蝴蝶蘭"大辣椒"APETALA1基因的克隆及表達(dá).pdf

北 方 園 藝 園林花卉 第一作者簡(jiǎn)介 何荊洲 女 碩士 副研究員 現(xiàn)主 要從事生物技術(shù)與植物育種等研究工作 責(zé)任作者 卜朝陽(yáng) 女 碩士 研究員 現(xiàn)主要從事 花卉育種等研究工作 基金項(xiàng)目 廣 西 科 技 重 大 專(zhuān) 項(xiàng) 資 助 項(xiàng) 目 桂 科 廣西科技基地和人才專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目 桂 科 廣 西 自 然 基 金 資 助 項(xiàng) 目 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目 收稿日期 蝴蝶蘭 大辣椒 基因的 克隆及表達(dá) 何 荊 洲 范 繼 征 曾 艷 華 李 秀 玲 盧 家 仕 卜 朝 陽(yáng) 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所 廣西 南寧 摘 要 以蝴蝶蘭 大辣椒 為試材 采用 技術(shù)克隆蝴蝶蘭 基 因的 全長(zhǎng) 分析基本生物學(xué)信息 并初步探索其在花芽分化過(guò)程中的作用 結(jié)果表 明 基因的 全長(zhǎng)為 開(kāi)放閱讀框 編碼 個(gè)氨基酸 含有 盒與 盒等保守功能結(jié)構(gòu)域 同源性比對(duì)結(jié)果顯示 蝴蝶蘭 大 辣椒 與朵麗蝶蘭 金蝶蘭 文心蘭 石斛蘭和馬兜鈴等植物的 蛋白有較高的相似性 同源性均在 以上 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示 蝴蝶蘭 大辣椒 基因與朵麗蝶蘭聚類(lèi)關(guān) 系最近 實(shí)時(shí)熒光定量 檢測(cè)發(fā)現(xiàn) 基因在葉片 根和花葶中均有表達(dá) 但表達(dá)量有 差異 同一器官不同發(fā)育時(shí)期比較顯示 葉片的 基因表達(dá)量沒(méi)有明顯的時(shí)空差異 根 基因的表達(dá)量隨著花芽分化的進(jìn)程呈遞減趨勢(shì) 其中始花期的表達(dá)量最低 盛花期最 高 而花葶中 基因表達(dá)量隨著花芽分化呈增加趨勢(shì) 在盛花期表達(dá)量達(dá)到峰值 同一 時(shí)期不同器官比較 花葶中 的表達(dá)量顯著高于同一時(shí)期的葉片和根 由 此 推測(cè) 基因在調(diào)控蝴蝶蘭花芽分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用 關(guān)鍵詞 蝴蝶蘭 基因 基因表達(dá) 中圖分類(lèi)號(hào) 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 文章編號(hào) 蝴蝶蘭屬蘭科 蝴蝶蘭屬 常綠草本植物 其花色艷麗 花形奇特 花期可達(dá) 個(gè)月 素有 洋蘭皇后 的美稱(chēng) 是世界花卉中最具有價(jià)值的盆栽花卉之一 在 中國(guó) 蝴蝶蘭的銷(xiāo)售季節(jié)主要集中在 春節(jié) 前后 月 但蝴蝶蘭的自然花期一般在 月 為迎合市場(chǎng)需求普遍采用控溫技術(shù)來(lái)促使花期提 前 經(jīng)濟(jì)成本較高 另外 蝴蝶蘭的童期較長(zhǎng) 一 般為 年 大大增加了優(yōu)良品種培育的難度 因 此 深入開(kāi)展蝴蝶蘭成花的分子機(jī)理研究 探討如 何通過(guò)分子手段使蝴蝶蘭開(kāi)花季節(jié)提前成為研究 人員的研究熱點(diǎn) 開(kāi)花是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)渡到生殖生長(zhǎng)的典 型特征 這個(gè)特征的形成有許多基因的參與 其中 基因編碼一個(gè) 轉(zhuǎn)錄因子 在控制 花分生組織特性和花器官形成的過(guò)程中起著非常 重要的作用 是調(diào)控花發(fā)育的熱點(diǎn)基因之一 基因通過(guò)時(shí)空表達(dá)來(lái)調(diào)控花分生組織形成 及花器官發(fā)育 同時(shí) 基因的表達(dá)也能夠促進(jìn) 植物提前開(kāi)花 在擬南芥植物中分別轉(zhuǎn)入柳樹(shù) 的 個(gè) 同源基因 其開(kāi) 花時(shí)間出現(xiàn)提前 并且出現(xiàn)雌蕊 雄蕊和花瓣增多 的現(xiàn)象 等 將 基因轉(zhuǎn)入矮牽牛 使其提前開(kāi)花 且花能夠持續(xù)不斷地開(kāi)放 基因同樣也能控制芍藥中花瓣 萼片 心皮和雄蕊 的形成 目前在蝴蝶蘭中關(guān)于 基因的研 究報(bào)道甚少 該研 究 以 蝴 蝶 蘭 大 辣 椒 為試材 通過(guò) 和 技 術(shù)克隆得到 基因的 全長(zhǎng) 分析了該 基因的結(jié)構(gòu) 利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)蝴蝶蘭 大 辣椒 蛋白的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu) 并對(duì)其在蝴 蝶蘭 大辣椒 不同發(fā)育時(shí)期及不同組織中的表達(dá) 進(jìn)行了分析 以期為進(jìn)一步研究調(diào)控蝴蝶蘭花芽 分化 促進(jìn)其開(kāi)花以及探討該基因在開(kāi)花過(guò)程中 的表達(dá)調(diào)控和開(kāi)花作用機(jī)理提供參考依據(jù) 材料與方法 試驗(yàn)材料 蝴蝶蘭 大辣椒 由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究 所觀賞植物研發(fā)中心提供 試驗(yàn)方法 以蝴蝶蘭 大辣椒 組培繼代苗的葉片組織提 取總 然后采用 技術(shù)克隆出 基 因的 全長(zhǎng) 采用 技術(shù)檢測(cè)蝴蝶 蘭 大辣椒 的葉片 根和花葶中 基因不同發(fā) 育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律 項(xiàng)目測(cè)定 總 提取及 合成 取蝴蝶蘭 大辣椒 盛花期的葉子 濕布擦拭 干凈 取 葉片組織用液氮碾磨成粉狀 根據(jù) 北京天根 試劑盒說(shuō)明書(shū) 的操作方法提取蝴蝶蘭的總 采用分光光 度計(jì)檢測(cè)總 濃度 用 瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè)其 完 整 性 使 用 去 除 總 中的 根據(jù) 試劑盒的操作說(shuō)明 使用引物 將總 逆 轉(zhuǎn)錄合成 使用 對(duì) 合成的 進(jìn)行去 處理 冰箱保 存?zhèn)溆?采用 擴(kuò)增基因的全長(zhǎng) 根據(jù) 中公布的朵麗蝶蘭 序 列號(hào) 基因保守序列 設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引 物 表 以合成的 為模板 和 為引物 擴(kuò)增出蝴蝶蘭 基因中間片段 擴(kuò)增體系 個(gè)循環(huán) 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 切膠回收 連接和轉(zhuǎn)化 由生物工程 上海 有限責(zé)任公司進(jìn) 行測(cè)序 根據(jù)獲得的中間片段序列 再設(shè)計(jì) 和 巢式 引物 和 表 采用 試 劑 盒 公 司 擴(kuò) 增 序 列 及 試 劑盒 公司 擴(kuò)增 序列 將獲得的兩 端序列和中間片段用 軟件進(jìn)行拼接 進(jìn)行蝴蝶蘭 基因全長(zhǎng) 的預(yù)測(cè) 表 擴(kuò)增引物序列 引物名稱(chēng) 引物序列 序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 利用 網(wǎng)站上的 程序進(jìn)行序列 相似 性 分 析 使 用 在 線 網(wǎng) 站 進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的預(yù)測(cè) 蛋白一 級(jí)結(jié)構(gòu) 理論等電點(diǎn)和分子量 及蛋白保守區(qū)的預(yù) 測(cè) 初步分析目的基因的功能 利用 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 不同組織及不同發(fā)育時(shí)期 基因的表 達(dá)規(guī)律 分別取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期 低溫誘導(dǎo)期 抽梗初期 花葶長(zhǎng) 抽梗期 花葶長(zhǎng) 始 花期 盛花期的葉 根和花葶組織 在液氮中速凍 北 方 園 藝 月 上 后提取總 以蘭花的 基因作為內(nèi)參 參 照 使用說(shuō) 明 采 用 方 法 引物 檢測(cè) 基因在葉 根和花葶組織的不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)情況 采用 計(jì)算方法進(jìn)行分析 以相對(duì)表達(dá)量最低 的組織為基點(diǎn)作圖 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤表示 利用 軟件和單因素方差分析 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析 將統(tǒng)計(jì)結(jié)果做成柱狀圖 結(jié)果與分析 蝴蝶蘭 大辣椒 基因 全長(zhǎng)及氨 基酸序列分析 根據(jù) 已發(fā)布的 同源基因 課題組 先克隆出部分中間片段 大小為 圖 然 注 中間片段 片段 片段 圖 蝴蝶蘭 大辣椒 基因的 擴(kuò)增 注 下劃線表示起始密碼子 表示終止密碼子 圖 蝴蝶蘭 大辣椒 基因的核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列 第 期 北 方 園 藝 后再采用 技術(shù)分別擴(kuò)增出 和 的 其長(zhǎng)度分別為 和 經(jīng) 軟件將中間片段 和 片段拼接 獲得了 基因的 全 長(zhǎng)為 該基因的 為 共編碼 個(gè)氨基酸 圖 相對(duì)分子量 等 電點(diǎn) 脂溶指數(shù) 總平均親水性 對(duì)蝴蝶蘭 基因的氨基酸及蛋白結(jié)構(gòu)域 進(jìn)行分析 結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白序列屬于植物特有的 型 基因 包含典型的 盒與 盒 其中 盒包含了 個(gè)氨基酸 組成的高度保守結(jié)構(gòu)域 圖 盒包 含 個(gè)氨基酸 主要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與 蛋白質(zhì)之間的相互作用 是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征 序列 并 在 端 發(fā) 現(xiàn) 存 在 單 子 葉 植 物 典 型 的 基序 說(shuō)明蝴蝶蘭 基因 圖 蝴蝶蘭 大辣椒 基因蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域 為 中的 亞家族 即 類(lèi)基因 蝴蝶蘭 基因的同源性比對(duì)分析 由圖 可知 蝴蝶蘭 蛋白質(zhì)的序列與其 它植物的 蛋白質(zhì)序列具有很高的同 源性 其中與朵麗蝶蘭 的 同 源 性 高 達(dá) 與 金 蝶 蘭 圖 基因推測(cè)的氨基酸序列與其它植物 蛋白質(zhì)的多序列比對(duì) 北 方 園 藝 月 上 文 心 蘭 木 香長(zhǎng)生碗 建蘭 馬兜鈴 的 同 源 性 分 別 為 蝴蝶蘭 大辣椒 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 利用 軟 件 中 的 法分析并構(gòu)建了蝴蝶蘭 基因的系統(tǒng)進(jìn) 化樹(shù) 結(jié)果表明 蝴蝶蘭 蛋白與朵麗蝶蘭 的 蛋白親緣關(guān)系最 近 朵麗蝶蘭是由蝴蝶蘭屬與朵麗蘭屬異屬雜交 而成的新屬 所以在廣義上 朵麗蝶蘭屬于蝴蝶蘭 屬 與建蘭 文心蘭 和金 蝶蘭 親緣關(guān)系較近 與馬兜鈴 親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn) 圖 圖 不同植物 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 蝴蝶蘭 大辣椒 基因不同時(shí)期及不同 組織中的表達(dá)規(guī)律分析 以蘭花 基因?yàn)閮?nèi)參 利用 方 法分析了 基因在葉 根和花葶組織中的表達(dá) 規(guī)律 結(jié)果表明 基因在葉片 根和花葶中 都有表達(dá) 但表達(dá)量存在一定的差異 其中花葶的 表達(dá)量最高 圖 同一器官不同發(fā)育時(shí)期比較 發(fā)現(xiàn) 基因在葉片中不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量 沒(méi)有顯著差異 根中 基因表達(dá)量在花芽分 化進(jìn)程中呈遞減趨勢(shì) 其中在始花期表達(dá)量最低 盛花期最高 而在花葶中 基因表達(dá)量隨著 花芽分化的進(jìn)程而增加 始花期時(shí)略有下降 盛花 期時(shí)達(dá)到最高 同一時(shí)期不同器官比較 花葶中 的 基因表達(dá)量均遠(yuǎn)高于同時(shí)期的葉片和根 除抽梗初期外 葉片中的 基因表達(dá)量均高于 根 圖 由以上結(jié)果可推測(cè) 基因在蝴蝶 蘭花的發(fā)育及形成中發(fā)揮作用 討論 已有研究表明 植物開(kāi)花是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程 會(huì)受到植株內(nèi)在的調(diào)控和外界環(huán)境因素的誘導(dǎo)等 多種影響 在植物的開(kāi)花過(guò)程中 開(kāi)花相關(guān) 注 不同小寫(xiě)字母表示差異顯著 圖 熒光定量檢測(cè) 基因在葉片 根和 花葶中的差異表達(dá) 的調(diào)控基因 開(kāi)花時(shí)間基因 開(kāi)花基因及花器官特 征基因等 就會(huì)啟動(dòng)表達(dá) 進(jìn)而促使花器官的形 成 在這個(gè)過(guò)程中許多開(kāi)花的關(guān)鍵基因 如 等 就會(huì)相互作用和制約引起花 芽分化 從而導(dǎo)致花器官的發(fā)生 其中 基因 第 期 北 方 園 藝 是協(xié)同其它開(kāi)花相關(guān)基因來(lái)抑制分生組織細(xì)胞向 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變 是決定花分生組織形成的必需基 因 過(guò) 表 達(dá) 基 因 會(huì) 促 使 植 物 開(kāi) 花 提 前 基因是植物 成花素 的編碼基因 是開(kāi)花調(diào)控途徑的重要因子和關(guān)鍵基因之一 是 家族基因 而該家族基因 廣泛存在于植物界中 主要參與花器官的發(fā)育 與 的分類(lèi)同源的異型基因有 和 其中 基因在植物抗病和耐低溫 脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要的作用 基因的啟 動(dòng)子為花器官特異表達(dá)的啟動(dòng)子 它在花瓣和雄 蕊細(xì)胞形成過(guò)程中起到重要的作用 基因 通過(guò)其轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)的 區(qū)域結(jié)合從而調(diào) 控 花 瓣 和 雄 蕊 的 發(fā) 育 基 因 屬于花器官發(fā)育過(guò)程中唯一的 類(lèi)基 因 負(fù)責(zé)調(diào)控花蕊的發(fā)育 基因?qū)儆?類(lèi)基因 既是花分生組織特征基因 又是花器 官形態(tài)特征基因 其編碼的蛋白屬于轉(zhuǎn)錄激活因 子 通過(guò)與特定的 序列相結(jié)合來(lái)調(diào)控基 因的表達(dá) 已有研究表明 早表達(dá)或過(guò)表達(dá) 基因可以觸發(fā)花的形成和提前開(kāi)花 等 研究發(fā)現(xiàn) 擬南芥在導(dǎo)入外源 基 因后 花芽出現(xiàn)的時(shí)間比野生型提前 等 發(fā)現(xiàn)番茄轉(zhuǎn)基因 基因 后可以縮 短植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)周期 為了研究蝴蝶蘭開(kāi)花調(diào)控的分子機(jī)制 該研 究采用 技術(shù)從蝴蝶蘭中克隆得到 基 因全長(zhǎng)序列 進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析 顯示 有 典型的 盒與 盒 盒是 轉(zhuǎn)錄因子 端高度保守的結(jié)構(gòu)域 具有 的結(jié)合單元 能夠和特異 相結(jié)合 同時(shí)也有與蛋白質(zhì)二 聚化的功能 盒中度保守 由 和 個(gè) 螺旋組成 結(jié)構(gòu) 盒可以調(diào)節(jié)蛋 白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用 是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié) 構(gòu)特征序列 序列分析發(fā)現(xiàn) 蝴蝶蘭 基因在 端存在單子葉植物典型的 基序 說(shuō)明蝴蝶蘭 基因?yàn)?中 的 亞家族 即 類(lèi)基因 氨基 酸序 列 同 源 性 分 析 顯 示 同 其 它 植 物 的 蛋白具有很高的相似性 同源性均在 以 上 特 別 是 與 朵 麗 蝶 蘭 的 同 源 性 高 達(dá) 這與朵麗蝶蘭是蝴蝶蘭屬與朵麗蘭屬異屬 雜交而成的新屬 相一致 同樣 進(jìn)化樹(shù)分析表 明蝴蝶蘭 基因編碼的蛋白也與蘭科植物的 親緣關(guān)系比較近 說(shuō)明 基因具有種屬特征 基因的調(diào)控涉及了植物的整個(gè) 發(fā)育過(guò)程 包括營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的調(diào)節(jié) 花器官發(fā)育 子 房和種皮的發(fā)育 根的形成 胚形態(tài)的建成及共生 誘導(dǎo)等 分析發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭 基 因在營(yíng)養(yǎng)器官 葉片 根 和花葶均有表達(dá) 但表達(dá) 量存在差異 表明 基因不僅參與了蝴蝶蘭營(yíng) 養(yǎng)器官形態(tài)的建成 也參與了生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變過(guò) 程 同樣 單子葉植物百合 石斛蘭 和文心蘭 與 一樣 都在營(yíng)養(yǎng)器官中有表達(dá) 因此推測(cè) 基因 不僅調(diào)控了植物花器官組織的發(fā)育 還調(diào)控營(yíng)養(yǎng) 器官發(fā)育 且其在單子葉植物中功能保守 同時(shí) 分析發(fā)現(xiàn)在同一時(shí)期不同組織器官中 花葶的 表達(dá)量遠(yuǎn)高于同時(shí)期的葉片和根 在萼脊蘭 建蘭和文心蘭中 花葶 表達(dá)也是 非常顯著的 在蝴蝶蘭的開(kāi)花誘導(dǎo)進(jìn)程中 首先抽出的是花葶 當(dāng)花葶抽長(zhǎng)出 節(jié)以上時(shí) 在 花葶上部節(jié)點(diǎn)處分化出花芽 而下部 節(jié)點(diǎn)的 腋芽不出現(xiàn)分化 成為休眠芽 且當(dāng)環(huán)境條件不適 宜時(shí) 花葶上的休眠芽會(huì)形成葉芽 因此 蝴 蝶蘭的花葶作為連接營(yíng)養(yǎng)器官與生殖器官間的重 要器官 其 基因的高表達(dá)量正是 基因 對(duì)蝴蝶蘭生殖生長(zhǎng)影響的一種體現(xiàn) 推測(cè)蝴蝶蘭 基因與其開(kāi)花相關(guān) 且在蝴蝶蘭花器官的形 成和分化過(guò)程中起了重要的作用 從同一器官不 同發(fā)育時(shí)期 基因相對(duì)表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn) 在葉 片中 基因表達(dá)量基本一致 表達(dá)沒(méi)有明顯 的空間差異 在根中 基因表達(dá)量在花芽分 化進(jìn)程中呈遞減趨勢(shì) 在始花期達(dá)到最低值 盛花 期回 升 而 等 在木蘭中分離的 在苞片 雄蕊 心皮及葉片中高度表達(dá) 番茄的一個(gè) 亞家族基因 參與 了番茄葉片的發(fā)育 水稻中的 在 根 葉片 花序及所有的花器官中表達(dá) 由此 可見(jiàn) 蝴蝶蘭 基因與其它物種的 基因具有相似而又不盡相同的表達(dá)特性 綜上 根據(jù) 蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 盒和 盒 以及在花芽分化進(jìn)程中花葶有較高的表達(dá) 量 推測(cè) 基因很可能與蝴蝶蘭的成花密切相 關(guān) 同時(shí)由該基因在蝴蝶蘭不同發(fā)育時(shí)期不同組 北 方 園 藝 月 上 織器官中的表達(dá)結(jié)果 推測(cè) 基因既參與了生 殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變過(guò)程 也參與了蝴蝶蘭營(yíng)養(yǎng)器官的 形態(tài)建成 該研究結(jié)果為后續(xù)通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)開(kāi) 展蝴蝶蘭分子育種提供了技術(shù)指導(dǎo) 參考文獻(xiàn) 俞繼英 張陽(yáng) 鄭錦凱 等 蝴蝶蘭黃花系品種 和 雜交及其后代的遺傳表現(xiàn) 浙江 林學(xué)院學(xué)報(bào) 高永霞 蝴蝶蘭花期調(diào)控基因的克隆及功能研究 南京 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 劉藝平 董姬秀 張曼等 荷花 基因的克隆及表達(dá) 分析 植物生理學(xué)報(bào) 羅火林 張亞楠 羅麗萍 等 蘭科植物 基因的密碼子偏 性分析 分子植物育種 崔波 郝平安 梁芳 等 蝴蝶蘭 家族基因的克隆 及在低溫下表達(dá)特性分析 園藝學(xué)報(bào) 董姬秀 荷花 基因的克隆與表達(dá)分析 鄭州 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 蔣素華 黃萍 王默霏 等 萼脊蘭 基因的克隆及 表達(dá)載體構(gòu)建 華北農(nóng)學(xué)報(bào) 葛春艷 李雪彤 劉福鵬 等 紅景天 基因 的電 子克隆及 生 物 信 息 學(xué) 分 析 江 蘇 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 第 期 北 方 園 藝 張國(guó)付 萼脊蘭 基因的序列分析及表達(dá) 特性研究 鄭州 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 北 方 園 藝 月 上