雙孢蘑菇對高溫脅迫的響應及耐熱機理.pdf

Research paper 研究論文 22 June 2021 40 6 1400 1412 Mycosystema ISSN1672 6472 CN11 5180 Q DOI 10 13346 j mycosystema 200386 基金項目 上海市科技興農(nóng)項目 滬農(nóng)科創(chuàng)字 2020 第 1 3 號 Supported by the Shanghai Science and Technology Agriculture Project 202001 3 Corresponding authors E mail hf zjj6688 huichen js Received 2020 12 09 accepted 2021 01 18 菌物學報 Copyright 2021 Institute of Microbiology CAS All rights reserved jwxt Http journals Tel 86 10 64807521 1400 雙孢蘑菇對高溫脅迫的響應及耐熱機理 王倩 黃建春 卜樂男 郝海波 雋加香 肖婷婷 陳輝 張津京 上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室 農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點 實驗室 國家食用菌工程技術研究中心 上海 201403 摘 要 本研究以雙孢蘑菇 Agaricus bisporus 工廠化菌株 A15 和篩選得到的耐高溫菌株 A15 TH 為研究對 象 比較了高溫脅迫對兩個菌株菌絲生長的影響 并從氧化損傷修復及基礎碳代謝 糖酵解途徑兩個角度 探索雙孢蘑菇對高溫脅迫的響應及耐熱機理 高溫脅迫下 對照菌株 A15 的菌絲生長速度降低 菌絲分 叉增加 而耐高溫菌株 A15 TH 菌絲生長速度高于 A15 菌絲形態(tài)優(yōu)于對照菌株 表現(xiàn)出對高溫具有一定 的耐受性 對兩個菌株高溫脅迫下氧化損傷及抗氧化酶系統(tǒng)進行研究發(fā)現(xiàn) 高溫脅迫 30 90min 導致對 照菌株 A15 的三磷酸腺苷 ATP 含量下降 54 4 59 6 線粒體復合物 I II III 活性升高 超氧陰離子 O 2 含量增加了 34 9 71 3 此外高溫脅迫降低了超氧化物歧化酶 SOD 的活性 影響了 O 2 的清 除效率 耐高溫菌株在受到高溫脅迫后的氧化損傷及氧化修復效果與對照菌株不同 一方面體現(xiàn)在正常 狀態(tài)下維持較低的細胞能量代謝和較高的 ROS 合成量 另一方面抗氧化系統(tǒng)中 sod1 sod2 cat1 與對照 菌株相比有不同程度的上調 SOD 和過氧化氫酶 CAT 活性增強 可以更有效地清除過量的活性氧 減 輕高溫對菌絲的氧化損傷 尤其在高溫脅迫 120min 時 A15 的線粒體功能及抗氧化系統(tǒng)受到嚴重損傷 線粒體復合物 I II III 活性和 CAT 活性大幅度下降 但是 A15 TH 線粒體復合體 I III 活性分別增加至正 常狀態(tài)下的 1 4 倍和 8 9 倍 CAT 活性比對照菌株高 128 維持了正常的線粒體功能及對活性氧的有效清 除 進一步研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下 雙孢蘑菇菌絲的己糖激酶和丙酮酸激酶活性增加 糖酵解途徑加快 耐高溫菌株 A15 TH 在正常狀態(tài)下和高溫脅迫下 己糖激酶和丙酮酸激酶的活性均高于對照菌株 A15 具 有更活躍的碳代謝 關鍵詞 雙孢蘑菇 高溫脅迫 線粒體 氧化損傷修復 糖酵解 引用本文 王倩 黃建春 卜樂男 郝海波 雋加香 肖婷婷 陳輝 張津京 2021 雙孢蘑菇對高溫脅迫的響應及耐熱 機理 菌物學報 40 6 1400 1412 Wang Q Huang JC Bu LN Hao HB Juan JX Xiao TT Chen H Zhang JJ 2021 The response and thermotolerant mechanism of Agaricus bisporus under high temperature stress Mycosystema 40 6 1400 1412 研究論文 22 June 2021 40 6 1400 1412 Mycosystema ISSN1672 6472 CN11 5180 Q 菌物學報 1401 The response and thermotolerant mechanism of Agaricus bisporus under high temperature stress WANG Qian HUANG Jian Chun BU Le Nan HAO Hai Bo JUAN Jia Xiang XIAO Ting Ting CHEN Hui ZHANG Jin Jing Institute of Edible Fungi Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding Key Laboratory of Resources and Utilization of Edible Fungi South Ministry of Agriculture National Engineering Research Center of Edible Fungi Shanghai 201403 China Abstract Industrialized cultivated strain A15 assigned as experimental control and thermotolerant strain A15 TH screened from A15 were used to study the effects of high temperature stress on the growth of mycelia of Agaricus bisporus and the response to heat and thermotolerant mechanism were explored on the basis of oxidative damage repair and basic carbon metabolism glycolysis It was found that under high temperature stress the growth rate of mycelia of A15 decreased and hyphal bifurcation increased However the growth rate of mycelia of A15 TH was higher than that of A15 and the hyphal morphology was normal and superior to that of A15 manifesting A15 TH was tolerant to high temperature stress The oxidative damage and antioxidant enzyme system of the two strains were compared under high temperature stress The results showed that the ATP content reduced by 54 4 59 6 the activities of mitochondrial complex I II and III increased and the superoxide anion O 2 content increased by 34 9 71 3 under 30 90min heat stress for A15 In addition high temperature stress reduced the superoxide dismutase activity thus affected the clearance efficiency of O 2 of A15 A15 TH showed low energy metabolism and high O 2 synthesis under normal conditions and the expressions of sod1 sod2 and cat1 genes were up regulated as compared with the control strain A15 under high temperature stress Moreover the activities of superoxide dismutase and catalase enhanced which could remove excess O 2 more effectively and reduced the oxidative damage to mycelia Under 120min heat stress the mitochondrial function and antioxidant system of A15 were severely damaged and the activities of mitochondrial complex I II III and CAT decreased significantly On the contrary under such a heat stress A15 TH showed normal mitochondrial function and efficient removal of excess O 2 manifesting that mitochondrial complex I and III activities increased to 1 4 and 8 9 times respectively as compared with the normal state while CAT activity was 128 higher than that of A15 Under high temperature stress the activity of hexokinase and pyruvate kinase increased and the glycolytic pathway accelerated In comparison with A15 A15 TH showed higher activity of hexokinase and pyruvate kinase under both normal condition and high temperature stress indicating more active carbon metabolism Key words Agaricus bisporus high temperature stress mitochondria oxidative damage repair glycolysis 王倩 等 雙孢蘑菇對高溫脅迫的響應及耐熱機理 Research paper 菌物學報 1402 線粒體是細胞中重要的能量代謝場所 為生物體正常生命活動提供必要的能量和中 間代謝產(chǎn)物 線粒體電子傳遞鏈不僅能產(chǎn)生能 量物質三磷酸腺苷 adenosine triphosphate ATP 還是細胞內活性氧 reactive oxygen species ROS 的重要來源 劉樹森 2008 逆境脅迫會引起呼吸代謝的紊亂 Vanhoudt et al 2011 Tulah B Morphology of mycelia under fluorescence microscope 40 C Mycelial growth rate 2 2 高溫脅迫下雙孢蘑菇氧化損傷及抗氧化 系統(tǒng)響應 線粒體不僅是 ATP 合成的場所 同時也 是生成 ROS 的主要部位 在線粒體中 電子 傳遞鏈的復合物 I 和復合物 III 是 ROS 產(chǎn)生的 主要位點 Chen et al 2003 Nohl et al 2004 Navarro B Mitochondrial complex I activity C Mitochondrial complex II activity D Mitochondrial complex III activity E Superoxide anion content F Hydrogen peroxide content 對照菌株 A15 在高溫脅迫 30 60 90min 時 ATP 的含量由正常狀態(tài)的 0 13 mol g 鮮重 降低至 0 05 0 06 mol g 降低了 54 4 59 6 圖 2A 線粒體復合物 I II III 活性呈增加 或者先降低再增加的趨勢 圖 2B 2D 在正常 的氧化還原循環(huán)中 A15 每克菌絲產(chǎn)生 6 9nmol 的超氧陰離子自由基 O 2 熱激 30min 后 超氧陰離子含量迅速上升至 11 8nmol 隨 著 王倩 等 雙孢蘑菇對高溫脅迫的響應及耐熱機理 Research paper 菌物學報 1406 高溫處理時間的延長 菌絲抗氧化系統(tǒng)啟 動 O 2 含量逐漸降低 但仍未能恢復至正 常水平 圖 2E 這說明熱激后線粒體呼吸 鏈 ATP 合成和活性氧生成的平衡被打破 機 體產(chǎn)生應激反應 在高溫脅迫 120min 時 對照菌株線粒體復合物 I II III 活性的降低 可能與高溫脅迫導致線粒體功能障礙有關 耐高溫菌株 A15 TH 在沒有受到高溫脅迫的 正常狀態(tài)下 ATP 的含量僅為照菌株 10 左 右 超氧陰離子 O 2 的含量比對照菌株高 30 7 受到高溫脅迫時 耐高溫菌株 ATP 合成量增加 同時超氧陰離子含量并沒有 在生物體內累積 在高溫脅迫 30 60 90min 時 圖 2B 2D 耐高溫菌株線粒體復合物 I III 活性與對照菌株并沒有顯著差異 至 高溫脅迫 120min 時 A15 TH 的線粒體復合 物 I III 活性并沒有像對照菌株一樣出現(xiàn)大 幅度降低 線粒體復合體 III 活性反而大幅 度增加 說明耐高溫菌株的線粒體仍在進 行正常的應激響應 高溫脅迫下 對照菌 株和耐高溫菌株的過氧化氫 H 2 O 2 含量 都呈現(xiàn)先增加 30 90min 后降低 120min 的趨勢 但并不顯著 且同樣的溫度處理 時間下 耐高溫菌株的 H 2 O 2 含量均高于出 發(fā)菌株 高溫處理 120min 時呈顯著差異 圖 2F 為緩解超氧陰離子 O 2 和過氧化氫 H 2 O 2 積累造成的傷害 雙孢蘑菇抗氧化系統(tǒng)啟動 并發(fā)揮作用 在抗氧化過程中 超氧化物歧 化酶 SOD 和過氧化氫酶 CAT 是兩種最 有效的抗氧化酶 Elstner 1982 Madasamy et al 2014 Chakravarthy et al 2016 Wang et al 2017c 超氧化物歧化酶 SOD 催化 O 2 變 成 H 2 O 2 和分子氧 過氧化氫酶 CAT 將 H 2 O 2 分解為氧氣和水 從而減輕了超氧自由基和 過氧化氫對細胞的傷害 圖 3A 表明 高溫脅迫下 對照菌株 A15 圖3 高溫脅迫對雙孢蘑菇超氧化物歧化酶活性及 超氧化物歧化酶基因相對表達量的影響 不同 小寫字母表示差異顯著性 P 0 05 A 超氧化物 歧化酶活性 B 超氧化物歧化酶基因 1 相對表達 量 C 超氧化物歧化酶基因 2 相對表達量 Fig 3 Effects of heat stress on the superoxide dismutase activity and on the relative expression of sod genes of Agaricus bisporus Different lowercase letters indicate a significant difference at P 0 05 A Superoxide dismutase activity B The sod1 gene relative expression ratio C The sod2 gene relative expression ratio 研究論文 22 June 2021 40 6 1400 1412 Mycosystema ISSN1672 6472 CN11 5180 Q 菌物學報 1407 的超氧化物歧化酶 SOD 的酶活性受到抑 制 酶活性降低了 28 3 33 6 而耐高溫 菌株 A15 TH 在不同的熱處理時間下 均能保 持較高的 SOD 活性 有利于 O 2 的去除 緩 解氧化損傷 進一步比較了超氧化物歧化酶 基因相對表達量 圖 3B 3C 高溫脅迫下 對照菌株 A15 和耐高溫菌株 A15 TH 的 sod1 和 sod2 相對表達量隨熱處理時間的延長均 出現(xiàn)先下調后又上調的趨勢 熱脅迫對 sod1 基因相對表達量的影響 更為顯著 熱處理 30 90min 時 基因相對表達量下調了 51 57 熱處理 120min 略有上調 熱脅迫 90min 對 sod2 基因相對表達量影響最為顯著 下調 了約 40 耐高溫菌株 A15 TH 在正常狀態(tài)下 及熱脅迫時 sod1 和 sod2 的基因相對表達量 稍高于對照菌株 但差異不顯著 圖 4 比較了高溫脅迫下 雙孢蘑菇菌株 過氧化氫酶和 cat 基因相對表達量的變化 對照菌株的過氧化氫酶 CAT 活性隨處理時 間的延長先上升 30 90min 后降低 120min 圖4 高溫脅迫對雙孢蘑菇過氧化氫酶活性及過氧化氫酶基因相對表達量的影響 不同小寫字母表示差 異顯著性 P 0 05 A 過氧化氫酶活性 B 過氧化氫酶基因 1 相對表達量 C 過氧化氫酶基因 2 相 對表達量 D 過氧化氫酶基因 3 相對表達量 Fig 4 Effects of heat stress on the catalase activity and on the relative expression of catalase genes of Agaricus bisporus Different lowercase letters indicate a significant difference at P 0 05 A Catalase activity B The cat1 gene relative expression ratio C The cat2 gene relative expression ratio D The cat3 gene relative expression ratio 王倩 等 雙孢蘑菇對高溫脅迫的響應及耐熱機理 Research paper 菌物學報 1408 圖 4A 這可能是由于熱處理 120min 對照 菌株造成了嚴重的損傷 導致后期 CAT 活性 的降低 不同熱處理時間下 耐高溫菌株 A15 TH 的 CAT 活性均高于對照菌株 尤其在 120min 的處理中 耐高溫菌株的 CAT 活性比 對照菌株高 128 說明耐高溫菌株的抗氧 化系統(tǒng)對活性氧有較強的 清除能力 高溫脅 迫下 對照菌株和耐高溫菌株的 3 個 cat 基 因相對表達量有不同的變化趨勢 由圖 4B 可知 高溫脅迫 30min 時 對照菌株 cat1 相對表達量降低了 54 4 延長高溫脅迫時 間 cat1 緩慢回升至沒有經(jīng)過熱脅迫的正常 水平 耐高溫菌株 A15 TH 在受到熱脅迫 30min 后 cat1 相對表達量顯著上調至未受 到脅迫狀態(tài)下的 1 5 倍 在熱脅迫作用 60min 和 90min 時維持在較高水平 至熱脅迫作用 120min 時出現(xiàn)更大幅度的上調 較正常狀態(tài) 下提高了 149 2 所有熱脅迫處理中 耐高 溫菌株的 cat1 相對表達量均高于對照菌株 cat2 和 cat3 相對表達量隨熱脅迫時間的延 長分別出現(xiàn)先下調再上調和先上調再下調 的趨勢 對照菌株和耐高溫菌株沒有顯著差 異 圖 4C 4D 2 3 高溫脅迫下雙孢蘑菇糖酵解途徑關鍵酶 活性變化 對高溫脅迫下雙孢蘑菇基礎碳代謝 糖酵解途徑中的關鍵酶進行了測定 受到高 溫脅迫后 對照菌株 A15 己糖激酶 HK 和丙 酮酸激酶 PK 活性增加 熱處理 90 120min 酶活性較正常狀態(tài)分別增加約 120 和 130 結果顯著 耐高溫菌株 A15 TH 在正常狀態(tài)下 己糖激酶和丙酮酸激酶 的活性顯著高于對 照菌株 受到熱脅迫后 酶活性也維持在高 水平 始終高于對照菌株 熱脅迫 120min HK 和 PK 活性比對照菌株分別高 124 和 73 圖 5 圖5 高溫脅迫對雙孢蘑菇菌絲己糖激酶和丙酮酸 激酶活性的影響 不同小寫字母表示差異顯著 性 P 0 05 A 己糖激酶活性 B 丙酮酸激酶 活性 Fig 5 Effects of heat stress on the hexokinase and pyruvate kinase enzyme activities of Agaricus bisporus Different lowercase letters indicate a significant difference at P 0 05 A HK activity B PK activity 3 討論 在本研究中 高溫脅迫對雙孢蘑菇菌絲 影響最直觀的表現(xiàn)是菌絲生長速度降低 同 時菌絲形態(tài)發(fā)生改變 菌絲分叉增加 高溫 脅迫對其他食用菌菌絲也有類似的影響 劉 秀明等 2015 2017 發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下白靈 側耳和刺芹側耳菌絲生長速度顯著降低 因 此本研究通過比較高溫脅迫下雙孢蘑菇菌絲 生長速度篩選到了耐高溫菌株 A15 TH 在此 研究論文 22 June 2021 40 6 1400 1412 Mycosystema ISSN1672 6472 CN11 5180 Q 菌物學報 1409 基礎上 對雙孢蘑菇菌絲在高溫脅迫下的氧 化損傷及氧化應激機制進行了初步探索 生物體在正常情況下 線粒體的 ATP 合成 和 ROS 生成處于動態(tài)平衡 共同維持機體的 生長發(fā)育 ROS 的產(chǎn)生和清除發(fā)揮重要的生理 功能 而線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的 O 2 和 H 2 O 2 是生 物體內最大數(shù)量 ROS 的恒定來源 劉樹森 2008 在本研究中 對照菌株受到高溫脅迫 30 90min 時 ATP 含量下降 54 4 59 6 線 粒體復合物 I II III 活性迅速升高 O 2 含量 增加至正常狀態(tài)下的 1 35 1 71 倍 這些結 果表明高溫脅迫下線粒體出現(xiàn)功能障礙 這 與高溫對小鼠 Song et al 2016 魚 Banh et al 2016 植物 Rikhvanov et al 2014 糙 皮側耳 閆志宇 2020 等線粒體造成功能損 傷的相關研究結果一致 在沒有受到熱脅迫 的狀態(tài)下 耐高溫菌株 ATP 含量僅為對照組 的 10 O 2 的含量比對照菌株高 30 7 這 說明耐高溫菌株的線粒體功能可能發(fā)生突 變 在正常狀態(tài)下維持較低的細胞能量代謝 和較高的 ROS 合成量 在植物研究中發(fā)現(xiàn) ROS 除了作為強氧化劑攻擊植物體內的細胞 膜或蛋白分子造成氧化傷害之外 還可以作 為信號分子介導植物對各種外界刺激產(chǎn)生脅 迫響應 Miller et al 2008 在本研究中 正 常狀態(tài)下耐高溫菌株較高的 ROS 含量是否介 導了其他信號通路進行高溫脅迫前的防御工 作還有待進一步研究 受到熱脅迫后 耐高 溫菌株 ATP 含量增加 這與對照菌株剛好相 反 進一步證明耐高溫菌株線粒體 ATP 合成 和 ROS 生成的平衡機制與對照菌株不同 且 O 2 含量并沒有在菌絲中積累而是維持在穩(wěn) 定狀態(tài) 表明耐高溫菌株對 O 2 有更好的清除 能力 酶活分析表明 高溫脅迫下 對照菌株 的抗氧化酶系統(tǒng)受到影響 表現(xiàn)在菌絲 CAT 活性增加 但 SOD 活性降低 這可能影響了 O 2 的去除效率 而耐高溫菌株的 SOD 活性始 終維持在較高水平 與對照菌株有顯著差異 此外 在熱脅迫 120min 時 對照菌株的抗氧 化系統(tǒng)遭受嚴重破壞 CAT 活性下降 但是 耐高溫菌株的 CAT 活性不僅沒有降低 反而 出現(xiàn)大幅度增加 比對照菌株活性高 128 證明該菌株可以更有效地清除過量的活性 氧 減輕高溫對菌絲的氧化損傷 對抗氧化 酶基因表達進行研究發(fā)現(xiàn) 對照菌株和耐高 溫菌株 sod1 sod2 基因的相對表達量在熱脅 迫下均出現(xiàn)了先下調再上調的趨勢 sod1 對 高溫處理更敏感 變化幅度更大 此外 耐 高溫菌株的 sod 基因相對表達量高于對照菌 株 但是不顯著 猜測兩個 sod 基因的協(xié)同 表達對穩(wěn)定耐高溫菌株的酶活起到了一定的 作用 對照菌株和耐高溫菌株的 3 個 cat 基 因相對表達量隨高溫脅迫時間的延長有不同 的變化趨勢 其中耐高溫菌株 cat1 相對表達 量顯著高于對照菌株 與酶活結果最一致 說明 cat1 可能在高溫脅迫中發(fā)揮了主要作用 cat2 和 cat3 分別出現(xiàn)了先下調再上調以及先 上調再下調兩種截然不同的變化 且 A15 TH 和 A15 沒有顯著差異 這可能因為不同的同 工酶 CAT 在發(fā)育和脅迫中發(fā)揮的作用不同 這一點在植物 Du et al 2008 以及在糙皮側 耳 Wang et al 2017a 過氧化氫酶基因特征 分析及功能研究中都有報道 己糖激酶和丙酮酸激酶是糖酵解途徑的 關鍵酶和限速酶 高溫脅迫下 雙孢蘑菇菌 絲的己糖激酶和丙酮酸激酶活性增加 這說 明糖酵解途徑加快 閆志宇 2020 研究發(fā) 現(xiàn) 糙皮側耳高溫脅迫下糖酵解途徑和三羧 酸循環(huán)兩大核心碳代謝途徑加快 這與我們 的研究結果一致 他還提出加入海藻糖可以 下調糖酵解關鍵酶的基因表達 調控核心碳 代謝流提高糙皮側耳的菌絲耐熱性 而在我 們的研究中耐高溫菌株在正常狀態(tài)下和熱脅 王倩 等 雙孢蘑菇對高溫脅迫的響應及耐熱機理 Research paper 菌物學報 1410 迫下 己糖激酶和丙酮酸激酶的活性均高于 對照菌株 說明耐高溫菌株具有更活躍的碳 代謝 生物體的代謝網(wǎng)絡是十分復雜的 同 時生物體在進化過程中演化形成了多種響應 環(huán)境壓力的策略 除了抗氧化系統(tǒng)的響應和 代謝途徑的響應之外 還包括信號轉導系統(tǒng) 響應 Shiraishi et al 2018 轉錄因子響應 Cortijo et al 2017 激素響應 Wang et al 2018 防御蛋白響應 Jacob et al 2017 Wang et al 2017b 細胞壁和細胞膜的響應 Kitichantaropas et al 2016 等 關于雙孢 蘑菇菌株在高溫脅迫下響應機制還需要從不 同的角度加以研究和探索 REFERENCES Banh S Wiens L Sotiri E Treberg JR 2016 Mitochondrial reactive oxygen species production by fish muscle mitochondria potential role in acute heat induced oxidative stress Comparative Biochemistry and Physiology Part B Biochemistry and Molecular Biology 191 99 107 Chakravarthy N Aravindan K Kalaimani N Alavandi SV Poornima M Santiago TC 2016 Intracellular copper zinc superoxide dismutase icCuZnSOD from Asian seabass Lates calcarifer molecular cloning characterization and gene expression with reference to Vibrio anguillarum infection Developmental and Comparative Immunology 36 751 755 Chen Q Vazquez EJ Moghaddas S Hoppel CL Lesnefsky EJ 2003 Production of reactive oxygen species by mitochondria central role of complex III Journal of Biological Chemistry 278 36027 36031 Cortijo S Charoensawan V Brestovitsky A Buning R Ravarani C Rhodes D Noort JV Jaeger KE Wigge PA 2017 Transcriptional regulation of the ambient temperature response by H2A Z nucleosomes and HSF1 transcription factors in Arabidopsis Molecular Plant 10 10 1258 1273 Du YY Wang PC Chen J Song CP 2008 Comprehensive functional analysis of the catalase gene family in Arabidopsis thaliana Journal of 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