蝴蝶蘭"大辣椒"APETALA1基因的克隆及表達.pdf

北 方 園 藝 園林花卉 第一作者簡介 何荊洲 女 碩士 副研究員 現(xiàn)主 要從事生物技術與植物育種等研究工作 責任作者 卜朝陽 女 碩士 研究員 現(xiàn)主要從事 花卉育種等研究工作 基金項目 廣 西 科 技 重 大 專 項 資 助 項 目 桂 科 廣西科技基地和人才專項資助項目 桂 科 廣 西 自 然 基 金 資 助 項 目 廣西農業(yè)科學院團隊資助項目 收稿日期 蝴蝶蘭 大辣椒 基因的 克隆及表達 何 荊 洲 范 繼 征 曾 艷 華 李 秀 玲 盧 家 仕 卜 朝 陽 廣西農業(yè)科學院 花卉研究所 廣西 南寧 摘 要 以蝴蝶蘭 大辣椒 為試材 采用 技術克隆蝴蝶蘭 基 因的 全長 分析基本生物學信息 并初步探索其在花芽分化過程中的作用 結果表 明 基因的 全長為 開放閱讀框 編碼 個氨基酸 含有 盒與 盒等保守功能結構域 同源性比對結果顯示 蝴蝶蘭 大 辣椒 與朵麗蝶蘭 金蝶蘭 文心蘭 石斛蘭和馬兜鈴等植物的 蛋白有較高的相似性 同源性均在 以上 系統(tǒng)進化樹分析顯示 蝴蝶蘭 大辣椒 基因與朵麗蝶蘭聚類關 系最近 實時熒光定量 檢測發(fā)現(xiàn) 基因在葉片 根和花葶中均有表達 但表達量有 差異 同一器官不同發(fā)育時期比較顯示 葉片的 基因表達量沒有明顯的時空差異 根 基因的表達量隨著花芽分化的進程呈遞減趨勢 其中始花期的表達量最低 盛花期最 高 而花葶中 基因表達量隨著花芽分化呈增加趨勢 在盛花期表達量達到峰值 同一 時期不同器官比較 花葶中 的表達量顯著高于同一時期的葉片和根 由 此 推測 基因在調控蝴蝶蘭花芽分化過程中發(fā)揮重要作用 關鍵詞 蝴蝶蘭 基因 基因表達 中圖分類號 文獻標識碼 文章編號 蝴蝶蘭屬蘭科 蝴蝶蘭屬 常綠草本植物 其花色艷麗 花形奇特 花期可達 個月 素有 洋蘭皇后 的美稱 是世界花卉中最具有價值的盆栽花卉之一 在 中國 蝴蝶蘭的銷售季節(jié)主要集中在 春節(jié) 前后 月 但蝴蝶蘭的自然花期一般在 月 為迎合市場需求普遍采用控溫技術來促使花期提 前 經(jīng)濟成本較高 另外 蝴蝶蘭的童期較長 一 般為 年 大大增加了優(yōu)良品種培育的難度 因 此 深入開展蝴蝶蘭成花的分子機理研究 探討如 何通過分子手段使蝴蝶蘭開花季節(jié)提前成為研究 人員的研究熱點 開花是植物從營養(yǎng)生長過渡到生殖生長的典 型特征 這個特征的形成有許多基因的參與 其中 基因編碼一個 轉錄因子 在控制 花分生組織特性和花器官形成的過程中起著非常 重要的作用 是調控花發(fā)育的熱點基因之一 基因通過時空表達來調控花分生組織形成 及花器官發(fā)育 同時 基因的表達也能夠促進 植物提前開花 在擬南芥植物中分別轉入柳樹 的 個 同源基因 其開 花時間出現(xiàn)提前 并且出現(xiàn)雌蕊 雄蕊和花瓣增多 的現(xiàn)象 等 將 基因轉入矮牽牛 使其提前開花 且花能夠持續(xù)不斷地開放 基因同樣也能控制芍藥中花瓣 萼片 心皮和雄蕊 的形成 目前在蝴蝶蘭中關于 基因的研 究報道甚少 該研 究 以 蝴 蝶 蘭 大 辣 椒 為試材 通過 和 技 術克隆得到 基因的 全長 分析了該 基因的結構 利用生物信息學分析預測蝴蝶蘭 大 辣椒 蛋白的理化性質與結構 并對其在蝴 蝶蘭 大辣椒 不同發(fā)育時期及不同組織中的表達 進行了分析 以期為進一步研究調控蝴蝶蘭花芽 分化 促進其開花以及探討該基因在開花過程中 的表達調控和開花作用機理提供參考依據(jù) 材料與方法 試驗材料 蝴蝶蘭 大辣椒 由廣西農業(yè)科學院花卉研究 所觀賞植物研發(fā)中心提供 試驗方法 以蝴蝶蘭 大辣椒 組培繼代苗的葉片組織提 取總 然后采用 技術克隆出 基 因的 全長 采用 技術檢測蝴蝶 蘭 大辣椒 的葉片 根和花葶中 基因不同發(fā) 育時期的表達規(guī)律 項目測定 總 提取及 合成 取蝴蝶蘭 大辣椒 盛花期的葉子 濕布擦拭 干凈 取 葉片組織用液氮碾磨成粉狀 根據(jù) 北京天根 試劑盒說明書 的操作方法提取蝴蝶蘭的總 采用分光光 度計檢測總 濃度 用 瓊脂糖凝膠電泳檢 測其 完 整 性 使 用 去 除 總 中的 根據(jù) 試劑盒的操作說明 使用引物 將總 逆 轉錄合成 使用 對 合成的 進行去 處理 冰箱保 存?zhèn)溆?采用 擴增基因的全長 根據(jù) 中公布的朵麗蝶蘭 序 列號 基因保守序列 設計簡并引 物 表 以合成的 為模板 和 為引物 擴增出蝴蝶蘭 基因中間片段 擴增體系 個循環(huán) 擴增產(chǎn)物經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳檢測 切膠回收 連接和轉化 由生物工程 上海 有限責任公司進 行測序 根據(jù)獲得的中間片段序列 再設計 和 巢式 引物 和 表 采用 試 劑 盒 公 司 擴 增 序 列 及 試 劑盒 公司 擴增 序列 將獲得的兩 端序列和中間片段用 軟件進行拼接 進行蝴蝶蘭 基因全長 的預測 表 擴增引物序列 引物名稱 引物序列 序列分析與系統(tǒng)進化樹的構建 利用 網(wǎng)站上的 程序進行序列 相似 性 分 析 使 用 在 線 網(wǎng) 站 進行開放閱讀框的預測 蛋白一 級結構 理論等電點和分子量 及蛋白保守區(qū)的預 測 初步分析目的基因的功能 利用 軟件進行系統(tǒng)進化樹的構建 不同組織及不同發(fā)育時期 基因的表 達規(guī)律 分別取營養(yǎng)生長期 低溫誘導期 抽梗初期 花葶長 抽梗期 花葶長 始 花期 盛花期的葉 根和花葶組織 在液氮中速凍 北 方 園 藝 月 上 后提取總 以蘭花的 基因作為內參 參 照 使用說 明 采 用 方 法 引物 檢測 基因在葉 根和花葶組織的不同生長時期的表達情況 采用 計算方法進行分析 以相對表達量最低 的組織為基點作圖 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)用平均值 標準誤表示 利用 軟件和單因素方差分析 對數(shù)據(jù)進行差異性分析 將統(tǒng)計結果做成柱狀圖 結果與分析 蝴蝶蘭 大辣椒 基因 全長及氨 基酸序列分析 根據(jù) 已發(fā)布的 同源基因 課題組 先克隆出部分中間片段 大小為 圖 然 注 中間片段 片段 片段 圖 蝴蝶蘭 大辣椒 基因的 擴增 注 下劃線表示起始密碼子 表示終止密碼子 圖 蝴蝶蘭 大辣椒 基因的核酸序列及推導的氨基酸序列 第 期 北 方 園 藝 后再采用 技術分別擴增出 和 的 其長度分別為 和 經(jīng) 軟件將中間片段 和 片段拼接 獲得了 基因的 全 長為 該基因的 為 共編碼 個氨基酸 圖 相對分子量 等 電點 脂溶指數(shù) 總平均親水性 對蝴蝶蘭 基因的氨基酸及蛋白結構域 進行分析 結果發(fā)現(xiàn)該蛋白序列屬于植物特有的 型 基因 包含典型的 盒與 盒 其中 盒包含了 個氨基酸 組成的高度保守結構域 圖 盒包 含 個氨基酸 主要調節(jié)蛋白質與 蛋白質之間的相互作用 是轉錄因子的結構特征 序列 并 在 端 發(fā) 現(xiàn) 存 在 單 子 葉 植 物 典 型 的 基序 說明蝴蝶蘭 基因 圖 蝴蝶蘭 大辣椒 基因蛋白質保守結構域 為 中的 亞家族 即 類基因 蝴蝶蘭 基因的同源性比對分析 由圖 可知 蝴蝶蘭 蛋白質的序列與其 它植物的 蛋白質序列具有很高的同 源性 其中與朵麗蝶蘭 的 同 源 性 高 達 與 金 蝶 蘭 圖 基因推測的氨基酸序列與其它植物 蛋白質的多序列比對 北 方 園 藝 月 上 文 心 蘭 木 香長生碗 建蘭 馬兜鈴 的 同 源 性 分 別 為 蝴蝶蘭 大辣椒 基因的系統(tǒng)進化樹分析 利用 軟 件 中 的 法分析并構建了蝴蝶蘭 基因的系統(tǒng)進 化樹 結果表明 蝴蝶蘭 蛋白與朵麗蝶蘭 的 蛋白親緣關系最 近 朵麗蝶蘭是由蝴蝶蘭屬與朵麗蘭屬異屬雜交 而成的新屬 所以在廣義上 朵麗蝶蘭屬于蝴蝶蘭 屬 與建蘭 文心蘭 和金 蝶蘭 親緣關系較近 與馬兜鈴 親緣關系相對較遠 圖 圖 不同植物 基因的系統(tǒng)進化樹分析 蝴蝶蘭 大辣椒 基因不同時期及不同 組織中的表達規(guī)律分析 以蘭花 基因為內參 利用 方 法分析了 基因在葉 根和花葶組織中的表達 規(guī)律 結果表明 基因在葉片 根和花葶中 都有表達 但表達量存在一定的差異 其中花葶的 表達量最高 圖 同一器官不同發(fā)育時期比較 發(fā)現(xiàn) 基因在葉片中不同發(fā)育時期的表達量 沒有顯著差異 根中 基因表達量在花芽分 化進程中呈遞減趨勢 其中在始花期表達量最低 盛花期最高 而在花葶中 基因表達量隨著 花芽分化的進程而增加 始花期時略有下降 盛花 期時達到最高 同一時期不同器官比較 花葶中 的 基因表達量均遠高于同時期的葉片和根 除抽梗初期外 葉片中的 基因表達量均高于 根 圖 由以上結果可推測 基因在蝴蝶 蘭花的發(fā)育及形成中發(fā)揮作用 討論 已有研究表明 植物開花是一個復雜的過程 會受到植株內在的調控和外界環(huán)境因素的誘導等 多種影響 在植物的開花過程中 開花相關 注 不同小寫字母表示差異顯著 圖 熒光定量檢測 基因在葉片 根和 花葶中的差異表達 的調控基因 開花時間基因 開花基因及花器官特 征基因等 就會啟動表達 進而促使花器官的形 成 在這個過程中許多開花的關鍵基因 如 等 就會相互作用和制約引起花 芽分化 從而導致花器官的發(fā)生 其中 基因 第 期 北 方 園 藝 是協(xié)同其它開花相關基因來抑制分生組織細胞向 營養(yǎng)生長轉變 是決定花分生組織形成的必需基 因 過 表 達 基 因 會 促 使 植 物 開 花 提 前 基因是植物 成花素 的編碼基因 是開花調控途徑的重要因子和關鍵基因之一 是 家族基因 而該家族基因 廣泛存在于植物界中 主要參與花器官的發(fā)育 與 的分類同源的異型基因有 和 其中 基因在植物抗病和耐低溫 脅迫過程中發(fā)揮重要的作用 基因的啟 動子為花器官特異表達的啟動子 它在花瓣和雄 蕊細胞形成過程中起到重要的作用 基因 通過其轉錄因子與相應的 區(qū)域結合從而調 控 花 瓣 和 雄 蕊 的 發(fā) 育 基 因 屬于花器官發(fā)育過程中唯一的 類基 因 負責調控花蕊的發(fā)育 基因屬于 類基因 既是花分生組織特征基因 又是花器 官形態(tài)特征基因 其編碼的蛋白屬于轉錄激活因 子 通過與特定的 序列相結合來調控基 因的表達 已有研究表明 早表達或過表達 基因可以觸發(fā)花的形成和提前開花 等 研究發(fā)現(xiàn) 擬南芥在導入外源 基 因后 花芽出現(xiàn)的時間比野生型提前 等 發(fā)現(xiàn)番茄轉基因 基因 后可以縮 短植株的營養(yǎng)生長周期 為了研究蝴蝶蘭開花調控的分子機制 該研 究采用 技術從蝴蝶蘭中克隆得到 基 因全長序列 進行蛋白結構域分析 顯示 有 典型的 盒與 盒 盒是 轉錄因子 端高度保守的結構域 具有 的結合單元 能夠和特異 相結合 同時也有與蛋白質二 聚化的功能 盒中度保守 由 和 個 螺旋組成 結構 盒可以調節(jié)蛋 白質與蛋白質之間的相互作用 是轉錄因子的結 構特征序列 序列分析發(fā)現(xiàn) 蝴蝶蘭 基因在 端存在單子葉植物典型的 基序 說明蝴蝶蘭 基因為 中 的 亞家族 即 類基因 氨基 酸序 列 同 源 性 分 析 顯 示 同 其 它 植 物 的 蛋白具有很高的相似性 同源性均在 以 上 特 別 是 與 朵 麗 蝶 蘭 的 同 源 性 高 達 這與朵麗蝶蘭是蝴蝶蘭屬與朵麗蘭屬異屬 雜交而成的新屬 相一致 同樣 進化樹分析表 明蝴蝶蘭 基因編碼的蛋白也與蘭科植物的 親緣關系比較近 說明 基因具有種屬特征 基因的調控涉及了植物的整個 發(fā)育過程 包括營養(yǎng)生長的調節(jié) 花器官發(fā)育 子 房和種皮的發(fā)育 根的形成 胚形態(tài)的建成及共生 誘導等 分析發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭 基 因在營養(yǎng)器官 葉片 根 和花葶均有表達 但表達 量存在差異 表明 基因不僅參與了蝴蝶蘭營 養(yǎng)器官形態(tài)的建成 也參與了生殖生長的轉變過 程 同樣 單子葉植物百合 石斛蘭 和文心蘭 與 一樣 都在營養(yǎng)器官中有表達 因此推測 基因 不僅調控了植物花器官組織的發(fā)育 還調控營養(yǎng) 器官發(fā)育 且其在單子葉植物中功能保守 同時 分析發(fā)現(xiàn)在同一時期不同組織器官中 花葶的 表達量遠高于同時期的葉片和根 在萼脊蘭 建蘭和文心蘭中 花葶 表達也是 非常顯著的 在蝴蝶蘭的開花誘導進程中 首先抽出的是花葶 當花葶抽長出 節(jié)以上時 在 花葶上部節(jié)點處分化出花芽 而下部 節(jié)點的 腋芽不出現(xiàn)分化 成為休眠芽 且當環(huán)境條件不適 宜時 花葶上的休眠芽會形成葉芽 因此 蝴 蝶蘭的花葶作為連接營養(yǎng)器官與生殖器官間的重 要器官 其 基因的高表達量正是 基因 對蝴蝶蘭生殖生長影響的一種體現(xiàn) 推測蝴蝶蘭 基因與其開花相關 且在蝴蝶蘭花器官的形 成和分化過程中起了重要的作用 從同一器官不 同發(fā)育時期 基因相對表達量分析發(fā)現(xiàn) 在葉 片中 基因表達量基本一致 表達沒有明顯 的空間差異 在根中 基因表達量在花芽分 化進程中呈遞減趨勢 在始花期達到最低值 盛花 期回 升 而 等 在木蘭中分離的 在苞片 雄蕊 心皮及葉片中高度表達 番茄的一個 亞家族基因 參與 了番茄葉片的發(fā)育 水稻中的 在 根 葉片 花序及所有的花器官中表達 由此 可見 蝴蝶蘭 基因與其它物種的 基因具有相似而又不盡相同的表達特性 綜上 根據(jù) 蛋白結構特點 盒和 盒 以及在花芽分化進程中花葶有較高的表達 量 推測 基因很可能與蝴蝶蘭的成花密切相 關 同時由該基因在蝴蝶蘭不同發(fā)育時期不同組 北 方 園 藝 月 上 織器官中的表達結果 推測 基因既參與了生 殖生長的轉變過程 也參與了蝴蝶蘭營養(yǎng)器官的 形態(tài)建成 該研究結果為后續(xù)通過轉基因技術開 展蝴蝶蘭分子育種提供了技術指導 參考文獻 俞繼英 張陽 鄭錦凱 等 蝴蝶蘭黃花系品種 和 雜交及其后代的遺傳表現(xiàn) 浙江 林學院學報 高永霞 蝴蝶蘭花期調控基因的克隆及功能研究 南京 南京農業(yè)大學 劉藝平 董姬秀 張曼等 荷花 基因的克隆及表達 分析 植物生理學報 羅火林 張亞楠 羅麗萍 等 蘭科植物 基因的密碼子偏 性分析 分子植物育種 崔波 郝平安 梁芳 等 蝴蝶蘭 家族基因的克隆 及在低溫下表達特性分析 園藝學報 董姬秀 荷花 基因的克隆與表達分析 鄭州 河南農業(yè)大學 蔣素華 黃萍 王默霏 等 萼脊蘭 基因的克隆及 表達載體構建 華北農學報 葛春艷 李雪彤 劉福鵬 等 紅景天 基因 的電 子克隆及 生 物 信 息 學 分 析 江 蘇 農 業(yè) 科 學 第 期 北 方 園 藝 張國付 萼脊蘭 基因的序列分析及表達 特性研究 鄭州 河南農業(yè)大學 北 方 園 藝 月 上