對(duì)番茄枯萎病具防效的海洋源赤桿菌YH-07的發(fā)酵條件探究.pdf

34(5)753-761 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2018 年 10 月 收稿日期： 2018-02-01 基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（ 2017YFD0200604） ；國(guó)家自然科學(xué)基金（ 31400464） 作者簡(jiǎn)介：唐彤彤，博士研究生， E-mail： tttangissas.ac.cn； *通信作者，研究員， E-mail： qliuissas.ac.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.05.015 對(duì)番茄枯萎病具防效的海洋源赤桿菌 YH-07的發(fā)酵條件探究 唐彤彤1,2，孫 星3，董元華1,2，劉 勤1,2* （ 1. 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049； 3. 滁州學(xué)院，滁州 239000） 摘要 ： 一株分離自連云港海域的赤桿菌 Erythrobacter sp. YH-07 對(duì)番茄枯萎病病原菌有較好的平板抑菌效果。通過(guò)單因子水平試驗(yàn)、正交試驗(yàn)對(duì)該菌株的培養(yǎng)基配方及搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為酵母浸膏 0.25%、蔗糖 1%、蛋白胨 1%、 NaCl 3%和 MgSO4·7H2O 0.03%；最優(yōu)發(fā)酵條件組合為培養(yǎng)溫度30 ， 140 r/min 搖床培養(yǎng)，接種量 1%，裝液量 50 mL/250 mL，初始 pH 7.0。優(yōu)化后的平板抑菌能力提高了 9.4%。溫室盆栽試驗(yàn)表明，赤桿菌 YH-07 對(duì)番茄枯萎病有顯著抑制作用，防治效果保持在 50%以上。同時(shí)顯著降低番茄根際土的真菌數(shù)量，增加細(xì)菌和放線菌數(shù)量。綜上所述，赤桿菌 YH-07 能有效防治番茄枯萎病害，改善根際微生物數(shù)量結(jié)構(gòu)，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用的前景。 關(guān) 鍵 詞： 赤桿菌；番茄枯萎??；發(fā)酵條件優(yōu)化；拮抗作用；生防效果 中圖分類(lèi)號(hào)： S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1005-9261(2018)05-0753-09 Optimization of Fermentation Conditions for Erythrobacter sp. YH-07 Suppressing Fusarium Wilt of Tomato TANG Tongtong1,2, SUN Xing3, DONG Yuanhua1,2, LIU Qin1,2* (1. Institute of Soil Science, Chinese Academy of Science, Nanjing 210008, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Chuzhou University, Chuzhou 239000, China) Abstract: A marine bacteria Erythrobacter sp. YH-07 with high biocontrol activity against Fusarium oxysporum was isolated from Lianyungang beach. We used single factor experiments and orthogonal experiments to investigate the best condition for fermentation of strain YH-07. The best composition of the medium was 0.25% (W/V) yeast extract, 1% (W/V) source, 1% (W/V) tryptone, 3% (W/V) NaCl and 0.03% (W/V) MgSO4·7H2O. The optimal fermentation conditions were the combination of temperature 30 , initial pH7.0, 140 r/min, 1% inoculums volume percentage and medium volume 50 mL/250 mL. Under the optimum fermentation medium and culture conditions, the inhibitory rate of strain YH-07 was 9.4% higher than before. Pot experiments indicated that H7+R treatment could significantly lower the incidence rate of Fusarium wilt disease up to 50%, increase the total number of bacteria and actinomycetes, and decrease the number of fungi in rhizosphere soil. Strain YH-07 can effectively control Fusarium wilt of tomato and improve microbial community structure in rhizosphere, and it has potential development and application prospect. Key words: Erythrobacter sp.; tomato Fusarium wilt; optimization of fermentation condition; antagonism; biocontrol efficiency 番茄枯萎病的病原菌是尖孢鐮刀菌番茄轉(zhuǎn)化型 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Snyder et Hansen，病菌多在分苗、定植時(shí)從根系傷口、自然裂口、根毛侵入，到達(dá)維管束，在維管束內(nèi)繁殖，堵塞導(dǎo)管，阻 754 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 礙植株吸水吸肥，導(dǎo)致葉片萎蔫、枯死1。針對(duì)番茄枯萎病的防治采用高溫悶棚的措施，效果并不理想，連作障礙發(fā)生依然嚴(yán)重；化學(xué)藥劑的大量使用會(huì)污染土壤和水體等自然環(huán)境，并對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成危害2-4，而且病原菌會(huì)產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致防效降低。因此，研發(fā)高效、綠色、安全的防治番茄枯萎病的方法顯得尤為重要。生物防治因其對(duì)人畜無(wú)害、環(huán)境友好等特點(diǎn)，成為行之有效的防治方法，已被各國(guó)廣泛采用5,6。運(yùn)用生防細(xì)菌防治番茄枯萎病害已有大量報(bào)道，如劉郵洲等7從作物根際土壤中獲得一株解淀粉芽胞桿菌B1619，對(duì)番茄枯萎病菌有很強(qiáng)的抑制作用；崔萍8以番茄枯萎病病原菌為靶標(biāo)菌，從山地土壤中篩選出多株對(duì)病原菌有很強(qiáng)拮抗作用的真菌菌株； 詹發(fā)強(qiáng)等9通過(guò)盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生防菌 S-13 對(duì)番茄枯萎病的防效在 90%以上。 目前應(yīng)用于番茄枯萎病防治的生防菌主要包括芽胞桿菌 Bacillus spp.和假單胞菌 Pesudomonas spp.等10，且大部分生防菌株都是從土壤或植物根際分離所得，從海洋中篩選生防菌用于番茄枯萎病害的防治較少，而且越來(lái)越多的研究表明許多具有開(kāi)發(fā)前景的抑菌活性物質(zhì)是由海洋微生物產(chǎn)生的11。 本研究以番茄枯萎病菌 F. oxysporum 為指示菌，從連云港海域篩選出一株對(duì)其有抑制作用的海洋細(xì)菌YH-07，經(jīng)鑒定為赤桿菌 Erythrobacter sp.。平板對(duì)峙試驗(yàn)顯示菌株 YH-07 能抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)，為了提高菌株的抗菌能力通過(guò)單因素篩選和正交試驗(yàn)對(duì)菌株 YH-07 的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。并通過(guò)溫室盆栽試驗(yàn)探究 YH-07 對(duì)番茄枯萎病的防治效果以及對(duì)根際土壤微生物數(shù)量的影響，研究結(jié)果證實(shí)生防菌 YH-07 在防治番茄枯萎病方面具有潛在的研究?jī)r(jià)值。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料 1.1.1 供試菌株 赤桿菌 YH-07 分離自連云港東西連島海泥樣品，由本實(shí)驗(yàn)室保存；尖孢鐮刀菌 F. oxysporum 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。 1.1.2 培養(yǎng)基 海洋細(xì)菌 2216E 培養(yǎng)基參照 Sun 等12的方法配置；番茄枯萎病用 PDA 培養(yǎng)基、細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、放線菌用高氏一號(hào)培養(yǎng)基、真菌用馬丁氏培養(yǎng)基均參照文獻(xiàn) 13配制。 1.1.3 供試作物 番茄盆栽試驗(yàn)品種為“浙粉 202”（浙江省杭州市）。 1.1.4 供試土壤 從江蘇省蔬菜與花卉研究所采集，裝盆前風(fēng)干，過(guò) 2 mm 篩。 1.2 方法 1.2.1 菌株 YH-07 的分離和篩選 于 2016 年 3 月在連云港連島采集海泥樣品 ， 4 保存?zhèn)溆谩⒉杉暮Ｄ嘤蒙睇}水稀釋 10 倍后，吸取 100 L 在 2216E 培養(yǎng)基上均勻涂布， 28 培養(yǎng) 48 h。分別挑取顏色、形狀、大小不同的菌落劃線純化。采用平板對(duì)峙法7，將番茄枯萎病接入到 PDA 中央，同時(shí)將拮抗菌點(diǎn)接在距離平板中心 2.5 cm 處， 28 恒溫培養(yǎng) 48 h，篩選出抑菌作用最強(qiáng)的拮抗菌。 1.2.2 培養(yǎng)基的單因素篩選 以 2216E 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的篩選研究 YH-07 的最佳培養(yǎng)基。氮源：分別以有機(jī)氮源（牛肉浸膏、酵母粉、蛋白胨）和無(wú)機(jī)氮源（硫酸銨、硝酸銨和尿素）替代 2216E 培養(yǎng)基中的氮源，不加氮源為對(duì)照，重復(fù) 3 次。碳源：分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉替代 2216E 培養(yǎng)基中的碳源，以不加碳源為對(duì)照，重復(fù) 3 次。無(wú)機(jī)鹽：分別用 NaCl、 K2HPO4、 MgSO4·7H2O、 CaCl2、 FeSO4·7H2O、 MnCl2、 ZnSO4、 CoCl2和 CuSO4·5H2O 替代 2216E培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽，以不加無(wú)機(jī)鹽為對(duì)照，重復(fù) 3 次。以上試驗(yàn)溫度 28 、 150 r/min 培養(yǎng) 24 h。按 1.2.2的方法測(cè)定菌株 YH-07 的抑菌活性。 1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以上述單因子篩選的基礎(chǔ)上以蔗糖、酵母粉、蛋白胨、 NaCl、 MgSO4·7H2O 為考察因素，按正交設(shè)計(jì)表 L16(45)設(shè)計(jì) 5 個(gè)因素、 4 個(gè)水平的正交試驗(yàn)（表 1），以確定最適配比。 1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化 采用最適培養(yǎng)基配方，依次進(jìn)行以下條件的優(yōu)化，每次都將上一優(yōu)化結(jié)果應(yīng)用于下一因素的優(yōu)化。溫度： 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40 ；接種量：以最佳裝液量的 0.05%、 0.1%、0.25%、 0.5%、 1%、 5%；裝液量： 30、 50、 70、 90、 110、 130、 150 mL/250 mL；轉(zhuǎn)速： 50、 80、 100、 120、150、 180、 200 r/min；初始 pH 分別為 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10。每個(gè)處理 3 次重復(fù)，按 1.2.3 的方法測(cè)定菌株 YH-07 的抗菌活性。 第 5 期 唐彤彤等：對(duì)番茄枯萎病具防效的海洋源赤桿菌 YH-07 的發(fā)酵條件探究 755 1.2.5 優(yōu)化前后抑菌效果比較 用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件（蛋白胨 1%，酵母粉 0.25%，蔗糖 1%， NaCl 3%，MgSO4·7H2O 0.03%， pH 7.0，裝液量 50 mL/250 mL，接種量 1%，溫度 30 ，轉(zhuǎn)速 140 r/min 搖瓶發(fā)酵24 h）對(duì)菌株 YH-07 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。吸取 200 L 發(fā)酵液至 PDA 培養(yǎng)基上，用無(wú)菌涂布棒均勻涂布，隨后在 PDA 培養(yǎng)基中央接種番茄枯萎病菌餅（ 5 mm）。置于 28 恒溫培養(yǎng)， 48 h 后測(cè)算菌落直徑及抑菌率（ %）(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑× 100，以使用 2216E 培養(yǎng)基在原始培養(yǎng)條件下的抑菌率為對(duì)照，重復(fù) 3 次。 1.2.6 盆栽防效試驗(yàn) 番茄種子經(jīng)消毒后，置于 25 恒溫培養(yǎng)箱中催芽。 72 h 后選取發(fā)芽一致的種子播種于溫室內(nèi)裝有 1000 g 供試土的塑料盆( 15 cm× 12 cm× 14 cm)中，每盆 2 粒。播種后每盆澆灌 50 mL 番茄營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液配方為 Ca(NO3)2·4H2O 886 mg/L、 KNO3303 mg/L、 KH2PO4204 mg/L、 MgSO4·7H2O 247 mg/L、(NH4)2SO433 mg/L 和 K2SO4218 mg/L。 菌株 YH-07 懸液的制備及接種：將制備好的菌株 YH-07 發(fā)酵液用生理鹽水稀釋成 108CFU/mL 的菌懸液，待番茄幼苗長(zhǎng)至一葉一心時(shí)灌根接種 20 mL；病原菌孢子懸浮液的制備及接種：將枯萎病病原菌接種到裝有 50 mL PDA 液體培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶中， 28 、 180 r/min 振蕩培養(yǎng)一周，無(wú)菌紗布過(guò)濾所得菌液后， 用無(wú)菌水稀釋成濃度為 108CFU/mL 的孢子懸浮液， 待番茄幼苗長(zhǎng)至一葉一心時(shí)灌根接種 20 mL。 試驗(yàn)設(shè) 4 個(gè)處理：只接種菌株 YH-07 孢子懸浮液（ YH-07）；同時(shí)接種菌株 YH-07 孢子懸浮液和病原菌孢子懸浮液（ H7 R）；只接種病原菌孢子懸浮液（ R）；清水對(duì)照（ CK）。每處理 10 盆，隨機(jī)排列。 1.2.7 發(fā)病調(diào)查 分別在播種后第 15 和 45 d 調(diào)查和記錄各個(gè)處理番茄的病株數(shù)、發(fā)病癥狀，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果14。 1.2.8 番茄盆栽中根際土壤微生物數(shù)量變化 番茄盆栽種植一個(gè)月后，每個(gè)處理隨機(jī)采集 5 株植株根際土，混勻后裝入自封袋，于 4 保存。采用稀釋平板法15，對(duì)番茄根際土中的細(xì)菌、放線菌、真菌進(jìn)行數(shù)量分析。 1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用 Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和繪圖； 采用 SPSS 17.0 中的 Dunnett 多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，正交試驗(yàn)極差分析采用直觀分析法。 2 結(jié)果與討論 2.1 菌株 YH-07 的分離和篩選 通過(guò)稀釋平板涂布、劃線法分離得到不同顏色、大小的菌株，采用對(duì)峙法篩選得到了一株對(duì)番茄枯萎病菌有抑制效果，菌株 YH-07 的抑菌率達(dá) 65.4%（圖 1），以菌株 YH-07 為拮抗菌株進(jìn)行下一步研究。 圖 1 菌株 YH-07 的平板抑菌效果及其形態(tài)特征 Fig. 1 The antimicrobial effect and morphological characteristics of strain YH-07 2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 2.2.1 氮源的優(yōu)化 有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌株 YH-07 的抗菌活性影響差異顯著，硫酸銨、硝酸銨、尿素的加入使菌株抑菌率較對(duì)照顯著降低，說(shuō)明無(wú)機(jī)氮不利于菌株抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生；而以有機(jī)氮為氮源時(shí)，抑菌率明顯高于對(duì)照。其中，蛋白胨、酵母粉為氮源時(shí)，抑菌率均達(dá) 64%以上（圖 2）。因此，選用蛋白胨、酵母粉作為最佳氮源。 756 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 抑菌率Inhibitive rate (%)圖 2 不同氮源發(fā)酵液的抑菌活性 Fig. 2 The inhibitive rate of fermentation broth using different nitrogen sources 2.2.2 碳源的優(yōu)化 不同碳源的加入，菌株 YH-07 的抗菌活性有明顯差異，但都顯著高于對(duì)照組。其中，蔗糖為碳源時(shí)抑菌率達(dá) 67.4%；其次為麥芽糖，抑菌率為 64.2%（圖 3）。由此可見(jiàn)，蔗糖是碳源的最佳選擇。 5052545658606264666870可溶性淀粉Soluble starch乳糖Lactose葡萄糖Glucose蔗糖Sucrose麥芽糖MaltoseCK碳源 Carbon sources抑菌率Inhibitive rate(%)accbde圖 3 不同碳源發(fā)酵液的抑菌活性 Fig. 3 The inhibitive rate of fermentation broth using different carbon sources 2.2.3 無(wú)機(jī)鹽篩選 在只含蛋白胨和蔗糖的培養(yǎng)基中，分別加入不同無(wú)機(jī)鹽，菌株 YH-07 的抑菌結(jié)果表明，只有在添加 NaCl、 MgSO4·7H2O 為無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，菌株 YH-07 抑菌率較對(duì)照顯著升高，分別為68.9%和 68.1%，其他無(wú)機(jī)鹽的加入使 YH-07 的抑菌率較對(duì)照顯著降低（圖 4）。 505560657075無(wú)機(jī)鹽 SaltsaabcdefK2HPO4MgSO4·7H2O NaCl CaCl2FeSO4·7H2OMnCl2CK圖 4 不同無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵液的抑菌活性 Fig. 4 The inhibitive rate of fermentation broth using different inorganic salts 第 5 期 唐彤彤等：對(duì)番茄枯萎病具防效的海洋源赤桿菌 YH-07 的發(fā)酵條件探究 757 2.2.4 正交試驗(yàn) 11 號(hào)培養(yǎng)基表現(xiàn)出最佳的抗菌活性，抑菌率為 74.3%；抑菌活性最差的培養(yǎng)基是 1 號(hào)，抑菌率 68.4%（表 1）。 1 號(hào)培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)成分含量較低，不能滿足菌株繁殖所需，表明抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)有一定的需求。 由表 2 中極差 R 值可看出， 培養(yǎng)基中 5 種組分對(duì)抑菌率影響力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篈（蛋白胨） B（酵母粉） D（ NaCl） C（蔗糖） E（ MgSO4·7H2O）。由 K 值可知，隨著營(yíng)養(yǎng)成分含量的升高，菌株的抑菌率呈先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度過(guò)大反而限制菌株產(chǎn)活性物質(zhì)的能力（表 2）。最終確定培養(yǎng)基的最佳組合為 A3B3C3D3E1，即蛋白胨 1%，酵母粉 0.25%，蔗糖 1%， NaCl 3%， MgSO4·7H2O 0.03%。 表 1 培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)結(jié)果 Table 1 Results of the medium orthogonal experiment A B C D E 處理 Treatment 蛋白胨 Tryptone 酵母粉 Yeast extract 蔗糖 Sucrose NaCl MgSO4·7H2O 抑菌率 Inhibitive rate (%) 1 1（ 0.1%） 1（ 0.05%） 1（ 0.1%） 1（ 1%） 1（ 0.03%） 68.4 2 1（ 0.1%） 2（ 0.1%） 2（ 0.5%） 2（ 2%） 2（ 0.05%） 69.9 3 1（ 0.1%） 3（ 0.25%） 3（ 1%） 3（ 3%） 3（ 0.07%） 73.9 4 1（ 0.1%） 4（ 0.5%） 4（ 2%） 4（ 4%） 4（ 0.09%） 69.7 5 2（ 0.5%） 1（ 0.05%） 3（ 1%） 2（ 2%） 4（ 0.09%） 70.9 6 2（ 0.5%） 2（ 0.1%） 4（ 2%） 1（ 1%） 3（ 0.07%） 70.6 7 2（ 0.5%） 3（ 0.25%） 1（ 0.1%） 4（ 4%） 2（ 0.05%） 73.4 8 2（ 0.5%） 4（ 0.5%） 2（ 0.5%） 3（ 3%） 1（ 0.03%） 74.0 9 3（ 1%） 1（ 0.05%） 4（ 2%） （ 3%） 2（ 0.05%） 72.8 10 3（ 1%） 2（ 0.1%） 3（ 1%） 4（ 4%） 1（ 0.03%） 74.0 11 3（ 1%） 3（ 0.25%） 2（ 0.5%） 1（ 1%） 4（ 0.09%） 74.3 12 3（ 1%） 4（ 0.5%） 1（ 0.1%） 2（ 2%） 3（ 0.07%） 72.6 13 4（ 2%） 1（ 0.05%） 2（ 0.5%） 4（ 4%） 3（ 0.07%） 71.3 14 4（ 2%） 2（ 0.1%） 1（ 0.1%） 3（ 3%） 4（ 0.09%） 71.7 15 4（ 2%） 3（ 0.25%） 4（ 2%） 2（ 2%） 1（ 0.03%） 72.7 16 4（ 2%） 4（ 0.5%） 3（ 1%） 1（ 1%） 2（ 0.05%） 71.9 表 2 正交試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果 Table 2 The evaluation result of orthogonal experiment A B C D E K1 281.9 283.4 286.1 285.2 289.1 K2 288.9 286.2 289.5 286.1 288 K3 293.7 294.3 290.7 292.4 288.4 K4 287.6 288.2 285.8 288.4 286.6 k1 70.5 70.9 71.5 71.3 72.3 k2 72.2 71.6 72.4 71.5 72.0 k3 73.4 73.6 72.7 73.1 72.1 k4 71.9 72.1 71.5 72.1 71.7 R 2.9 2.7 1.2 1.8 0.4 抑菌率 Inhibitive rate (%) A B D C E 2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化 2.3.1 溫度的優(yōu)化 菌株 YH-07 在 10 50 均能產(chǎn)生抑菌活性，由圖 5 可知， 30 以下，抑菌活性隨溫度升高而增加，在 30 時(shí)抑菌率達(dá)到峰值，為 68.2%，之后隨溫度的升高而下降。因此，選擇 30 為最適溫度，進(jìn)行以下的優(yōu)化。 758 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 2.3.2 接種量的優(yōu)化 當(dāng)接種量低于 0.1%時(shí)，菌株的生長(zhǎng)受到限制，抑菌率也受到影響。菌株 YH-07 的抑菌率在接種量為 1%時(shí)達(dá)到最高，之后接種量增加，抑菌率變化不大（圖 6）。考慮到經(jīng)濟(jì)性，選擇最適接種量為 1% 。 2.3.3 裝液量的優(yōu)化 當(dāng)裝液量為 50 mL/250 mL 時(shí)，菌株 YH-07 的抑菌率最高，為 67.8%。但當(dāng)裝液量繼續(xù)增加時(shí)，菌株 YH-07 抑菌率反而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（圖 7）。因此，選擇 50 mL/250 mL 為最佳裝液量。 2.3.4 轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速在 50 200 r/min 時(shí)，菌株 YH-07 的抑菌率隨轉(zhuǎn)速的增加呈先升高后下降的趨勢(shì)，在轉(zhuǎn)速為 180 r/min 時(shí)，菌株 YH-07 的抑菌率最高，為 62.4%（圖 8）。 抑菌率Inhibitive rate(%)圖 5 溫度對(duì)菌株 YH-07 抑菌率的影響 Fig. 5 Effects of temperature on inhibitive rate of strain YH-07 0102030405060708020 30 50 70 90 110 130 150裝液量 Medium capacity (mL/250mL)圖 7 裝液量對(duì)菌株 YH-07 抑菌率的影響 Fig. 7 Effects of medium capacity on inhibitive rate of strain YH-07 2.3.5 初始 pH 的優(yōu)化 菌株 YH-07 對(duì) pH 的適應(yīng)性較寬。當(dāng) pH 高于 5.0 后， YH-07 的抑菌率顯著提升，在 pH 為 7.0 時(shí)，抑菌率最高，為 66.7%。之后隨著 pH 升高， 抑菌率又呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì) （圖 9） 。 2.4 優(yōu)化培養(yǎng)條件與原始條件比較 采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件 24 h 發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌率達(dá) 86.7%，相較優(yōu)化前抑菌率提高了9.4%， 說(shuō)明優(yōu)化后的培養(yǎng)條件更有利于菌株 YH-07產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)（圖 10）。 2.5 菌株 YH-07 對(duì)番茄枯萎病的防治作用 接種生防菌的番茄（ YH-07、 H7 R）發(fā)病率明顯低于未接種生防菌的處理（ R、 CK）。在接種 15 d -10010203040506070800.05 0.10 0.25 0.50 1.00 2.00 4.00接種量 Inoculum (%)圖 6 接種量對(duì)菌株 YH-07 抑菌率的影響 Fig. 6 Effects of inoculum on inhibitive rate of strain YH-07 0102030405060708050 80 100 120 150 180 200轉(zhuǎn)速 Rotational speed (r/min)抑菌率Inhibitive rate (%)圖 8 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株 YH-07 抑菌率的影響 Fig. 8 Effects of rotational speed on inhibitive rate of strain YH-07 01020304050607080345678910pH圖 9 初始 pH 對(duì)菌株 YH-07 抑菌率的影響 Fig. 9 Effects of pH on inhibitive rate of YH-07 strain 第 5 期 唐彤彤等：對(duì)番茄枯萎病具防效的海洋源赤桿菌 YH-07 的發(fā)酵條件探究 759 A：優(yōu)化發(fā)酵條件 Optimized fermentation condition； B：原始發(fā)酵條件 Original fermentation condition； C： CK 圖 10 優(yōu)化培養(yǎng)條件和原始培養(yǎng)條件抑菌能力對(duì)比 Fig. 10 Comparison of inhibitory effect under optimized fermentation condition and original fermentation condition 后，對(duì)番茄枯萎病的防治效果為 51.06%。隨著種植天數(shù)的增加，番茄的病情指數(shù)也不斷增加，但接種過(guò)生防菌 YH-07 的處理（ YH-07、 H7 R）病情指數(shù)上升幅度最小，均顯著低于 CK 的病情指數(shù)。在種植 45 d后，同時(shí)接種拮抗菌和致病菌（ H7 R）對(duì)枯萎病的防效為 53.13%，保持著較好的效果，表明接入 YH-07可減輕番茄枯萎病的發(fā)生（表 3）。 表 3 不同處理對(duì)番茄枯萎病的防治效果 Table 3 Effect of different treatments on Fusarium wilt of tomato 15 d 45 d 處理方式 Treatment 發(fā)病率 Incidence (%) 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control efficiency (%)發(fā)病率 Incidence (%) 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control efficiency (%)YH-07 20.39± 1.96 d 11.06± 1.07 d - 22.36± 2.92 c 12.64± 1.47 d - H7 R 28.06± 1.75 b 19.33± 1.81 b 51.06± 1.43 33.62± 2.53 c 28.51± 0.33 c 53.13± 1.03 R 47.33± 1.56 a 39.50± 1.64 a - 68.89± 0.99 a 60.83± 2.79 a - CK 23.33± 1.37 c 13.83± 2.31 c - 55.69± 1.96 b 47.76± 1.03 b - 注： YH-07，只接種生防菌處理； H7 R，同時(shí)接種生防菌和病原菌處理； R，只接種病原菌處理； CK，清水對(duì)照。表中字母表示在 P 0.05水平上差異顯著。下同。 Note: YH-07, suspension of the antagonist treatment; H7 R, suspension of antagonist and pathogen treatment; R, spore suspension of the pathogen treatment; CK, water treatment. The letters in the table indicated significant difference at the P 0.05 level. The same below. 2.6 菌株 YH-07 對(duì)盆栽番茄根際微生物的影響 生防菌 YH-07 對(duì)根際微生物數(shù)量有顯著影響，隨著種植天數(shù)的增加，生防菌處理（ YH-07、 H7 R）的根際真菌數(shù)量減少了 26.9%和 28.8%，而細(xì)菌數(shù)量分別增加了 46.8%和 40.5%，放線菌數(shù)量分別增加了8.1%和 26.2%（表 4）。 表 4 不同處理對(duì)番茄根際土壤微生物的影響 Table 4 Effect of different treatments on the density of microorganisms in rhizosphere 時(shí)間 Time 處理方式 Treatment 細(xì)菌數(shù) Number of bacteria (106CFU/g) 放線菌數(shù) Number of actinomycetes (104CFU/g)真菌數(shù) Number of fungi (105CFU/g) YH-07 1.71± 0.95 a 5.09± 0.35 a 1.77± 1.12 c H7 R 1.53± 0.82 ab 3.43± 0.46 c 2.85± 0.53 b R 1.48± 0.75 b 2.67± 1.10 d 5.48± 1.22 a 15 d CK 1.63± 0.56 ab 4.47± 0.82 b 1.19± 0.76 c YH-07 2.51± 0.31 a 5.50± 0.53 a 1.31± 1.21 bc H7 R 2.15± 0.36 b 4.33± 0.27 b 2.03± 0.85 b R 1.67± 0.75 c 2.48± 0.98 d 6.41± 0.84 a 45 d CK 1.74± 0.63 c 3.66± 1.02 c 2.57± 0.84 bc 760 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 3 討論 海洋源微生物具有耐鹽、耐酸堿、耐高溫、耐貧瘠等特點(diǎn)，相比陸地微生物，能產(chǎn)生新穎的活性物質(zhì)16-18，海洋微生物作為重要的生防資源， 具有廣闊的應(yīng)用前景。 國(guó)內(nèi)外利用海洋微生物進(jìn)行生物防治的報(bào)道較多，Tareq 等19報(bào)道了從海洋芽胞桿菌 Bacillus subtilis 中分離出的 3 種新型線性脂肽化合物，其對(duì)尖孢炭疽病菌、水稻紋枯病菌及番茄灰霉病菌等病原性真菌顯示出良好的抑菌活性； Trischman 等20從加利福尼亞海灣中分離出了 13 株細(xì)菌，其中 2 株革蘭氏陽(yáng)性菌能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)； Yoshikawa 等21發(fā)現(xiàn)從海藻表面分離篩選到弧菌 C-979，其培養(yǎng)液對(duì)一些藍(lán)細(xì)菌生長(zhǎng)有抑制作用。李偉等22從南海中分離出對(duì)黃瓜枯萎病菌有強(qiáng)抑制效果的枯草芽胞桿菌 3512A，田間防治效果達(dá)到 70%以上。赤桿菌作為一類(lèi)重要的海洋源微生物，在全球海洋碳循環(huán)和能量代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，在環(huán)境修復(fù)23,24、食品工程25和生物醫(yī)學(xué)26,27等領(lǐng)域也具有應(yīng)用價(jià)值。 本實(shí)驗(yàn)室在連云港海域采集的海泥樣本中篩得了一株海洋源細(xì)菌赤桿菌 YH-07，室內(nèi)平板試驗(yàn)中，YH-07 對(duì)番茄枯萎病具有較強(qiáng)的抑制作用。不同培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵條件可顯著影響菌株代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率28,29。為了進(jìn)一步提高該菌株抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化得到最有利于 YH-07產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)基配方： 蛋白胨 1%， 酵母粉 0.25%， 蔗糖 1%， NaCl 3%， MgSO4·7H2O 0.03%。并進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化， 得到最佳培養(yǎng)條件為溫度 30 、 接種量 1%、 裝液量 50 mL/250 mL、 轉(zhuǎn)速 140 r/min、pH 7.0。菌株 YH-07 在發(fā)酵條件優(yōu)化后的抑菌活性比優(yōu)化前提高了 9.4%。值得一提的是該菌株的耐鹽性極高，推測(cè)將該菌株應(yīng)用于存在鹽漬化問(wèn)題的設(shè)施土傳病害的防治中會(huì)有較好的生防效果，本研究也會(huì)在接下來(lái)的試驗(yàn)中對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證。 試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，經(jīng) YH-07 發(fā)酵液處理的番茄根際土中細(xì)菌和放線菌數(shù)量顯著增加。細(xì)菌是土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要?jiǎng)恿?，在土壤中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。放線菌能產(chǎn)生抗生素或其他激素類(lèi)物質(zhì)，有利于抑制病原菌的生長(zhǎng)。土壤微生物組成在一定程度上會(huì)對(duì)植物病害的發(fā)生和為害程度產(chǎn)生影響， Jancvier 等30的研究表明，微生物的密度與土壤抑制病原菌的能力呈正相關(guān)； Peng 等31發(fā)現(xiàn)細(xì)菌密度的增加能夠顯著抑制土壤中香蕉枯萎病 F. oxysporum f. sp. cubense。本研究中的拮抗細(xì)菌 YH-07 盆栽生防效果尚可，說(shuō)明生防菌 YH-07 能夠通過(guò)影響土壤微生物的組成、抑制病原真菌的生長(zhǎng)從而降低植物發(fā)病率。 綜上所述，赤桿菌 YH-07 作為生防菌對(duì)番茄枯萎病有良好的防治效果，具有在番茄生產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值。我們也將在后續(xù)的試驗(yàn)中繼續(xù)對(duì)生防菌在植株體內(nèi)不同部位的定殖動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，并研究其與植株的防御基因表達(dá)、酶活性變化等植物誘導(dǎo)抗性的相關(guān)關(guān)系，從而全面揭示赤桿菌 YH-07 對(duì)番茄枯萎病的防治機(jī)制。 參 考 文 獻(xiàn) 1 Ajilogba C F, Babalola O O. Integrated management strategies for tomato Fusarium wiltJ. Biocontrol Science, 2013, 18(3): 117-127. 2 葛曉穎 , 孫志剛 , 李濤 , 等 . 設(shè)施番茄連作障礙與土壤芽胞桿菌和假單胞菌及微生物群落的關(guān)系分析 J. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào) , 2016, 35(3): 514-523. 3 徐艷輝 , 李燁 , 許向陽(yáng) . 番茄枯萎病的研究進(jìn)展 J. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) , 2008, 39(11): 128-134. 4 Weller D M, Raaijmakers J M, Gardener B B M, et al. Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogensJ. Annual Review of Phytopathology, 2002, 40(1): 309-348. 5 Knox O, Killham K, Leifert C. Effects of increased nitrate availability on the control of plant pathogenic fungi by the soil bacterium Bacillu