(duì)花椰菜中的 BraERF023a進(jìn)行克隆 采用MEGA 6等生物學(xué)軟件對(duì)其序列特征進(jìn)行分析 采用qRT PCR方法分析 BraERF023a 在鹽及干旱脅迫條件下的表達(dá)特征 進(jìn)而構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥 對(duì) BraERF023a 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系在鹽及干 旱脅迫下的表型 生存率進(jìn)行觀察 分析 結(jié)果 序列分析證實(shí) 花椰菜 BraERF023a 編碼區(qū)長(zhǎng)度為 597 bp 編碼含 198 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì) 其內(nèi)含有一個(gè) AP2 保守結(jié)構(gòu)域 BraERF023a 在十字花科蕓薹屬植物中具有很高保守性 轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式 分析顯示 鹽及干旱脅迫條件均可顯著誘導(dǎo)花椰菜 BraERF023a 的表達(dá) 進(jìn)一步的功能分析顯示 在鹽及干旱脅迫處理?xiàng)l件 下 過(guò)表達(dá) BraERF023a的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系比野生型對(duì)照生長(zhǎng)勢(shì)更好 植株生存率更高 鹽及干旱耐受能力明顯增強(qiáng) 結(jié) 論 BraERF023a在花椰菜響應(yīng)鹽及干旱脅迫中發(fā)揮重要的正向調(diào)控作用 過(guò)表達(dá) BraERF023a可顯著提高轉(zhuǎn)化株對(duì)鹽及干旱 的脅迫耐受 關(guān)鍵詞 花椰菜 ERF轉(zhuǎn)錄因子 BraERF023a 鹽脅迫 干旱脅迫 Cloning and Functional Analysis of BraERF023a Under Salt and Drought Stresses in Cauliflower Brassica oleracea L var botrytis LI Hui 1 HAN ZhanPin 1 HE LiXia 2 YANG YaLing 1 YOU ShuYan 2 DENG Lin 2 WANG ChunGuo 2 1 College of Horticulture and Landscape Tianjin Agricultural University Tianjin 300384 2 College of Life Sciences Nankai University Tianjin 300071 Abstract Objective In our previous study Ethylene responsive factors ERF s involved in abiotic stress responses in cauliflower were identified In the present study one of these ERF transcription factors with unknown function named BraERF023a was cloned The expression profiles and function of BraERF023a under salt and drought stresses were further explored Method BraERF023a was cloned by RT PCR in cauliflower The sequence characteristics of BraERF023a were analyzed by biosoftwares such as MEGA 6 The expression profiles of BraERF023a under salt and drought stresses were explored by qRT PCR BraERF023a overexpression vector was then constructed and genetically transformed into Arabidopsis The phenotypes and survival rate of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis under salt and drought stresses were observed and analyzed Result Sequence analysis confirmed that BraERF023a coding region was 597 bp in length and encoded a protein containing 198 amino acids with an AP2 conserved domain BraERF023a was highly conserved in Brassica The expression level of BraERF023a significantly increased 1 期 李慧等 花椰菜 BraERF023a 的克隆及在響應(yīng)鹽和干旱脅迫 中的功能 153 under both salt and drought stresses in cauliflower Functional analysis indicated that comparative with the wild type controls overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis lines exhibited better growth vigor and higher plant survival rate under salt or drought stress Conclusion BraERF023a played important roles in positive response to salt and drought stresses in cauliflower Overexpression of BraERF023a in Arabidopsis could significantly improve the tolerance of transgenic lines to salt and drought stresses Key words cauliflower ERF transcription factor BraERF023a salt stress drought stress 0 引言 研究意義 ERF 轉(zhuǎn)錄因子隸屬于 AP2 ERF 轉(zhuǎn)錄 因子超家族 在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用 花椰菜是重要的蔬菜作物 土壤鹽漬及干旱是造成花 椰菜種植減產(chǎn)的主要環(huán)境災(zāi)害 但對(duì)花椰菜響應(yīng)鹽及 干旱脅迫的分子基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)十分有限 這已成為采用分 子育種等手段創(chuàng)制花椰菜抗逆新種質(zhì)及培育新品種的 重要瓶頸 因此 克隆 ERF 等逆境應(yīng)答相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 或基因并闡釋其功能 對(duì)開(kāi)展抗逆花椰菜分子育種及 基因靶向育種具有重要意義 前人研究進(jìn)展 植物 在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中需要不斷應(yīng)對(duì)持續(xù)變化的不利環(huán) 境 如動(dòng)物啃食 病原體侵染等生物脅迫和干旱 高 溫 土壤鹽漬等非生物脅迫 這其中干旱 鹽害及溫 度脅迫是影響植物地理分布 造成農(nóng)作物減產(chǎn)甚至絕 收的主要環(huán)境災(zāi)害 1 因此 闡釋植物響應(yīng)逆境脅迫 的分子基礎(chǔ)及調(diào)控機(jī)制 進(jìn)而在作物中開(kāi)展抗逆分子 育種一直是植物學(xué)研究的前沿及熱點(diǎn)領(lǐng)域 已有研究 表明 WRKY MYB bZIP NAC 和 AP2 ERF 等轉(zhuǎn) 錄因子家族成員在植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)各類(lèi)逆境脅迫 中發(fā)揮重要作用 2 3 其中 AP2 ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族 為植物所特有 該家族成員具有參與 DNA 結(jié)合的 AP2 保守結(jié)構(gòu)域 該結(jié)構(gòu)域約由 60 個(gè)氨基酸殘基按 照 3 個(gè) 折疊和 1 個(gè) 螺旋的方式構(gòu)成一個(gè)典型三 維結(jié)構(gòu) 4 6 根據(jù) AP2 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和識(shí)別序列的不 同 AP2 ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族可以分為 AP2 ERF DREB RAV 和 Soloist 5 個(gè)亞家族 7 8 其中 ERF 亞 家族只含有 1 個(gè) AP2 結(jié)構(gòu)域 被證實(shí)主要通過(guò)識(shí)別并 特異性結(jié)合各類(lèi)脅迫響應(yīng)相關(guān)基因順式作用元件 而在植物抵抗各種逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控 作用 6 9 水稻中 ERF 亞家族成員 SNORKEL1 SK1 和 SNORKEL2 SK2 可以促進(jìn)水稻節(jié)間伸長(zhǎng) 從而 使植株可以在深水環(huán)境中存活 10 在擬南芥中過(guò)表達(dá) 菊花 CmERF053 的研究表明 CmERF053 可能參與細(xì) 胞分裂相關(guān)的側(cè)枝形成調(diào)控途徑 同時(shí)在植物抵御干 旱脅迫中發(fā)揮作用 11 大豆中 GmERF6 能夠被干旱誘 導(dǎo)表達(dá) 將 GmERF6 在擬南芥中過(guò)表達(dá)可顯著提高轉(zhuǎn) 化株的抗旱性 12 在擬南芥中過(guò)表達(dá)甜薯 IbRAP2 12 和蕪菁 BrERF4 同樣也可提高轉(zhuǎn)化株對(duì)鹽和干旱脅迫 的耐受性 13 14 PARK 等 15 研究發(fā)現(xiàn)擬南芥 AtERF71 HRE2 功能缺失可使突變株表現(xiàn)為鹽敏感 而將 AtERF71 HRE2 轉(zhuǎn)入突變體中 植株表現(xiàn)出耐鹽 性 可成功抵抗?jié)B透脅迫 且提高轉(zhuǎn)化株對(duì)低氧脅迫 的耐受能力 此外 研究證實(shí) 辣椒的 CaERFLP1 16 和 CaPF1 17 番茄的 TERF1 18 和 JERF1 19 以及小麥 中 TaERF1 20 的過(guò)表達(dá)均可顯著提高轉(zhuǎn)化株對(duì)鹽及 低溫等逆境的適應(yīng)能力 綜上所述 ERF 轉(zhuǎn)錄因子 已被證實(shí)在植物響應(yīng)逆境脅迫 特別是非生物逆境 脅迫中發(fā)揮重要作用 本研究切入點(diǎn) 雖然在不 同植物中已有多個(gè) ERF 轉(zhuǎn)錄因子被克隆并證實(shí)其在 逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用 但對(duì) ERF 轉(zhuǎn)錄因子在花 椰菜逆境應(yīng)答中的功能及調(diào)控機(jī)制仍知之甚少 筆 者實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)花椰菜中的 AP2 ERF 家族成員采用 高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法進(jìn)行了分析 從中篩選 鑒 定到 146 個(gè) ERF 轉(zhuǎn)錄因子 并證實(shí)包括 BraERF025a 等在內(nèi)的多個(gè) ERF 亞家族成員在鹽及干旱脅迫前后 呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)特征 21 進(jìn)一步的分子進(jìn)化樹(shù)分析 結(jié)果表明 BraERF023a 是與 BraERF025a 同屬于一個(gè) 進(jìn)化分支的 ERF 亞家族成員 二者具有較近的親緣關(guān) 系 21 但 BraERF023a 是否也響應(yīng)鹽及干旱脅迫 且 其是否在花椰菜抵抗鹽及干旱脅迫中發(fā)揮作用仍未 知 擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題 對(duì)花椰菜中的 BraERF023a 進(jìn)行克隆 揭示其序列特征 以及在鹽及干旱脅迫條 件下的表達(dá)特征 并通過(guò)過(guò)表達(dá)分析闡釋 BraERF023a 在鹽及干旱脅迫應(yīng)答中的功能 1 材料與方法 試驗(yàn)于 2017 2019 年在南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 植物細(xì)胞及分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行 1 1 試驗(yàn)材料 供試花椰菜 津品 70 種子由天津市科潤(rùn)蔬菜 研究所孫德嶺研究員惠贈(zèng) 擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型 154 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 54卷 克隆載體 pEASY T1 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公 司 植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301 大腸桿菌 DH5 農(nóng)桿菌菌株 LBA4404 由筆者實(shí)驗(yàn)室保存 1 2 DNA 提取 野生型和過(guò)表達(dá) BraERF023a 轉(zhuǎn)基因擬南芥 花 椰菜幼苗新鮮組織 于研缽中加入液氮快速研磨成粉 末狀 采用經(jīng)典 CTAB 法提取 DNA ddH 2 O 于 4 過(guò) 夜溶解 DNA 沉淀 在溶解液中 RNase A 于 37 金屬 浴中反應(yīng) 2 h 除去 RNA NanoDrop ND 1000 檢測(cè) DNA 濃度和質(zhì)量 高質(zhì)量的 DNA 于 20 保存?zhèn)溆?1 3 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄 參照植物總 RNA 提取試劑盒的操作說(shuō)明提取花 椰菜及擬南芥葉片總 RNA NanoDrop ND 1000 檢測(cè) 提取 RNA 的濃度 2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 完 整性 采用 M MLV 反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA 第一鏈 具 體操作參照 Promega 公司的 M MLV 反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)進(jìn) 行 1 4 花椰菜不同逆境脅迫處理 待花椰菜幼苗長(zhǎng)至四片真葉時(shí) 將幼苗從營(yíng)養(yǎng) 土中取出 自來(lái)水緩緩沖洗根部 注意不要傷害到 根系 隨后將幼苗分為兩組 每組至少 16 個(gè)單株 將其中一組幼苗根部直接浸入含有 200 mmol L 1 NaCl 的水溶液進(jìn)行鹽脅迫處理 另外一組幼苗根部 浸入含 20 PEG6000 的水溶液中進(jìn)行模擬干旱處 理 分別在 0 4 8 12 和 24 h 時(shí)摘取葉片并進(jìn)行 總 RNA 提取 提取的 RNA 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一 鏈 80 保存?zhèn)溆?1 5 不同脅迫處理?xiàng)l件下 BraERF023a 表達(dá)特征的定 量表達(dá)分析 采用 qRT PCR 方法對(duì)花椰菜不同脅迫處理下 BraERF023a的表達(dá)特征進(jìn)行分析 反應(yīng)體系為 20 L 其中含有 10 L 2 SYBR Green反應(yīng) mix 羅氏公司 1 L BraERF023a 定量引物 表 1 以花椰菜 BraActin 為內(nèi)參 采用 2 CT 法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析 1 6 BraERF023a 植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 以花椰菜 cDNA 為模板擴(kuò)增具有 Nco I和 BstE II 酶切位點(diǎn)的 BraERF023a 編碼區(qū) cDNA 將 BraERF023a 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與 pEASY T1 克隆載體連接 參照說(shuō) 明書(shū) 采用熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 利用 Nco I BraERF023a F BstE II BraERF023a R 引物 組合對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定 表 1 并進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性 克隆進(jìn)行測(cè)序分析 對(duì)含有 BraERF023a 正確序列的 陽(yáng)性克隆及 pCAMBIA3301 表達(dá)載體分別進(jìn)行 Nco I 表1 BraERF023a 克隆 載體構(gòu)建和定量 RT PCR 分析引物 序列 Table 1 Primers used for BraERF023a cloning vector construction and qRT PCR assay 引物名稱(chēng) Primer name 引物序列 Primer sequence 5 3 BraERF023a F ATGCTGAGTACAGTGAGTGAAACC BraERF023a R TCACAGACACGCCATGAACTG Nco I BraERF023a F CCATGGATGCTGAGTACAGTGAGTG BstE II BraERF023a R GGTCACCTCACAGACACGCCAT qBraERF023a F CCACCACTTACCAACGAAC qBraERF023a R AAGATCCGAGCCAAATCCG 35S F AACAGAACTCGCCGTAAAG BraActin F GCTCCTCTTAACCCAAAGGC BraActin R CACACCATCACCAGAATCCAGC AtActin F GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG AtActin R AACGACCTTAATCTTCATGCTGC 下劃線(xiàn)指限制性酶切位點(diǎn) The underlines indicated the restriction endonuclease cleavage sites 和 BstE II 雙酶切 回收酶切片段 利用 T4 DNA 連接 酶將 BraERF023a 連接至 pCAMBIA3301 載體的 CaMV 35S 啟動(dòng)子下游 篩選獲得 35S BraERF023a 重組表達(dá)載體 采用熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 LBA4404 利 用 BraERF023a 特異引物和組合引物 35S F BraERF023a R 對(duì)農(nóng)桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行分子鑒定 表 1 將含有 35S BraERF023a 重組質(zhì)粒的農(nóng)桿 菌采用浸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥 1 7 農(nóng)桿菌介導(dǎo) BraERF023a 過(guò)表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化擬 南芥 于 250 mL 液體 YEB 培養(yǎng)基中 擴(kuò)大培養(yǎng)含有 35S BraERF023a 重組質(zhì)粒的陽(yáng)性農(nóng)桿菌 使其 OD 600 值約為 1 2 1 6 5 500 r min 離心 10 min 收集菌體 用 500 mL 5 的蔗糖溶液 含終濃度為 0 05 的 silwet L 77 重懸菌體 配成轉(zhuǎn)化液 于盛花期將擬南芥花 序浸入轉(zhuǎn)化液中浸染 30 s 用保鮮膜包好植株 平置 于托盤(pán)中避光培養(yǎng) 24 h 7 d 后再次轉(zhuǎn)化 兩次轉(zhuǎn)化完 成后將擬南芥置于培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)至種子成熟 收 集種子 記為 T 0 代 1 8 BraERF023a 過(guò)表達(dá)擬南芥的抗性篩選及鑒定 將春化后的 BraERF023a 轉(zhuǎn)基因 T 0 代擬南芥種子 種于營(yíng)養(yǎng)土中 待其長(zhǎng)出兩片真葉后 噴灑稀釋 10 000 倍的 Basta 溶液 對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行抗性篩選 對(duì)篩選 獲得的 T 0 T 1 T 2 和 T 3 代抗性轉(zhuǎn)化株進(jìn)一步提取其 1 期 李慧等 花椰菜 BraERF023a 的克隆及在響應(yīng)鹽和干旱脅迫 中的功能 155 DNA 利用特異引物 BraERF023a F BraERF023a R 和組合引物 35S F BraERF023a R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 表 1 檢測(cè) BraERF023a 是否已整合到擬南 芥基因組中 進(jìn)一步提取 T 3 代純合抗性轉(zhuǎn)化株 RNA 以 qBraERF023a F qBraERF023a R 為引物 采用 qRT PCR方法檢測(cè) BraERF023a在擬南芥轉(zhuǎn)化株 中的表達(dá)特征 收獲純合的 T 3 代轉(zhuǎn)化株種子用于后續(xù) 分析 1 9 BraERF023a 過(guò)表達(dá)擬南芥的表型及抗性分析 將 T 3 代過(guò)表達(dá) BraERF023a 擬南芥轉(zhuǎn)化株系和 野生型對(duì)照種子同時(shí)播種 在相同的環(huán)境條件下進(jìn)行 培養(yǎng) 并對(duì)其株高 莖粗 抽薹時(shí)間 分枝數(shù)目 果 莢長(zhǎng)短等表型進(jìn)行觀察 此外 待過(guò)表達(dá) BraERF023a 擬南芥轉(zhuǎn)化株系和野生型對(duì)照長(zhǎng)至 3 周時(shí) 在一次性 澆足水后 7 d 改為澆灌 200 mmol L 1 NaCl 溶液進(jìn)行 為期 3 周的鹽脅迫處理 3 周后觀察二者在鹽脅迫下 的表型變化 對(duì)長(zhǎng)至 3 周的過(guò)表達(dá) BraERF023a 擬南 芥轉(zhuǎn)化株系和野生型對(duì)照在一次性澆足水后 停止?jié)?水并進(jìn)行為期 20 d 的干旱脅迫處理 之后復(fù)水 觀察 復(fù)水 10 d 后二者的干旱脅迫表型并統(tǒng)計(jì)其存活率 2 結(jié)果 2 1 BraERF023a 的克隆及序列分析 分別以花椰菜 DNA cDNA 為模板 利用特異性引 物組合 BraERF023a F BraERF023a R 擴(kuò)增 BraERF023a 的全長(zhǎng)編碼區(qū) 表 1 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果表 明 無(wú)論是以 DNA 還是 cDNA 為模板均能擴(kuò)增出一 條約 600 bp 的特異條帶 其長(zhǎng)度與前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲 得的 BraERF023a 序列長(zhǎng)度一致 證實(shí)花椰菜 BraERF023a 序列中無(wú)內(nèi)含子 進(jìn)一步對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行 TA 克隆及測(cè)序 測(cè)序結(jié)果顯示 BraERF023a 編碼 區(qū)全長(zhǎng) 597 bp 預(yù)期編碼一個(gè)含有 198 個(gè)氨基酸的蛋 白質(zhì) 圖 1 序列分析發(fā)現(xiàn) BraERF023a 包含一個(gè) AP2 保守結(jié)構(gòu)域 該結(jié)構(gòu)域包含 3 個(gè) 折疊和 1 個(gè) 螺旋 且保守結(jié)構(gòu)域中第 14 和 19 位氨基酸分別為丙 氨酸和天冬氨酸 均符合 ERF 轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)特 征 圖 1 進(jìn)一步利用 ProtFun 2 2 Server http www cbs dtu dk services ProtFun 對(duì) BraERF023a 的蛋白功 能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析 結(jié)果顯示 BraERF023a 可能主要在 植物生長(zhǎng)發(fā)育及轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩個(gè)過(guò)程中發(fā)揮作用 此外 序列比對(duì)及聚類(lèi)分析結(jié)果顯示 BraERF023a 與 B napus B oleracea B rapa 等十字花科蕓薹屬其他植 物中的 ERF023 序列具有較高相似性 大于 90 而與水稻 玉米 高粱等禾本科植物中的 ERF023 相 似性較低 表明 ERF023 在十字花科蕓薹屬作物中具 有較高保守性 其可能具有相似的功能 2 2 BraERF023a 在鹽脅迫和模擬干旱處理?xiàng)l件下的 表達(dá)特征 200 mmol L 1 NaCl 鹽處理?xiàng)l件下 BraERF023a 的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高 表明鹽脅迫 處理可以顯著誘導(dǎo) BraERF023a 的表達(dá) 圖 2 a 與 其相似 在 20 的 PEG6000 模擬干旱脅迫處理?xiàng)l件 下 花椰菜中的 BraERF023a 在脅迫處理后不同時(shí)間 段的表達(dá)量均顯著高于處理前 圖 2 b 表明 BraERF023a 不但正向響應(yīng)鹽脅迫 也受干旱脅迫的 誘導(dǎo)表達(dá) 2 3 BraERF023a 表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定 分別采用基因特異引物 BraERF023a F BraERF023a R 和組合引物 35S F BraERF023a R 進(jìn)行菌液 PCR 鑒定重組載體是否已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中 隨 機(jī)挑取 6 個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行檢測(cè) PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié) 果顯示在 6 個(gè)陽(yáng)性克隆中均可檢測(cè)到長(zhǎng)度約為 600 bp 和 1 100 bp 的特異性條帶 圖 3 a 條帶大小均 符合預(yù)期 表明 35S BraERF023a 過(guò)表達(dá)載體已成 功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中 2 4 BraERF023a 過(guò)表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)化株系篩選及分子 鑒定 野生型擬南芥于盛花期經(jīng)農(nóng)桿菌浸花法侵染后培 養(yǎng)至種子成熟 記為 T 0 代 T 0 代種子萌發(fā)后進(jìn)行 Basta 抗性篩選 篩選結(jié)果顯示 絕大部分幼苗葉片逐漸黃 化 26 個(gè)植株生長(zhǎng)發(fā)育狀況正常 初步鑒定為抗性轉(zhuǎn) 化株系 隨機(jī)選取其中 10 個(gè)抗性轉(zhuǎn)化株系分別進(jìn)行 DNA 水平及轉(zhuǎn)錄水平的分子鑒定 以 DNA 為模板 采用 BraERF023a 特異引物及 BraERF023a 與載體序 列組合引物分別進(jìn)行 PCR 檢測(cè) 在其中 5 個(gè)株系中可 以分別擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的約 600 bp 和 1 100 bp 的特異性條帶 表明 BraERF023a 已成功整合到這些 株系的基因組中 圖 3 b 進(jìn)一步采用 qRT PCR 方 法對(duì) BraERF023a 在這 5 個(gè)陽(yáng)性株系中的表達(dá)特征進(jìn) 行分析 結(jié)果顯示 BraERF023a 在這 5 個(gè)株系中的 表達(dá)水平顯著高于野生型對(duì)照 圖 3 c 證實(shí) BraERF023a 不但成功整合到轉(zhuǎn)化株基因組內(nèi) 并且 實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化株的高表達(dá) 將這 5 個(gè) T 0 代植株進(jìn)行多代 自交純合 T 3 代株系用于后續(xù)分析 2 5 BraERF023a 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析 為揭示 BraERF023a 在擬南芥中過(guò)表達(dá)是否影 156 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 54卷 橫線(xiàn)顯示 AP2 保守結(jié)構(gòu)域 方框顯示 ERF 轉(zhuǎn)錄因子 AP2 結(jié)構(gòu)域內(nèi)保守的第 14 位和 19 位氨基酸 Sequences marked by the black lines indicated the AP2 domain and the boxes indicated the conserved fourteenth and nineteenth amino acids in the AP2 domain of ERFs respectively 圖 1 花椰菜 BraERF023a 序列分析 Fig 1 Sequence analysis of BraERF023a in cauliflower 相對(duì)表達(dá)水平 Relati ve express ion level 相對(duì)表達(dá)水平 Relati ve express ion level 表示差異極顯著 P 0 01 下同 indicated the difference is significant at the 0 01 level The same as below 圖 2 花椰菜鹽 a 和干旱 b 脅迫條件下 BraERF023a 表達(dá)特征的 qRT PCR 分析結(jié)果 Fig 2 Expression profiles of BraERF023a under salt a and drought b stresses detected by qRT PCR 1 期 李慧等 花椰菜 BraERF023a 的克隆及在響應(yīng)鹽和干旱脅迫 中的功能 157 M1 2 3 4 5 678910 a b c M1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M123 45 6 M1 2 3 4 5 6 0 2 4 6 8 10 12 CK L3 L4 L6 L8 L9 BraERF023a過(guò)表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)化株系 Overexpression BraERF023a Arabidopsis lines 相對(duì)表達(dá)水平 Relati ve exp r es sio n l e v e l a 分別采用 BraERF023a 特異擴(kuò)增引物及 BraERF023a 與載體序列組合引物對(duì)農(nóng)桿菌陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液 PCR 的檢測(cè)結(jié)果 M DNA marker 1 6 6 個(gè)陽(yáng)性克隆特異引物 PCR 檢測(cè)結(jié)果 1 6 6 個(gè)陽(yáng)性克隆組合引物 PCR 檢測(cè)結(jié)果 b 分別采用 BraERF023a 特異擴(kuò)增引物及 BraERF023a 與載 體序列組合引物對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)化株的單株 PCR 檢測(cè)結(jié)果 M DNA marker 1 10 10 個(gè)單株特異引物 PCR 檢測(cè)結(jié)果 1 10 10 個(gè)單株組合引物 PCR 檢測(cè)結(jié)果 c 不同 BraERF023a 過(guò)表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)化株系中 BraERF023a 表達(dá)水平的 qRT PCR 檢測(cè)結(jié)果 CK 對(duì)照組 L3 L4 L6 L8 L9 BraERF023a 過(guò)表達(dá)擬南芥株系 a Identification of Agrobacterium tumefaciens with BraERF023a by PCR used the specific primers and combined primers respectively M DNA marker 1 6 indicated PCR identification used the specific primers 1 6 indicated PCR identification used the combined primers b Identification of individual Arabidopsis plant with BraERF023a by PCR used the specific primers and combined primers respectively M DNA marker 1 10 indicated PCR identification of individual plants used the specific primers 1 10 indicated PCR identification of individual plant used the combined primers c Expression levels of BraERF023a in differential overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis lines detected by qRT PCR CK Wild type control L3 L4 L6 L8 L9 indicated the five independent transgenic lines 圖 3 農(nóng)桿菌及擬南芥轉(zhuǎn)化株中 BraERF023a 的分子鑒定 Fig 3 Identification of BraERF023a in Agrobacterium tumefaciens and transgenic lines in Arabidopsis 響轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)發(fā)育 對(duì)過(guò)表達(dá) BraERF023a 轉(zhuǎn)基因 擬南芥在正常生長(zhǎng)條件下不同生長(zhǎng)階段的表型特征進(jìn) 行觀察 分析 結(jié)果顯示 幼苗生長(zhǎng)初期 3 周以前 過(guò)表達(dá) BraERF023a 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系與對(duì)照相比無(wú) 明顯差異 但在幼苗生長(zhǎng) 3 周后 過(guò)表達(dá) BraERF023a 轉(zhuǎn)化株系的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于對(duì)照 圖 4 待植株進(jìn)入成 熟期 對(duì)其株高 分枝數(shù)目等表型特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果顯示 過(guò)表達(dá) BraERF023a 轉(zhuǎn)化株系相對(duì)于對(duì)照植 株表現(xiàn)為植株更高 分枝數(shù)目更多 花莖更粗 整體生 物量增加 但二者花序大小及果莢長(zhǎng)度無(wú)明顯差異 在 抽薹時(shí)間方面 過(guò)表達(dá) BraERF023a 轉(zhuǎn)化株系比對(duì)照滯 后約一周 表 2 上述結(jié)果表明 在擬南芥中過(guò)表達(dá) BraERF023a 對(duì)轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)發(fā)育有一定影響 其可以 促進(jìn)轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)發(fā)育 延長(zhǎng)其抽薹期 但對(duì)轉(zhuǎn)化株育 性 結(jié)種量無(wú)顯著影響 2 6 BraERF023a 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫分析 BraERF023a 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型對(duì) 照經(jīng)鹽脅迫后生長(zhǎng)均受到一定抑制 但對(duì)照組擬南 芥葉片萎蔫黃化嚴(yán)重甚至全部枯萎 植株存活率低 而過(guò)表達(dá) BraERF023a轉(zhuǎn)化株系葉片雖也發(fā)生黃化 但程度顯著低于對(duì)照 圖 5 且盡管受到鹽脅迫 BraERF023a 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化株植株最終的存活率 86 顯著高于對(duì)照組 41 表明在擬南芥中 過(guò)表達(dá) BraERF023a 可以提高轉(zhuǎn)化株抵御鹽脅迫的 能力 2 7 BraERF023a 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱脅迫分析 干旱脅迫處理 20 d 后 BraERF023a 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化 株系和野生型植株均萎蔫嚴(yán)重 但野生型植株基本已 158 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 54卷 a b 和 c 分別顯示生長(zhǎng) 3 周 4 周及 8 周的 BraERF023a 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化 株系及對(duì)照的表型 CK 對(duì)照組 L4 L8 L9 過(guò)表達(dá) BraERF023a 轉(zhuǎn) 化株系 a b and c indicated the phenotypes of 3 week old 4 week old and 8 week old overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis and the control CK L4 L8 L9 indicated three independent overexpression BraERF023a transgenic lines 圖 4 BraERF023a 過(guò)表達(dá)擬南芥不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表型 Fig 4 Phenotypes of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis at different developmental stages 全部萎蔫黃化至死亡 而 BraERF023a 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化株 系萎蔫黃化程度相對(duì)野生型較輕 部分轉(zhuǎn)化株系葉片 仍保持綠色 圖 6 對(duì)所有干旱處理植株進(jìn)行復(fù)水 復(fù)水 10 d 后 其中 2 個(gè)過(guò)表達(dá) BraERF023a 轉(zhuǎn)化株 系中 L8 L9 的大部分植株恢復(fù)生長(zhǎng) 而對(duì)照組 絕大部分已枯萎 圖 6 且過(guò)表達(dá) BraERF023a 轉(zhuǎn)化株系的存活率顯著高于對(duì)照組 圖 7 表明 在擬南芥中過(guò)表達(dá) BraERF023a 可以顯著提高轉(zhuǎn)化 株的耐旱性 3 討論 3 1 BraERF023a 在植物中的分子進(jìn)化特征分析 AP2 ERF 轉(zhuǎn)錄因子最初在植物中被發(fā)現(xiàn) 1994 年 JOFUKU 等 4 從模式植物擬南芥中分離到第一個(gè) AP2 轉(zhuǎn)錄因子 APETALA2 該轉(zhuǎn)錄因子與花發(fā)育和 種子萌發(fā)有關(guān) 隨后 AP2 ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族成員陸 續(xù)從不同植物中被鑒定 克隆 并證實(shí)其為植物所 特有 基因結(jié)構(gòu)分析表明 AP2 ERF 家族成員均含有 保守的 AP2 結(jié)構(gòu)域 5 根據(jù) AP2 結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及序 列特征 AP2 ERF 家族中的 ERF 亞族和 DREB 亞族 均含有單個(gè)的 AP2 結(jié)構(gòu)域 6 但是 AP2 結(jié)構(gòu)域第 14 位和第 19 位氨基酸殘基在兩者中不同 ERF 亞族成 員 AP2 結(jié)構(gòu)域的第 14 位和 19 位分別為丙氨酸和天 冬氨酸 而 DREB 亞族成員該結(jié)構(gòu)域第 14 位和 19 位分別為纈氨酸和谷氨酸 7 通過(guò)對(duì) BraERF023a 的 序列分析發(fā)現(xiàn) 其具有 1 個(gè) AP2 結(jié)構(gòu)域 并且保守 結(jié)構(gòu)域第 14 位和 19 位分別為丙氨酸和天冬氨酸 a 過(guò)表達(dá) BraERF023a 擬南芥轉(zhuǎn)化株系 L4 L8 L9 及對(duì)照組 CK 200 mmol L 1 NaCl 鹽脅迫處理前表型 b 過(guò)表達(dá) BraERF023a 擬南芥轉(zhuǎn)化 株系 L4 L8 L9 及對(duì)照組 CK 200 mmol L 1 NaCl 鹽脅迫處理 3 周后表型 a The phenotypes of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis L4 L8 L9 and control before salt stress 200 mmol L 1 NaCl b The phenotypes of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis L4 L8 L9 and control under salt stress 200 mmol L 1 NaCl for three weeks 圖 5 過(guò)表達(dá) BraERF023a 轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫表型分析 Fig 5 Phenotypes of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis under salt stress 1 期 李慧等 花椰菜 BraERF023a 的克隆及在響應(yīng)鹽和干旱脅迫 中的功能 159 表 2 過(guò)表達(dá) BraERF023a 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析 Table 2 Phenotypic analysis of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis 表型 Phenotype 對(duì)照 CK L4 L8 L9 株高 Stem length cm 43 125 2 780c 56 750 3 862a 51 125 1 0307ab 49 625 3 0923b 抽薹時(shí)間 Bolting time d 26 00 2 4495b 32 00 2 4495a 29 1 9148a 31 00 1 2583a 莖粗 Stem diameter mm 1 2375 0 0727b 1 7800 0 2191a 1 6300 0 1551a 1 7125 0 1059a 主莖 Stem number 5 75 0 9574c 6 75 1 0708ab 6 25 0 5000b 7 775 0 5774a 一級(jí)分枝 Primary branch number 13 75 2 630b 15 00 2 449ab 16 00 3 742a 13 75 5 132b 二級(jí)分枝 Secondary branch number 5 00