對番茄枯萎病具防效的海洋源赤桿菌YH-07的發(fā)酵條件探究.pdf

34(5)753-761 中國生物防治學報 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 10 月 收稿日期： 2018-02-01 基金項目：國家重點研發(fā)計劃（ 2017YFD0200604） ；國家自然科學基金（ 31400464） 作者簡介：唐彤彤，博士研究生， E-mail： tttangissas.ac.cn； *通信作者，研究員， E-mail： qliuissas.ac.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.05.015 對番茄枯萎病具防效的海洋源赤桿菌 YH-07的發(fā)酵條件探究 唐彤彤1,2，孫 星3，董元華1,2，劉 勤1,2* （ 1. 中國科學院南京土壤研究所，南京 210008； 2. 中國科學院大學，北京 100049； 3. 滁州學院，滁州 239000） 摘要 ： 一株分離自連云港海域的赤桿菌 Erythrobacter sp. YH-07 對番茄枯萎病病原菌有較好的平板抑菌效果。通過單因子水平試驗、正交試驗對該菌株的培養(yǎng)基配方及搖瓶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為酵母浸膏 0.25%、蔗糖 1%、蛋白胨 1%、 NaCl 3%和 MgSO47H2O 0.03%；最優(yōu)發(fā)酵條件組合為培養(yǎng)溫度30 ， 140 r/min 搖床培養(yǎng)，接種量 1%，裝液量 50 mL/250 mL，初始 pH 7.0。優(yōu)化后的平板抑菌能力提高了 9.4%。溫室盆栽試驗表明，赤桿菌 YH-07 對番茄枯萎病有顯著抑制作用，防治效果保持在 50%以上。同時顯著降低番茄根際土的真菌數(shù)量，增加細菌和放線菌數(shù)量。綜上所述，赤桿菌 YH-07 能有效防治番茄枯萎病害，改善根際微生物數(shù)量結構，具有進一步開發(fā)應用的前景。 關 鍵 詞： 赤桿菌；番茄枯萎??；發(fā)酵條件優(yōu)化；拮抗作用；生防效果 中圖分類號： S476 文獻標識碼： A 文章編號： 1005-9261(2018)05-0753-09 Optimization of Fermentation Conditions for Erythrobacter sp. YH-07 Suppressing Fusarium Wilt of Tomato TANG Tongtong1,2, SUN Xing3, DONG Yuanhua1,2, LIU Qin1,2* (1. Institute of Soil Science, Chinese Academy of Science, Nanjing 210008, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Chuzhou University, Chuzhou 239000, China) Abstract: A marine bacteria Erythrobacter sp. YH-07 with high biocontrol activity against Fusarium oxysporum was isolated from Lianyungang beach. We used single factor experiments and orthogonal experiments to investigate the best condition for fermentation of strain YH-07. The best composition of the medium was 0.25% (W/V) yeast extract, 1% (W/V) source, 1% (W/V) tryptone, 3% (W/V) NaCl and 0.03% (W/V) MgSO47H2O. The optimal fermentation conditions were the combination of temperature 30 , initial pH7.0, 140 r/min, 1% inoculums volume percentage and medium volume 50 mL/250 mL. Under the optimum fermentation medium and culture conditions, the inhibitory rate of strain YH-07 was 9.4% higher than before. Pot experiments indicated that H7+R treatment could significantly lower the incidence rate of Fusarium wilt disease up to 50%, increase the total number of bacteria and actinomycetes, and decrease the number of fungi in rhizosphere soil. Strain YH-07 can effectively control Fusarium wilt of tomato and improve microbial community structure in rhizosphere, and it has potential development and application prospect. Key words: Erythrobacter sp.; tomato Fusarium wilt; optimization of fermentation condition; antagonism; biocontrol efficiency 番茄枯萎病的病原菌是尖孢鐮刀菌番茄轉化型 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Snyder et Hansen，病菌多在分苗、定植時從根系傷口、自然裂口、根毛侵入，到達維管束，在維管束內(nèi)繁殖，堵塞導管，阻 754 中 國 生 物 防 治 學 報 第 34 卷 礙植株吸水吸肥，導致葉片萎蔫、枯死1。針對番茄枯萎病的防治采用高溫悶棚的措施，效果并不理想，連作障礙發(fā)生依然嚴重；化學藥劑的大量使用會污染土壤和水體等自然環(huán)境，并對人類健康構成危害2-4，而且病原菌會產(chǎn)生耐藥性，導致防效降低。因此，研發(fā)高效、綠色、安全的防治番茄枯萎病的方法顯得尤為重要。生物防治因其對人畜無害、環(huán)境友好等特點，成為行之有效的防治方法，已被各國廣泛采用5,6。運用生防細菌防治番茄枯萎病害已有大量報道，如劉郵洲等7從作物根際土壤中獲得一株解淀粉芽胞桿菌B1619，對番茄枯萎病菌有很強的抑制作用；崔萍8以番茄枯萎病病原菌為靶標菌，從山地土壤中篩選出多株對病原菌有很強拮抗作用的真菌菌株； 詹發(fā)強等9通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)生防菌 S-13 對番茄枯萎病的防效在 90%以上。 目前應用于番茄枯萎病防治的生防菌主要包括芽胞桿菌 Bacillus spp.和假單胞菌 Pesudomonas spp.等10，且大部分生防菌株都是從土壤或植物根際分離所得，從海洋中篩選生防菌用于番茄枯萎病害的防治較少，而且越來越多的研究表明許多具有開發(fā)前景的抑菌活性物質(zhì)是由海洋微生物產(chǎn)生的11。 本研究以番茄枯萎病菌 F. oxysporum 為指示菌，從連云港海域篩選出一株對其有抑制作用的海洋細菌YH-07，經(jīng)鑒定為赤桿菌 Erythrobacter sp.。平板對峙試驗顯示菌株 YH-07 能抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長，為了提高菌株的抗菌能力通過單因素篩選和正交試驗對菌株 YH-07 的搖瓶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。并通過溫室盆栽試驗探究 YH-07 對番茄枯萎病的防治效果以及對根際土壤微生物數(shù)量的影響，研究結果證實生防菌 YH-07 在防治番茄枯萎病方面具有潛在的研究價值。 1 材料與方法 1.1 試驗材料 1.1.1 供試菌株 赤桿菌 YH-07 分離自連云港東西連島海泥樣品，由本實驗室保存；尖孢鐮刀菌 F. oxysporum 由南京農(nóng)業(yè)大學海洋生物學重點實驗室提供。 1.1.2 培養(yǎng)基 海洋細菌 2216E 培養(yǎng)基參照 Sun 等12的方法配置；番茄枯萎病用 PDA 培養(yǎng)基、細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、放線菌用高氏一號培養(yǎng)基、真菌用馬丁氏培養(yǎng)基均參照文獻 13配制。 1.1.3 供試作物 番茄盆栽試驗品種為“浙粉 202”（浙江省杭州市）。 1.1.4 供試土壤 從江蘇省蔬菜與花卉研究所采集，裝盆前風干，過 2 mm 篩。 1.2 方法 1.2.1 菌株 YH-07 的分離和篩選 于 2016 年 3 月在連云港連島采集海泥樣品 ， 4 保存?zhèn)溆?。將采集的海泥用生理鹽水稀釋 10 倍后，吸取 100 L 在 2216E 培養(yǎng)基上均勻涂布， 28 培養(yǎng) 48 h。分別挑取顏色、形狀、大小不同的菌落劃線純化。采用平板對峙法7，將番茄枯萎病接入到 PDA 中央，同時將拮抗菌點接在距離平板中心 2.5 cm 處， 28 恒溫培養(yǎng) 48 h，篩選出抑菌作用最強的拮抗菌。 1.2.2 培養(yǎng)基的單因素篩選 以 2216E 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在此基礎上通過對碳源、氮源、無機鹽的篩選研究 YH-07 的最佳培養(yǎng)基。氮源：分別以有機氮源（牛肉浸膏、酵母粉、蛋白胨）和無機氮源（硫酸銨、硝酸銨和尿素）替代 2216E 培養(yǎng)基中的氮源，不加氮源為對照，重復 3 次。碳源：分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉替代 2216E 培養(yǎng)基中的碳源，以不加碳源為對照，重復 3 次。無機鹽：分別用 NaCl、 K2HPO4、 MgSO47H2O、 CaCl2、 FeSO47H2O、 MnCl2、 ZnSO4、 CoCl2和 CuSO45H2O 替代 2216E培養(yǎng)基中的無機鹽，以不加無機鹽為對照，重復 3 次。以上試驗溫度 28 、 150 r/min 培養(yǎng) 24 h。按 1.2.2的方法測定菌株 YH-07 的抑菌活性。 1.2.3 正交試驗設計 以上述單因子篩選的基礎上以蔗糖、酵母粉、蛋白胨、 NaCl、 MgSO47H2O 為考察因素，按正交設計表 L16(45)設計 5 個因素、 4 個水平的正交試驗（表 1），以確定最適配比。 1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化 采用最適培養(yǎng)基配方，依次進行以下條件的優(yōu)化，每次都將上一優(yōu)化結果應用于下一因素的優(yōu)化。溫度： 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40 ；接種量：以最佳裝液量的 0.05%、 0.1%、0.25%、 0.5%、 1%、 5%；裝液量： 30、 50、 70、 90、 110、 130、 150 mL/250 mL；轉速： 50、 80、 100、 120、150、 180、 200 r/min；初始 pH 分別為 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10。每個處理 3 次重復，按 1.2.3 的方法測定菌株 YH-07 的抗菌活性。 第 5 期 唐彤彤等：對番茄枯萎病具防效的海洋源赤桿菌 YH-07 的發(fā)酵條件探究 755 1.2.5 優(yōu)化前后抑菌效果比較 用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件（蛋白胨 1%，酵母粉 0.25%，蔗糖 1%， NaCl 3%，MgSO47H2O 0.03%， pH 7.0，裝液量 50 mL/250 mL，接種量 1%，溫度 30 ，轉速 140 r/min 搖瓶發(fā)酵24 h）對菌株 YH-07 進行發(fā)酵培養(yǎng)。吸取 200 L 發(fā)酵液至 PDA 培養(yǎng)基上，用無菌涂布棒均勻涂布，隨后在 PDA 培養(yǎng)基中央接種番茄枯萎病菌餅（ 5 mm）。置于 28 恒溫培養(yǎng)， 48 h 后測算菌落直徑及抑菌率（ %）(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑 100，以使用 2216E 培養(yǎng)基在原始培養(yǎng)條件下的抑菌率為對照，重復 3 次。 1.2.6 盆栽防效試驗 番茄種子經(jīng)消毒后，置于 25 恒溫培養(yǎng)箱中催芽。 72 h 后選取發(fā)芽一致的種子播種于溫室內(nèi)裝有 1000 g 供試土的塑料盆( 15 cm 12 cm 14 cm)中，每盆 2 粒。播種后每盆澆灌 50 mL 番茄營養(yǎng)液，營養(yǎng)液配方為 Ca(NO3)24H2O 886 mg/L、 KNO3303 mg/L、 KH2PO4204 mg/L、 MgSO47H2O 247 mg/L、(NH4)2SO433 mg/L 和 K2SO4218 mg/L。 菌株 YH-07 懸液的制備及接種：將制備好的菌株 YH-07 發(fā)酵液用生理鹽水稀釋成 108CFU/mL 的菌懸液，待番茄幼苗長至一葉一心時灌根接種 20 mL；病原菌孢子懸浮液的制備及接種：將枯萎病病原菌接種到裝有 50 mL PDA 液體培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶中， 28 、 180 r/min 振蕩培養(yǎng)一周，無菌紗布過濾所得菌液后， 用無菌水稀釋成濃度為 108CFU/mL 的孢子懸浮液， 待番茄幼苗長至一葉一心時灌根接種 20 mL。 試驗設 4 個處理：只接種菌株 YH-07 孢子懸浮液（ YH-07）；同時接種菌株 YH-07 孢子懸浮液和病原菌孢子懸浮液（ H7 R）；只接種病原菌孢子懸浮液（ R）；清水對照（ CK）。每處理 10 盆，隨機排列。 1.2.7 發(fā)病調(diào)查 分別在播種后第 15 和 45 d 調(diào)查和記錄各個處理番茄的病株數(shù)、發(fā)病癥狀，計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果14。 1.2.8 番茄盆栽中根際土壤微生物數(shù)量變化 番茄盆栽種植一個月后，每個處理隨機采集 5 株植株根際土，混勻后裝入自封袋，于 4 保存。采用稀釋平板法15，對番茄根際土中的細菌、放線菌、真菌進行數(shù)量分析。 1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用 Excel 對數(shù)據(jù)進行整理和繪圖； 采用 SPSS 17.0 中的 Dunnett 多重比較法對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，正交試驗極差分析采用直觀分析法。 2 結果與討論 2.1 菌株 YH-07 的分離和篩選 通過稀釋平板涂布、劃線法分離得到不同顏色、大小的菌株，采用對峙法篩選得到了一株對番茄枯萎病菌有抑制效果，菌株 YH-07 的抑菌率達 65.4%（圖 1），以菌株 YH-07 為拮抗菌株進行下一步研究。 圖 1 菌株 YH-07 的平板抑菌效果及其形態(tài)特征 Fig. 1 The antimicrobial effect and morphological characteristics of strain YH-07 2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 2.2.1 氮源的優(yōu)化 有機氮源、無機氮源對菌株 YH-07 的抗菌活性影響差異顯著，硫酸銨、硝酸銨、尿素的加入使菌株抑菌率較對照顯著降低，說明無機氮不利于菌株抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生；而以有機氮為氮源時，抑菌率明顯高于對照。其中，蛋白胨、酵母粉為氮源時，抑菌率均達 64%以上（圖 2）。因此，選用蛋白胨、酵母粉作為最佳氮源。 756 中 國 生 物 防 治 學 報 第 34 卷 抑菌率Inhibitive rate (%)圖 2 不同氮源發(fā)酵液的抑菌活性 Fig. 2 The inhibitive rate of fermentation broth using different nitrogen sources 2.2.2 碳源的優(yōu)化 不同碳源的加入，菌株 YH-07 的抗菌活性有明顯差異，但都顯著高于對照組。其中，蔗糖為碳源時抑菌率達 67.4%；其次為麥芽糖，抑菌率為 64.2%（圖 3）。由此可見，蔗糖是碳源的最佳選擇。 5052545658606264666870可溶性淀粉Soluble starch乳糖Lactose葡萄糖Glucose蔗糖Sucrose麥芽糖MaltoseCK碳源 Carbon sources抑菌率Inhibitive rate(%)accbde圖 3 不同碳源發(fā)酵液的抑菌活性 Fig. 3 The inhibitive rate of fermentation broth using different carbon sources 2.2.3 無機鹽篩選 在只含蛋白胨和蔗糖的培養(yǎng)基中，分別加入不同無機鹽，菌株 YH-07 的抑菌結果表明，只有在添加 NaCl、 MgSO47H2O 為無機鹽的培養(yǎng)基中，菌株 YH-07 抑菌率較對照顯著升高，分別為68.9%和 68.1%，其他無機鹽的加入使 YH-07 的抑菌率較對照顯著降低（圖 4）。 505560657075無機鹽 SaltsaabcdefK2HPO4MgSO47H2O NaCl CaCl2FeSO47H2OMnCl2CK圖 4 不同無機鹽發(fā)酵液的抑菌活性 Fig. 4 The inhibitive rate of fermentation broth using different inorganic salts 第 5 期 唐彤彤等：對番茄枯萎病具防效的海洋源赤桿菌 YH-07 的發(fā)酵條件探究 757 2.2.4 正交試驗 11 號培養(yǎng)基表現(xiàn)出最佳的抗菌活性，抑菌率為 74.3%；抑菌活性最差的培養(yǎng)基是 1 號，抑菌率 68.4%（表 1）。 1 號培養(yǎng)基中各營養(yǎng)成分含量較低，不能滿足菌株繁殖所需，表明抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生對培養(yǎng)基營養(yǎng)有一定的需求。 由表 2 中極差 R 值可看出， 培養(yǎng)基中 5 種組分對抑菌率影響力的強弱順序為：A（蛋白胨） B（酵母粉） D（ NaCl） C（蔗糖） E（ MgSO47H2O）。由 K 值可知，隨著營養(yǎng)成分含量的升高，菌株的抑菌率呈先上升后下降的趨勢，說明營養(yǎng)物質(zhì)濃度過大反而限制菌株產(chǎn)活性物質(zhì)的能力（表 2）。最終確定培養(yǎng)基的最佳組合為 A3B3C3D3E1，即蛋白胨 1%，酵母粉 0.25%，蔗糖 1%， NaCl 3%， MgSO47H2O 0.03%。 表 1 培養(yǎng)基配方正交試驗結果 Table 1 Results of the medium orthogonal experiment A B C D E 處理 Treatment 蛋白胨 Tryptone 酵母粉 Yeast extract 蔗糖 Sucrose NaCl MgSO47H2O 抑菌率 Inhibitive rate (%) 1 1（ 0.1%） 1（ 0.05%） 1（ 0.1%） 1（ 1%） 1（ 0.03%） 68.4 2 1（ 0.1%） 2（ 0.1%） 2（ 0.5%） 2（ 2%） 2（ 0.05%） 69.9 3 1（ 0.1%） 3（ 0.25%） 3（ 1%） 3（ 3%） 3（ 0.07%） 73.9 4 1（ 0.1%） 4（ 0.5%） 4（ 2%） 4（ 4%） 4（ 0.09%） 69.7 5 2（ 0.5%） 1（ 0.05%） 3（ 1%） 2（ 2%） 4（ 0.09%） 70.9 6 2（ 0.5%） 2（ 0.1%） 4（ 2%） 1（ 1%） 3（ 0.07%） 70.6 7 2（ 0.5%） 3（ 0.25%） 1（ 0.1%） 4（ 4%） 2（ 0.05%） 73.4 8 2（ 0.5%） 4（ 0.5%） 2（ 0.5%） 3（ 3%） 1（ 0.03%） 74.0 9 3（ 1%） 1（ 0.05%） 4（ 2%） （ 3%） 2（ 0.05%） 72.8 10 3（ 1%） 2（ 0.1%） 3（ 1%） 4（ 4%） 1（ 0.03%） 74.0 11 3（ 1%） 3（ 0.25%） 2（ 0.5%） 1（ 1%） 4（ 0.09%） 74.3 12 3（ 1%） 4（ 0.5%） 1（ 0.1%） 2（ 2%） 3（ 0.07%） 72.6 13 4（ 2%） 1（ 0.05%） 2（ 0.5%） 4（ 4%） 3（ 0.07%） 71.3 14 4（ 2%） 2（ 0.1%） 1（ 0.1%） 3（ 3%） 4（ 0.09%） 71.7 15 4（ 2%） 3（ 0.25%） 4（ 2%） 2（ 2%） 1（ 0.03%） 72.7 16 4（ 2%） 4（ 0.5%） 3（ 1%） 1（ 1%） 2（ 0.05%） 71.9 表 2 正交試驗評價結果 Table 2 The evaluation result of orthogonal experiment A B C D E K1 281.9 283.4 286.1 285.2 289.1 K2 288.9 286.2 289.5 286.1 288 K3 293.7 294.3 290.7 292.4 288.4 K4 287.6 288.2 285.8 288.4 286.6 k1 70.5 70.9 71.5 71.3 72.3 k2 72.2 71.6 72.4 71.5 72.0 k3 73.4 73.6 72.7 73.1 72.1 k4 71.9 72.1 71.5 72.1 71.7 R 2.9 2.7 1.2 1.8 0.4 抑菌率 Inhibitive rate (%) A B D C E 2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化 2.3.1 溫度的優(yōu)化 菌株 YH-07 在 10 50 均能產(chǎn)生抑菌活性，由圖 5 可知， 30 以下，抑菌活性隨溫度升高而增加，在 30 時抑菌率達到峰值，為 68.2%，之后隨溫度的升高而下降。因此，選擇 30 為最適溫度，進行以下的優(yōu)化。 758 中 國 生 物 防 治 學 報 第 34 卷 2.3.2 接種量的優(yōu)化 當接種量低于 0.1%時，菌株的生長受到限制，抑菌率也受到影響。菌株 YH-07 的抑菌率在接種量為 1%時達到最高，之后接種量增加，抑菌率變化不大（圖 6）?？紤]到經(jīng)濟性，選擇最適接種量為 1% 。 2.3.3 裝液量的優(yōu)化 當裝液量為 50 mL/250 mL 時，菌株 YH-07 的抑菌率最高，為 67.8%。但當裝液量繼續(xù)增加時，菌株 YH-07 抑菌率反而呈現(xiàn)下降的趨勢（圖 7）。因此，選擇 50 mL/250 mL 為最佳裝液量。 2.3.4 轉速的優(yōu)化 當搖床轉速在 50 200 r/min 時，菌株 YH-07 的抑菌率隨轉速的增加呈先升高后下降的趨勢，在轉速為 180 r/min 時，菌株 YH-07 的抑菌率最高，為 62.4%（圖 8）。 抑菌率Inhibitive rate(%)圖 5 溫度對菌株 YH-07 抑菌率的影響 Fig. 5 Effects of temperature on inhibitive rate of strain YH-07 0102030405060708020 30 50 70 90 110 130 150裝液量 Medium capacity (mL/250mL)圖 7 裝液量對菌株 YH-07 抑菌率的影響 Fig. 7 Effects of medium capacity on inhibitive rate of strain YH-07 2.3.5 初始 pH 的優(yōu)化 菌株 YH-07 對 pH 的適應性較寬。當 pH 高于 5.0 后， YH-07 的抑菌率顯著提升，在 pH 為 7.0 時，抑菌率最高，為 66.7%。之后隨著 pH 升高， 抑菌率又呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢 （圖 9） 。 2.4 優(yōu)化培養(yǎng)條件與原始條件比較 采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件 24 h 發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌的抑菌率達 86.7%，相較優(yōu)化前抑菌率提高了9.4%， 說明優(yōu)化后的培養(yǎng)條件更有利于菌株 YH-07產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)（圖 10）。 2.5 菌株 YH-07 對番茄枯萎病的防治作用 接種生防菌的番茄（ YH-07、 H7 R）發(fā)病率明顯低于未接種生防菌的處理（ R、 CK）。在接種 15 d -10010203040506070800.05 0.10 0.25 0.50 1.00 2.00 4.00接種量 Inoculum (%)圖 6 接種量對菌株 YH-07 抑菌率的影響 Fig. 6 Effects of inoculum on inhibitive rate of strain YH-07 0102030405060708050 80 100 120 150 180 200轉速 Rotational speed (r/min)抑菌率Inhibitive rate (%)圖 8 轉速對菌株 YH-07 抑菌率的影響 Fig. 8 Effects of rotational speed on inhibitive rate of strain YH-07 01020304050607080345678910pH圖 9 初始 pH 對菌株 YH-07 抑菌率的影響 Fig. 9 Effects of pH on inhibitive rate of YH-07 strain 第 5 期 唐彤彤等：對番茄枯萎病具防效的海洋源赤桿菌 YH-07 的發(fā)酵條件探究 759 A：優(yōu)化發(fā)酵條件 Optimized fermentation condition； B：原始發(fā)酵條件 Original fermentation condition； C： CK 圖 10 優(yōu)化培養(yǎng)條件和原始培養(yǎng)條件抑菌能力對比 Fig. 10 Comparison of inhibitory effect under optimized fermentation condition and original fermentation condition 后，對番茄枯萎病的防治效果為 51.06%。隨著種植天數(shù)的增加，番茄的病情指數(shù)也不斷增加，但接種過生防菌 YH-07 的處理（ YH-07、 H7 R）病情指數(shù)上升幅度最小，均顯著低于 CK 的病情指數(shù)。在種植 45 d后，同時接種拮抗菌和致病菌（ H7 R）對枯萎病的防效為 53.13%，保持著較好的效果，表明接入 YH-07可減輕番茄枯萎病的發(fā)生（表 3）。 表 3 不同處理對番茄枯萎病的防治效果 Table 3 Effect of different treatments on Fusarium wilt of tomato 15 d 45 d 處理方式 Treatment 發(fā)病率 Incidence (%) 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control efficiency (%)發(fā)病率 Incidence (%) 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control efficiency (%)YH-07 20.39 1.96 d 11.06 1.07 d - 22.36 2.92 c 12.64 1.47 d - H7 R 28.06 1.75 b 19.33 1.81 b 51.06 1.43 33.62 2.53 c 28.51 0.33 c 53.13 1.03 R 47.33 1.56 a 39.50 1.64 a - 68.89 0.99 a 60.83 2.79 a - CK 23.33 1.37 c 13.83 2.31 c - 55.69 1.96 b 47.76 1.03 b - 注： YH-07，只接種生防菌處理； H7 R，同時接種生防菌和病原菌處理； R，只接種病原菌處理； CK，清水對照。表中字母表示在 P 0.05水平上差異顯著。下同。 Note: YH-07, suspension of the antagonist treatment; H7 R, suspension of antagonist and pathogen treatment; R, spore suspension of the pathogen treatment; CK, water treatment. The letters in the table indicated significant difference at the P 0.05 level. The same below. 2.6 菌株 YH-07 對盆栽番茄根際微生物的影響 生防菌 YH-07 對根際微生物數(shù)量有顯著影響，隨著種植天數(shù)的增加，生防菌處理（ YH-07、 H7 R）的根際真菌數(shù)量減少了 26.9%和 28.8%，而細菌數(shù)量分別增加了 46.8%和 40.5%，放線菌數(shù)量分別增加了8.1%和 26.2%（表 4）。 表 4 不同處理對番茄根際土壤微生物的影響 Table 4 Effect of different treatments on the density of microorganisms in rhizosphere 時間 Time 處理方式 Treatment 細菌數(shù) Number of bacteria (106CFU/g) 放線菌數(shù) Number of actinomycetes (104CFU/g)真菌數(shù) Number of fungi (105CFU/g) YH-07 1.71 0.95 a 5.09 0.35 a 1.77 1.12 c H7 R 1.53 0.82 ab 3.43 0.46 c 2.85 0.53 b R 1.48 0.75 b 2.67 1.10 d 5.48 1.22 a 15 d CK 1.63 0.56 ab 4.47 0.82 b 1.19 0.76 c YH-07 2.51 0.31 a 5.50 0.53 a 1.31 1.21 bc H7 R 2.15 0.36 b 4.33 0.27 b 2.03 0.85 b R 1.67 0.75 c 2.48 0.98 d 6.41 0.84 a 45 d CK 1.74 0.63 c 3.66 1.02 c 2.57 0.84 bc 760 中 國 生 物 防 治 學 報 第 34 卷 3 討論 海洋源微生物具有耐鹽、耐酸堿、耐高溫、耐貧瘠等特點，相比陸地微生物，能產(chǎn)生新穎的活性物質(zhì)16-18，海洋微生物作為重要的生防資源， 具有廣闊的應用前景。 國內(nèi)外利用海洋微生物進行生物防治的報道較多，Tareq 等19報道了從海洋芽胞桿菌 Bacillus subtilis 中分離出的 3 種新型線性脂肽化合物，其對尖孢炭疽病菌、水稻紋枯病菌及番茄灰霉病菌等病原性真菌顯示出良好的抑菌活性； Trischman 等20從加利福尼亞海灣中分離出了 13 株細菌，其中 2 株革蘭氏陽性菌能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)； Yoshikawa 等21發(fā)現(xiàn)從海藻表面分離篩選到弧菌 C-979，其培養(yǎng)液對一些藍細菌生長有抑制作用。李偉等22從南海中分離出對黃瓜枯萎病菌有強抑制效果的枯草芽胞桿菌 3512A，田間防治效果達到 70%以上。赤桿菌作為一類重要的海洋源微生物，在全球海洋碳循環(huán)和能量代謝過程中發(fā)揮著重要作用，在環(huán)境修復23,24、食品工程25和生物醫(yī)學26,27等領域也具有應用價值。 本實驗室在連云港海域采集的海泥樣本中篩得了一株海洋源細菌赤桿菌 YH-07，室內(nèi)平板試驗中，YH-07 對番茄枯萎病具有較強的抑制作用。不同培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和發(fā)酵條件可顯著影響菌株代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率28,29。為了進一步提高該菌株抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量，通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化得到最有利于 YH-07產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)基配方： 蛋白胨 1%， 酵母粉 0.25%， 蔗糖 1%， NaCl 3%， MgSO47H2O 0.03%。并進行了發(fā)酵條件的優(yōu)化， 得到最佳培養(yǎng)條件為溫度 30 、 接種量 1%、 裝液量 50 mL/250 mL、 轉速 140 r/min、pH 7.0。菌株 YH-07 在發(fā)酵條件優(yōu)化后的抑菌活性比優(yōu)化前提高了 9.4%。值得一提的是該菌株的耐鹽性極高，推測將該菌株應用于存在鹽漬化問題的設施土傳病害的防治中會有較好的生防效果，本研究也會在接下來的試驗中對此進行驗證。 試驗還發(fā)現(xiàn)，經(jīng) YH-07 發(fā)酵液處理的番茄根際土中細菌和放線菌數(shù)量顯著增加。細菌是土壤物質(zhì)轉化的主要動力，在土壤中占絕對優(yōu)勢。放線菌能產(chǎn)生抗生素或其他激素類物質(zhì)，有利于抑制病原菌的生長。土壤微生物組成在一定程度上會對植物病害的發(fā)生和為害程度產(chǎn)生影響， Jancvier 等30的研究表明，微生物的密度與土壤抑制病原菌的能力呈正相關； Peng 等31發(fā)現(xiàn)細菌密度的增加能夠顯著抑制土壤中香蕉枯萎病 F. oxysporum f. sp. cubense。本研究中的拮抗細菌 YH-07 盆栽生防效果尚可，說明生防菌 YH-07 能夠通過影響土壤微生物的組成、抑制病原真菌的生長從而降低植物發(fā)病率。 綜上所述，赤桿菌 YH-07 作為生防菌對番茄枯萎病有良好的防治效果，具有在番茄生產(chǎn)中的應用價值。我們也將在后續(xù)的試驗中繼續(xù)對生防菌在植株體內(nèi)不同部位的定殖動態(tài)進行檢測，并研究其與植株的防御基因表達、酶活性變化等植物誘導抗性的相關關系，從而全面揭示赤桿菌 YH-07 對番茄枯萎病的防治機制。 參 考 文 獻 1 Ajilogba C F, Babalola O O. Integrated management strategies for tomato Fusarium wiltJ. Biocontrol Science, 2013, 18(3): 117-127. 2 葛曉穎 , 孫志剛 , 李濤 , 等 . 設施番茄連作障礙與土壤芽胞桿菌和假單胞菌及微生物群落的關系分析 J. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報 , 2016, 35(3): 514-523. 3 徐艷輝 , 李燁 , 許向陽 . 番茄枯萎病的研究進展 J. 東北農(nóng)業(yè)大學學報 , 2008, 39(11): 128-134. 4 Weller D M, Raaijmakers J M, Gardener B B M, et al. Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogensJ. Annual Review of Phytopathology, 2002, 40(1): 309-348. 5 Knox O, Killham K, Leifert C. Effects of increased nitrate availability on the control of plant pathogenic fungi by the soil bacterium Bacillu