甜瓜MAPK基因的表達(dá)分析_辛董董.pdf

北方園藝（）： ·研究論文 ·第一作者簡介 ：辛董董 （），男 ，碩士研究生 ，研究方向為園藝植物生理特性及生物技術(shù)育種 。：責(zé)任作者 ：李桂榮 （），女 ，博士 ，副教授 ，現(xiàn)主要從事園藝植物育種與生物技術(shù)教學(xué)與科研等工作 。：基金項目 ：國家自然科學(xué)基金資助項目 （）；河南省自然基金資助項目 （）；河南省高校重點科研資助項目 （）。收稿日期 ：甜瓜基因的表達(dá)分析辛 董 董，李 桂 榮，郭 衛(wèi) 麗，鄭 秋 云，耿 新 麗（河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)；新疆鄯善葡萄瓜果研究所，新疆 鄯善）摘要 ：以 “哈密加格達(dá) ”甜瓜為試材 ，采用實時定量（）方法 ，研究了水楊酸 （）、乙烯利 （）和南瓜白粉病病原菌處理甜瓜葉片的基因的表達(dá)情況 ，以期為甜瓜基因的調(diào)控功能研究及甜瓜抗白粉病育種提供參考依據(jù) 。結(jié)果表明 ：處理抗病甜瓜葉片后 的、 個基因的表達(dá)上調(diào) ，基因表達(dá)量最大 ，處理感病甜瓜葉片、后的表達(dá)量上調(diào) ；處理抗病甜瓜葉片后、 個基因的表達(dá)量上調(diào)明顯 ，基因表達(dá)量最大 ，處理感病甜瓜葉片后基因的表達(dá)量最大 ；南瓜白粉病孢子處理抗甜瓜葉片后基因的表達(dá)量上調(diào)最明顯 ；南瓜白粉病孢子處理感病甜瓜葉片后基因的表達(dá)量上調(diào)明顯 ，綜上所述 ，在甜瓜葉片中、南瓜白粉病病原菌均可以誘導(dǎo)該基因的表達(dá) 。其中 ，、分別在處理抗病甜瓜葉片后和處理感病甜瓜葉片、后能夠響應(yīng)的誘導(dǎo) ；能夠響應(yīng)和南瓜白粉病孢子的誘導(dǎo) 。關(guān)鍵詞 ：甜瓜 ；甜瓜白粉病 ；基因 ；表達(dá)分析中圖分類號 ： 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ： 文章編號 ：（）甜瓜白粉病是在瓜類作物上廣泛發(fā)生的重要病害之一 ，在世界各地甜瓜主要生產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生 ，不論是露地還是保護(hù)地栽培 ，在甜瓜生產(chǎn)過程中預(yù)防不到位均將造成甜瓜植株葉片大面積枯死 ，導(dǎo)致甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降。目前在甜瓜生產(chǎn)上主要靠噴施農(nóng)藥防治甜瓜白粉病 ，這不僅在栽培上增加了勞動力 ，并且增加防病成本，采用化學(xué)防病會造成環(huán)境污染 ，不利于生產(chǎn)有機果品 ，也不利于人與自然和諧共處 ，對生態(tài)環(huán)境造成破壞 ，更重要的是長期使用化學(xué)殺菌劑易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此 ，研究如何利用甜瓜抗病基因 ，篩選優(yōu)異抗病基因資源用于抗病新品種的培育 ，是從根本上解決甜瓜白粉病病害的一種有效途徑。植物中的絲裂原活化蛋白激酶 （）能夠被多種生物和非生物脅迫誘導(dǎo) ，參與植物生長 、發(fā)育和脅迫應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程 ，是信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者 ，能將外界各種刺激信號 （如高鹽脅迫 、低溫脅迫 ）傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi) ，誘導(dǎo)相應(yīng)基因表達(dá) ，是一組能被不同的細(xì)胞外刺激 （如細(xì)胞因子 、神經(jīng)遞質(zhì) 、激素 、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附 ）激活的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶 。由于是培養(yǎng)細(xì)胞在受到生長因子等絲裂原刺激時被激活而被鑒定的 ，因而得名。與其它信號分子組成級聯(lián)途徑 ，通過依次磷酸 化 將 逆 境 信 號 傳 遞 下 去 ，即。目前 ，科學(xué)家已從擬南芥、花生、棉花、丹參、煙草、亞麻等植 物 中 分 離 得 到基 因 ，研 究 表 明 ，基因與植物抗逆性有密切關(guān)系，但是 ，甜瓜基因還沒有相關(guān)方面報道 。近幾年植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究多集中在擬南芥等模式植物中 ，而且級聯(lián)反應(yīng)途徑是參與植物耐鹽生理調(diào)控的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一 ，在瓜類植物研究較少。一些瓜類植物與擬南芥等進(jìn)化關(guān)系比較遠(yuǎn) ，因此 ，研究瓜類植物的信號途徑 ，可以從抗逆植物入手 ，以全面了解不同習(xí)性植物的抗逆分子途徑。該研究選取抗白粉病的高代自交系和感病的甜瓜作為試驗材料 ，通過水楊酸 （）、乙烯利（）和南瓜白粉病病原菌分別處理感病和抗病甜瓜 ，利用熒光定量方法分析了基因在葉片中的表達(dá)模式 ，進(jìn)而研究基因在病原真菌侵染過程中的表達(dá)規(guī)律 ，鑒定與抗病性最為相關(guān)的一個或多個基因 ，篩選甜瓜抗白粉病相關(guān)基因 ，以期為甜瓜的抗病育種提供思路。 材料與方法 試驗材料供試甜瓜抗病品種 “哈密加格達(dá) ”（）及感病品種 （）種子由新疆鄯善葡萄瓜果研究所提供 ；水楊酸 （）、乙烯利 （）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司 ；南瓜白粉病病原菌采自河南科技學(xué)院試驗田中自然發(fā)病的南瓜病株 ，中國南瓜高抗白粉病自交系 和高感白粉病自交系 “九江轎頂 ”，保存于河南科技學(xué)院南瓜團(tuán)隊 。 試驗方法 試驗設(shè)計種子播種萌發(fā)獲得片真葉后 ，分別用·水楊酸 （）、·乙烯利 （）噴灑于甜瓜葉片表面 ，每個處理株苗 ，重復(fù)次 。將南瓜白粉病病原菌接種于培養(yǎng)基 ，培養(yǎng)周后 ，利用黑光燈照射培養(yǎng) ，誘導(dǎo)南瓜白粉病病原菌孢子的產(chǎn)生 。取南瓜白粉病病原 菌 分 生 孢 子 ，制 成 孢 子 濃 度 約 為×個 ·懸浮液 ，噴灑于甜瓜葉片表面 ，分別處理、后 ，取其葉片 ，迅速置于液氮中冷凍后 ，放置在條件下進(jìn)行保存?zhèn)溆?。 總的提取利用通用植物快速提取試劑盒 的方法提取總。提取稀釋倍 ，測定值 ，計算濃度 。再取總進(jìn)行電泳 ，觀察條帶 。 反轉(zhuǎn)錄模板以為 模 板 ，參 照 的操作說明書完成第一條鏈的合成 。 基因的篩選將稀釋到·。在離心管中依次加入上游引物 、下游引物 、· 、 做混合樣 ，分別取加入離心管中 ，之后分別加入經(jīng)過水楊酸（）、乙烯利 （）、南瓜白粉病病原菌在不同時間條件處理的感病和抗病甜瓜葉片的模板。反應(yīng)程序 ：預(yù)變性，然后進(jìn)行以下循環(huán) ，變性，退火，延伸，共個循環(huán) 。最后延伸，保持 。實時定量引物如表所示 ，引物由奧科鼎盛生物有限公司合成 。采用的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因檢測 。表 實時定量特異引物序列 編號序列（） 甜瓜基因片段的擴(kuò)增取一個的離心管依次加 入、上游引物 、下游引物 、模 板 、 ，充分混勻 ，在孔板子里分別加北方園藝月 （下 ）入混合樣 ，再分別加入 模板 ，按照上述反應(yīng)體系每個處理的模板重復(fù)次 。在已經(jīng)加好反應(yīng)液的孔板子上附上膜 。離心后取出 。反應(yīng)程序 ：預(yù)變性，然后進(jìn)行以下循環(huán) ，變性，退火，延伸，。 數(shù)據(jù)分析實時定量試驗數(shù)據(jù)均為次重復(fù)的平均值 ，采用 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理 ，采 用 軟 件 進(jìn) 行做圖 。 結(jié)果與分析 甜瓜總的提取由圖可知 ，總呈現(xiàn)出條清晰可區(qū)分的條帶 ，個條帶的亮度比值為，表明未降解 ，可以用于后續(xù)試驗 。注 ：樣品處理時間分別為 、。： ，圖 乙烯利處理感病甜瓜葉片總 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果 甜瓜基因在、和南瓜白粉病病原菌孢子誘導(dǎo)條件下表達(dá)特性分析 誘導(dǎo)甜瓜基因在感病和抗病甜瓜葉片中的表達(dá)分析由圖可知 ，處理對抗病甜瓜的葉片的和基因的表達(dá)有顯著影響 ，與相比 ，處理、后 ，種基因的表達(dá)量均上調(diào) ，其中 ，基因表達(dá)量最高 ，與相比 ，分別增加、倍 ；基因次 之 ；基 因 表 達(dá) 量 最 小 。表 明、 種基因能夠響應(yīng)的誘導(dǎo) 。由圖可知 ，感病甜瓜的葉片經(jīng)處理后 ，基因的表達(dá)量上調(diào) ，其 中 ，在、處理后表達(dá)量分別達(dá)到最大 ，與相比 ，基 因 分 別 增 加、倍 ，、基因的表達(dá)變化不大 ，表明基因能夠響應(yīng)的誘導(dǎo) 。圖 熒光定量分析 處理抗病甜瓜葉片后的基因表達(dá) 圖 熒光定量分析 處理感病甜瓜葉片后的基因表達(dá) 誘導(dǎo)甜瓜基因在感病和抗病甜瓜葉片中的表達(dá)分析由圖可知 ，抗病甜瓜葉片經(jīng)過處理、后基因相對表達(dá)量上調(diào)明顯 ，與 第 期北方園藝處理相比 ，抗病甜瓜葉片經(jīng)處理、后基因相對表達(dá)量分別增 加 了、倍 ；基因在處理后表達(dá)量上調(diào)明顯 ，與處理相比 ，相對表達(dá)量增加了倍 ，表明、 個基因均可以響應(yīng)的誘導(dǎo) 。由圖可知 ，經(jīng)處理后 ，感病甜瓜葉片和 種基因的相對表達(dá)量均上調(diào) ，其中在處理、后相對表達(dá)量上調(diào)明顯 ，處理后上調(diào)最明顯 ，與處理相比 ，感病甜瓜葉片經(jīng)過處理后基因相對表達(dá)量增加了倍 ，并且基 因 的 表 達(dá) 量 優(yōu) 于基 因 ，、 個基因均可以響應(yīng)的誘導(dǎo) 。圖 熒光定量分析 處理抗病甜瓜葉片后的基因表達(dá) 圖 熒光定量分析 處理感病甜瓜葉片后的基因表達(dá) 甜瓜基因在南瓜白粉病孢子誘導(dǎo)條件下的表達(dá)特征分析由圖可知 ，抗病甜瓜葉片經(jīng)病原菌處理后 ，、和 種基因的相對表達(dá)量分別在處理后達(dá)到最大 ，其中 ，基因的表達(dá)量上調(diào)最為明顯 ，與處理相比 ，增加倍 ；基因的相對表達(dá)量次之 ，基因的相對表達(dá)量最最低 。表明、 個基因均能夠響應(yīng)南瓜白粉病孢子的誘導(dǎo) 。由圖可知 ，南瓜白粉病病原菌孢 子 處 理 感 病 甜 瓜 葉 片、后、和 種基因的相對表達(dá)量逐漸增加 ，處理后均達(dá)到最大值 ；基因的表達(dá)量與處理相比 ，增加了倍 ，基因的表達(dá)量次之 ，圖 熒光定量分析南瓜白粉病病原菌誘導(dǎo)抗病甜瓜葉片后的 基因的表達(dá) 圖 熒光定量分析南瓜白粉病病原菌誘導(dǎo)感病甜瓜葉片后的 基因表達(dá) 北方園藝月 （下 ）基因的表達(dá)量最低 。其中 ，南瓜白粉病孢子處理感病 甜 瓜 葉 片后、和 種 基 因 的 表 達(dá) 量 分 別 降 低 ，表 明、 種基因均能夠響應(yīng)南瓜白粉病孢子的誘導(dǎo) 。 討論與結(jié)論基因在植物中能夠響應(yīng)各種生物以及非生物的脅迫 ，不僅可以通過磷酸化修飾被激活 ，而且還可以在水平上被激活 ，并且可以參與植物抵抗逆境脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程 。等研究表明 ，在植物干旱和熱脅迫時 ，低濃度的在干旱和熱脅迫應(yīng)答過程中對過表達(dá) 的擬南芥有正調(diào) 控 作 用 。冷 脅 迫下 ，介導(dǎo)番茄低溫脅迫下的表達(dá) ，在擬南 芥 過 表 達(dá)能增強煙草的耐低溫性。在植物的生長發(fā)育過程中遭遇逆境是不可避免的 ，尤其是干旱 、病原菌 、溫差等嚴(yán)重影響植物生長和產(chǎn)量 。甜瓜白粉病在瓜類作物上廣泛發(fā)生 ，進(jìn)行篩選甜瓜優(yōu)異抗病基因資源用于抗病新品種的培育 ，是從根本上解決甜瓜白粉病病害的有效途徑 。級聯(lián)途徑是一類傳遞胞外和胞內(nèi)信號到細(xì)胞響應(yīng)的重要蛋白激酶 ，其在植物的生物和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著極為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn) ，級聯(lián)系統(tǒng)在各種逆境反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。該研究利用熒光定量方法分析了、和南瓜白粉病病原菌誘導(dǎo)感病和抗病甜瓜基因在葉片中的表達(dá)模式 。試驗結(jié)果表明 ，在甜瓜葉片中 ，基因參與由、和南瓜白粉病病原菌介導(dǎo)的植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)的基本信號通路 。分析經(jīng)過、南瓜白粉病病原菌在不同處理時間條件下處理誘導(dǎo)基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn) ，與處理后相比 ，、南瓜白粉病病原菌處理誘導(dǎo)抗病甜瓜和 種基因的表達(dá)量均上調(diào) ，分別在、達(dá)到最大 ；、南瓜白粉病病原菌處理誘導(dǎo)感病甜瓜 種基因的表達(dá)量均上調(diào) ，分別在、達(dá)到最大 ；、南瓜白粉病病原菌處理誘導(dǎo)感病甜瓜基因的表達(dá)量均上調(diào) ，分別在、達(dá)到最大 。說明基因?qū)τ诓煌奶幚頃r間響應(yīng)機制不同 。隨著時間延長基因表達(dá)量也不同 。白粉病作為甜瓜的主要真菌性病害 ，抗白粉病基因的挖掘是目前研究的熱點之一。在甜瓜中有關(guān)抗白粉病基因的研究十分有限 ，該研究主要分析了、和南瓜白粉病病原菌誘導(dǎo)感病和抗病甜瓜葉片中基因的表達(dá)模式 。初步判斷其在甜瓜葉片中的表達(dá)模式 。今后可以甜瓜為試材 ，進(jìn)一步明確抗白粉病相關(guān)基因是如何通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控對白粉病的抗性 。參考文獻(xiàn)王迪 ，田麗美 ，李德澤 甜瓜白粉病苗期接種方法和接種濃度的研究 北方園藝 ，（）：李冰 ，趙玉龍 ，朱強龍 ，等 甜瓜白粉病抗病基因的定位及候選基因分析 中國蔬菜 ，（）：沈佳 ，壽偉松 ，張躍建 甜瓜果實主要數(shù)量性狀的配合力分析 中國瓜菜 ，（）：張計育 ，佟兆國 ，高志紅 、和蘋果輪紋病病原菌誘導(dǎo)湖北海棠 基因的表達(dá) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）： ， ， ， （） ，：袁輝 ，楊勝 ，周文霞 級聯(lián)信號通路與長時程增強中國藥理學(xué)通報，（）：姜翠茹 ，沈曉艷 ，王增蘭 擬南芥 磷酸酶在脅迫反應(yīng)中的新功能 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）：孔祥遠(yuǎn) ，陳冠旭 ，秦貴龍 ，等 花生 基因的篩選和鹽脅迫分析 華北農(nóng)學(xué)報 ，（）：張雪穎 棉花 和 基因家族的全基因組鑒定和功能分析 南京 ：南京農(nóng)業(yè)大學(xué) ，劉俊丹參 基因的克隆及表達(dá)分析楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué) ，張興坦煙草 基因的功能研究重慶：重慶大學(xué) ，于瑩 ，陳宏宇 ，程莉莉 ，等亞麻 基因克隆及鹽堿脅迫下的表達(dá)分析 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 ，（）： ， ， ， ，：王苗苗 ，于杰 ，鐘云 ，等外源 誘導(dǎo)下 基因在采后柑橘果實抗綠霉病中的表達(dá)分析 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）：郭慧敏 ，翟偉卜 ，鄭娜 ，等 基因家族成員在棉花抗黃萎病中 的 功 能 分 析 中 國 科 學(xué) ：生 命 科 學(xué) ，（）： ， ， ， 第 期北方園藝 ，（）： ， ， ， ， ， ，（）： ， ， ，（）： ， ， ， ， ，（）：姚軍 ，耿新麗 ，張翠環(huán) ，等對溫室甜瓜白粉病預(yù)防效果的影響 中國瓜菜 ，（）：，毛云 ，陳剛剛 ，王賢磊 ，等新疆甜瓜品種白粉病抗病基因初步定位 北方園藝 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）：于瑩 ，陳宏宇 ，程莉莉亞麻 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