甜瓜MAPK基因的表達分析_辛董董.pdf

北方園藝（）：研究論文第一作者簡介：辛董董（），男，碩士研究生，研究方向為園藝植物生理特性及生物技術育種。：責任作者：李桂榮（），女，博士，副教授，現主要從事園藝植物育種與生物技術教學與科研等工作。：基金項目：國家自然科學基金資助項目（）；河南省自然基金資助項目（）；河南省高校重點科研資助項目（）。收稿日期：甜瓜基因的表達分析辛董董，李桂榮，郭衛(wèi) 麗，鄭秋云，耿新麗（河南科技學院園藝園林學院，河南新鄉(xiāng)；新疆鄯善葡萄瓜果研究所，新疆鄯善）摘要：以 “哈密加格達 ”甜瓜為試材，采用實時定量（）方法，研究了水楊酸（）、乙烯利（）和南瓜白粉病病原菌處理甜瓜葉片的基因的表達情況，以期為甜瓜基因的調控功能研究及甜瓜抗白粉病育種提供參考依據。結果表明：處理抗病甜瓜葉片后的、個基因的表達上調，基因表達量最大，處理感病甜瓜葉片、后的表達量上調；處理抗病甜瓜葉片后、個基因的表達量上調明顯，基因表達量最大，處理感病甜瓜葉片后基因的表達量最大；南瓜白粉病孢子處理抗甜瓜葉片后基因的表達量上調最明顯；南瓜白粉病孢子處理感病甜瓜葉片后基因的表達量上調明顯，綜上所述，在甜瓜葉片中、南瓜白粉病病原菌均可以誘導該基因的表達。其中，、分別在處理抗病甜瓜葉片后和處理感病甜瓜葉片、后能夠響應的誘導；能夠響應和南瓜白粉病孢子的誘導。關鍵詞：甜瓜；甜瓜白粉病；基因；表達分析中圖分類號：文獻標識碼：文章編號：（）甜瓜白粉病是在瓜類作物上廣泛發(fā)生的重要病害之一，在世界各地甜瓜主要生產區(qū)均有發(fā)生，不論是露地還是保護地栽培，在甜瓜生產過程中預防不到位均將造成甜瓜植株葉片大面積枯死，導致甜瓜產量和品質嚴重下降。目前在甜瓜生產上主要靠噴施農藥防治甜瓜白粉病，這不僅在栽培上增加了勞動力，并且增加防病成本，采用化學防病會造成環(huán)境污染，不利于生產有機果品，也不利于人與自然和諧共處，對生態(tài)環(huán)境造成破壞，更重要的是長期使用化學殺菌劑易使病原菌產生抗藥性。因此，研究如何利用甜瓜抗病基因，篩選優(yōu)異抗病基因資源用于抗病新品種的培育，是從根本上解決甜瓜白粉病病害的一種有效途徑。植物中的絲裂原活化蛋白激酶（）能夠被多種生物和非生物脅迫誘導，參與植物生長、發(fā)育和脅迫應答的信號轉導過程，是信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘炔康闹匾獋鬟f者，能將外界各種刺激信號（如高鹽脅迫、低溫脅迫）傳導到細胞內，誘導相應基因表達，是一組能被不同的細胞外刺激（如細胞因子、神經遞質、激素、細胞應激及細胞黏附）激活的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶。由于是培養(yǎng)細胞在受到生長因子等絲裂原刺激時被激活而被鑒定的，因而得名。與其它信號分子組成級聯途徑，通過依次磷酸化將逆境信號傳遞下去，即。目前，科學家已從擬南芥、花生、棉花、丹參、煙草、亞麻等植物中分離得到基因，研究表明，基因與植物抗逆性有密切關系，但是，甜瓜基因還沒有相關方面報道。近幾年植物信號轉導途徑的研究多集中在擬南芥等模式植物中，而且級聯反應途徑是參與植物耐鹽生理調控的重要信號轉導途徑之一，在瓜類植物研究較少。一些瓜類植物與擬南芥等進化關系比較遠，因此，研究瓜類植物的信號途徑，可以從抗逆植物入手，以全面了解不同習性植物的抗逆分子途徑。該研究選取抗白粉病的高代自交系和感病的甜瓜作為試驗材料，通過水楊酸（）、乙烯利（）和南瓜白粉病病原菌分別處理感病和抗病甜瓜，利用熒光定量方法分析了基因在葉片中的表達模式，進而研究基因在病原真菌侵染過程中的表達規(guī)律，鑒定與抗病性最為相關的一個或多個基因，篩選甜瓜抗白粉病相關基因，以期為甜瓜的抗病育種提供思路。材料與方法試驗材料供試甜瓜抗病品種 “哈密加格達 ”（）及感病品種（）種子由新疆鄯善葡萄瓜果研究所提供；水楊酸（）、乙烯利（）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；南瓜白粉病病原菌采自河南科技學院試驗田中自然發(fā)病的南瓜病株，中國南瓜高抗白粉病自交系和高感白粉病自交系 “九江轎頂 ”，保存于河南科技學院南瓜團隊。試驗方法試驗設計種子播種萌發(fā)獲得片真葉后，分別用水楊酸（）、乙烯利（）噴灑于甜瓜葉片表面，每個處理株苗，重復次。將南瓜白粉病病原菌接種于培養(yǎng)基，培養(yǎng)周后，利用黑光燈照射培養(yǎng) ，誘導南瓜白粉病病原菌孢子的產生。取南瓜白粉病病原菌分生孢子，制成孢子濃度約為個懸浮液，噴灑于甜瓜葉片表面，分別處理、后，取其葉片，迅速置于液氮中冷凍后，放置在條件下進行保存?zhèn)溆?。總的提取利用通用植物快速提取試劑盒的方法提取總。提取稀釋倍，測定值，計算濃度。再取總進行電泳，觀察條帶。反轉錄模板以為模板，參照的操作說明書完成第一條鏈的合成。基因的篩選將稀釋到。在離心管中依次加入上游引物、下游引物、、做混合樣，分別取加入離心管中，之后分別加入經過水楊酸（）、乙烯利（）、南瓜白粉病病原菌在不同時間條件處理的感病和抗病甜瓜葉片的模板。反應程序：預變性，然后進行以下循環(huán) ，變性，退火，延伸，共個循環(huán) 。最后延伸，保持。實時定量引物如表所示，引物由奧科鼎盛生物有限公司合成。采用的瓊脂糖凝膠電泳進行基因檢測。表實時定量特異引物序列編號序列（）甜瓜基因片段的擴增取一個的離心管依次加入、上游引物、下游引物、模板、，充分混勻，在孔板子里分別加北方園藝月（下）入混合樣，再分別加入模板，按照上述反應體系每個處理的模板重復次。在已經加好反應液的孔板子上附上膜。離心后取出。反應程序：預變性，然后進行以下循環(huán) ，變性，退火，延伸，。數據分析實時定量試驗數據均為次重復的平均值，采用軟件對數據進行分析處理，采用軟件進行做圖。結果與分析甜瓜總的提取由圖可知，總呈現出條清晰可區(qū)分的條帶，個條帶的亮度比值為，表明未降解，可以用于后續(xù)試驗。注：樣品處理時間分別為、。：，圖乙烯利處理感病甜瓜葉片總瓊脂糖凝膠電泳檢測結果甜瓜基因在、和南瓜白粉病病原菌孢子誘導條件下表達特性分析誘導甜瓜基因在感病和抗病甜瓜葉片中的表達分析由圖可知，處理對抗病甜瓜的葉片的和基因的表達有顯著影響，與相比，處理、后，種基因的表達量均上調，其中，基因表達量最高，與相比，分別增加、倍；基因次之；基因表達量最小。表明、種基因能夠響應的誘導。由圖可知，感病甜瓜的葉片經處理后，基因的表達量上調，其中，在、處理后表達量分別達到最大，與相比，基因分別增加、倍，、基因的表達變化不大，表明基因能夠響應的誘導。圖熒光定量分析處理抗病甜瓜葉片后的基因表達圖熒光定量分析處理感病甜瓜葉片后的基因表達誘導甜瓜基因在感病和抗病甜瓜葉片中的表達分析由圖可知，抗病甜瓜葉片經過處理、后基因相對表達量上調明顯，與第期北方園藝處理相比，抗病甜瓜葉片經處理、后基因相對表達量分別增加了、倍；基因在處理后表達量上調明顯，與處理相比，相對表達量增加了倍，表明、個基因均可以響應的誘導。由圖可知，經處理后，感病甜瓜葉片和種基因的相對表達量均上調，其中在處理、后相對表達量上調明顯，處理后上調最明顯，與處理相比，感病甜瓜葉片經過處理后基因相對表達量增加了倍，并且基因的表達量優(yōu) 于基因，、個基因均可以響應的誘導。圖熒光定量分析處理抗病甜瓜葉片后的基因表達圖熒光定量分析處理感病甜瓜葉片后的基因表達甜瓜基因在南瓜白粉病孢子誘導條件下的表達特征分析由圖可知，抗病甜瓜葉片經病原菌處理后，、和種基因的相對表達量分別在處理后達到最大，其中，基因的表達量上調最為明顯，與處理相比，增加倍；基因的相對表達量次之，基因的相對表達量最最低。表明、個基因均能夠響應南瓜白粉病孢子的誘導。由圖可知，南瓜白粉病病原菌孢子處理感病甜瓜葉片、后、和種基因的相對表達量逐漸增加，處理后均達到最大值；基因的表達量與處理相比，增加了倍，基因的表達量次之，圖熒光定量分析南瓜白粉病病原菌誘導抗病甜瓜葉片后的基因的表達圖熒光定量分析南瓜白粉病病原菌誘導感病甜瓜葉片后的基因表達北方園藝月（下）基因的表達量最低。其中，南瓜白粉病孢子處理感病甜瓜葉片后、和種基因的表達量分別降低，表明、種基因均能夠響應南瓜白粉病孢子的誘導。討論與結論基因在植物中能夠響應各種生物以及非生物的脅迫，不僅可以通過磷酸化修飾被激活，而且還可以在水平上被激活，并且可以參與植物抵抗逆境脅迫的信號轉導過程。等研究表明，在植物干旱和熱脅迫時，低濃度的在干旱和熱脅迫應答過程中對過表達的擬南芥有正調控作用。冷脅迫下，介導番茄低溫脅迫下的表達，在擬南芥過表達能增強煙草的耐低溫性。在植物的生長發(fā)育過程中遭遇逆境是不可避免的，尤其是干旱、病原菌、溫差等嚴重影響植物生長和產量。甜瓜白粉病在瓜類作物上廣泛發(fā)生，進行篩選甜瓜優(yōu)異抗病基因資源用于抗病新品種的培育，是從根本上解決甜瓜白粉病病害的有效途徑。級聯途徑是一類傳遞胞外和胞內信號到細胞響應的重要蛋白激酶，其在植物的生物和非生物脅迫響應中發(fā)揮著極為重要的作用。研究發(fā)現，級聯系統在各種逆境反應中發(fā)揮重要作用。該研究利用熒光定量方法分析了、和南瓜白粉病病原菌誘導感病和抗病甜瓜基因在葉片中的表達模式。試驗結果表明，在甜瓜葉片中，基因參與由、和南瓜白粉病病原菌介導的植物抗病防衛(wèi)反應的基本信號通路。分析經過、南瓜白粉病病原菌在不同處理時間條件下處理誘導基因的表達情況發(fā)現，與處理后相比，、南瓜白粉病病原菌處理誘導抗病甜瓜和種基因的表達量均上調，分別在、達到最大；、南瓜白粉病病原菌處理誘導感病甜瓜種基因的表達量均上調，分別在、達到最大；、南瓜白粉病病原菌處理誘導感病甜瓜基因的表達量均上調，分別在、達到最大。說明基因對于不同的處理時間響應機制不同。隨著時間延長基因表達量也不同。白粉病作為甜瓜的主要真菌性病害，抗白粉病基因的挖掘是目前研究的熱點之一。在甜瓜中有關抗白粉病基因的研究十分有限，該研究主要分析了、和南瓜白粉病病原菌誘導感病和抗病甜瓜葉片中基因的表達模式。初步判斷其在甜瓜葉片中的表達模式。今后可以甜瓜為試材，進一步明確抗白粉病相關基因是如何通過信號轉導途徑調控對白粉病的抗性。參考文獻王迪，田麗美，李德澤甜瓜白粉病苗期接種方法和接種濃度的研究北方園藝，（）：李冰，趙玉龍，朱強龍，等甜瓜白粉病抗病基因的定位及候選基因分析中國蔬菜，（）：沈佳，壽偉松，張躍建甜瓜果實主要數量性狀的配合力分析中國瓜菜，（）：張計育，佟兆國，高志紅、和蘋果輪紋病病原菌誘導湖北海棠基因的表達中國農業(yè)科學，（）：，，，（），：袁輝，楊勝，周文霞級聯信號通路與長時程增強中國藥理學通報，（）：姜翠茹，沈曉艷，王增蘭擬南芥磷酸酶在脅迫反應中的新功能湖北農業(yè)科學，（）：孔祥遠，陳冠旭，秦貴龍，等花生基因的篩選和鹽脅迫分析華北農學報，（）：張雪穎棉花和基因家族的全基因組鑒定和功能分析南京：南京農業(yè)大學，劉俊丹參基因的克隆及表達分析楊凌：西北農林科技大學，張興坦煙草基因的功能研究重慶：重慶大學，于瑩，陳宏宇，程莉莉，等亞麻基因克隆及鹽堿脅迫下的表達分析東北農業(yè)大學學報，（）：，，，，：王苗苗，于杰，鐘云，等外源誘導下基因在采后柑橘果實抗綠霉病中的表達分析廣東農業(yè)科學，（）：郭慧敏，翟偉卜，鄭娜，等基因家族成員在棉花抗黃萎病中的功能分析中國科學：生命科學，（）：，，，第期北方園藝，（）：，，，，，，（）：，，，（）：，，，，，（）：姚軍，耿新麗，張翠環(huán) ，等對溫室甜瓜白粉病預防效果的影響中國瓜菜，（）：，毛云，陳剛剛，王賢磊，等新疆甜瓜品種白粉病抗病基因初步定位北方園藝，（）：，，，，（）：，，，，（）：于瑩，陳宏宇，程莉莉亞麻基因克隆及鹽堿脅迫下的表達分析東北農業(yè)大學學報，（）：，，：，（）：，，，，，（）：，，（）：郭言言南瓜抗白粉病相關基因的分離及功能研究新鄉(xiāng) ：河南科技學院，，，，，（，，；，）：，（），，，，，，，，：；；北方園藝月（下）