瓜類褪綠黃化病毒編碼的P6蛋白亞細(xì)胞定位及致病特征分析.pdf

園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1531 1540 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2020 0914 http www ahs ac cn 1531 收稿日期 2020 12 17 修回日期 2021 05 06 基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 2018YFD0201208 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 32072506 31770168 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目 CARS 24 C 01 江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目 CX 19 3108 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基金項(xiàng)目 6111614 共同第一作者 通信作者 Author for correspondence E mail jiyinghua 瓜類褪綠黃化病毒編碼的 P6 蛋白亞細(xì)胞定位及 致病特征分析 涂麗琴 1 2 干射香 1 3 吳淑華 1 任春梅 1 程兆榜 1 章松柏 3 朱月林 2 周益軍 1 季英華 1 1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 南京 210014 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 南京 210095 3 長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院 湖北荊州 434025 摘 要 以瓜類褪綠黃化病毒 cucurbit chlorotic yellows virus CCYV 山東壽光分離物作為研究對(duì) 象 對(duì)其 RNA1 編碼的 P6 蛋白進(jìn)行克隆 發(fā)現(xiàn)其基因全長(zhǎng)為 159 bp 編碼 1 個(gè)大約 6 kD 的蛋白 并含 1 個(gè)跨膜區(qū) 進(jìn)一步構(gòu)建了帶有 YFP 標(biāo)簽的熒光表達(dá)載體 P6 YFP 浸潤(rùn)本氏煙葉片后利用激光共聚焦顯微 鏡觀察 發(fā)現(xiàn) P6 YFP 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有分布 將 P6 構(gòu)建到馬鈴薯 X 病毒 potato virus X PVX 異源表達(dá)載體獲得的 PVX P6 接種本氏煙 發(fā)現(xiàn)接種 PVX P6 的植株新葉伴有明顯黃化 皺縮等癥狀 并 沿葉脈出現(xiàn)壞死 而接種 PVX 空載體的植株僅有輕微的花葉 表明在 PVX 異源表達(dá)系統(tǒng)中 P6 誘導(dǎo)寄 主植物出現(xiàn)更嚴(yán)重的癥狀 暗示 P6 能增強(qiáng) PVX 的致病性 可能是參與癥狀形成的致病相關(guān)因子 關(guān)鍵詞 瓜類褪綠黃化病毒 P6 蛋白 亞細(xì)胞定位 致病性 中圖分類號(hào) S 642 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 0513 353X 2021 08 1531 10 Characterization of the Subcellular Localization and Pathogenicity of P6 Encoded by Cucurbit Chlorotic Yellows Virus TU Liqin 1 2 GAN Shexiang 1 3 WU Shuhua 1 REN Chunmei 1 CHENG Zhaobang 1 ZHANG Songbai 3 ZHU Yuelin 2 ZHOU Yijun 1 and JI Yinghua 1 1 Institute of Plant Protection Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Nanjing 210014 China 2 College of Horticulture Nanjing Agricultural University Nanjing 210095 China 3 College of Agriculture Yangtze University Jingzhou Hubei 434025 China Abstract Cucurbit chlorotic yellows virus CCYV is an important whitefly transmitted Crinivirus which has become an emerging infectious agent of cucurbits leading to severe disease and significant economic losses P6 is a small protein encoded by ORF2 of RNA1 one segment of CCYV and its functions still remains unknown In this study P6 was cloned from an isolate of CCYV from Shouguang Shandong Provience using specific primers by RT PCR The results of sequence analysis revealed that P6 gene was 159 bp in length encoding a protein of approximately 6 kD with a transmembrane domain To Tu Liqin Gan Shexiang Wu Shuhua Ren Chunmei Cheng Zhaobang Zhang Songbai Zhu Yuelin Zhou Yijun Ji Yinghua Characterization of the subcellular localization and pathogenicity of P6 encoded by cucurbit chlorotic yellows virus 1532 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1531 1540 clarify the subcellular localization of P6 a YFP tagged P6 P6 YFP was constructed using a 35S YFP vector and transiently expressed in the Nicotiana benthamiana by agrobacterium infiltration Fluorescence signal was observed in the cytoplasm and nucleus of the epidermal cells of infiltrated N benthamiana leaves which indicated that P6 YFP was distributed in the cytoplasm and nucleus To test the pathogenicity of P6 a potato virus X PVX based vector was introduced and PVX P6 was constructed Chlorotic crumple and necrosis symptoms were observed in the emerging leaves of N benthamiana plants inoculated by PVX P6 and only slight mosaic symptoms was observed in the plant inoculated by PVX which showed that heterologous expression of P6 in N benthamiana enhanced the pathogenicity of PVX indicating that P6 might be an important protein involved in the pathology of CCYV Keywords cucurbit chlorotic yellows virus P6 protein subcellular localization pathogenicity 瓜類褪綠黃化病毒 cucurbit chlorotic yellows virus CCYV 是一種粉虱傳植物病毒 Tzanetakis et al 2013 Navas Castillo et al 2014 盧少華 等 2015 危害多種葫蘆科作物 侵染后植株出 現(xiàn)典型的褪綠黃化癥狀 早期葉基部和中部出現(xiàn)褪綠 黃化 而后逐漸向葉上部蔓延 嚴(yán)重時(shí)整株 黃化 Okuda et al 2010 古勤生 等 2011 嚴(yán)重影響其品質(zhì)和產(chǎn)量 CCYV 最早由 Gyoutoku 等 2009 在日本發(fā)現(xiàn) 隨后蘇丹 Hamed et al 2011 黎巴嫩 Abrahamian et al 2012 伊朗 Bananej et al 2013 希臘 Orfanidou et al 2014 埃及 Amer 2015 土耳其 Orfanidou et al 2017 沙特阿拉伯 Shakeel et al 2018 等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)也出現(xiàn)該病毒危害報(bào)道 在中國(guó) Huang 等 2010 首次報(bào)道中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)有 CCYV 發(fā)生 之后浙江 上海 山東 古勤生 等 2011 Gu et al 2011 北京 張汝楠 等 2012 海南 河南 劉珊珊 等 2013 湖南 唐鑫 等 2017 廣西 楊世 安 等 2017 新疆 潘衛(wèi)萍 等 2017 等多個(gè)省市及地區(qū)均出現(xiàn)該病毒發(fā)生危害的報(bào)道 瓜類作 物生產(chǎn)遭受嚴(yán)重的損失 制約了產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展 CCYV 屬長(zhǎng)線形病毒科 Closteroviridae 毛形病毒屬 Crinivirus 暫定種 病毒粒體為線狀 無包膜 其基因組由兩條正單鏈 RNA 組成 RNA1 全長(zhǎng)約 8 6 kb 含有 4 個(gè)開放閱讀框 open reading frame ORF ORF1a 編碼甲基磷酸轉(zhuǎn)移酶和依賴 RNA 的病毒解旋酶 ORF1b 編碼依賴 RNA 的 RNA 聚合酶 ORF2 編碼 P6 ORF3 編碼 P22 蛋白 RNA2 全長(zhǎng)約 8 kb 編碼 8 個(gè)開放閱讀框 分 別編碼外殼蛋白 CP 小外殼蛋白 CPm 70 kD 類熱激蛋白 HSP70h P59 P26 P9 P6 P4 9 蛋白 其中 CP CPm HSP70h 和 P59 為結(jié)構(gòu)蛋白 而其余多為非結(jié)構(gòu)蛋白 Kiss et al 2013 雖然有報(bào)道 RNA1 編碼蛋白多與病毒復(fù)制侵染相關(guān) RNA2 編碼蛋白主要參與病毒的組裝 運(yùn)動(dòng)及 介體傳播 但很多蛋白 包括 P6 的功能尚不清楚 洪雪玉和陳劍平 2004 Dolja et al 2006 Okuda et al 2010 P6 蛋白是由 CCYV RNA1 組分 ORF2 編碼的 1 個(gè)小分子量蛋白 其編碼框在位置上處于 RdRp 與 P22 蛋白之間 在毛形病毒屬成員中 并不是所有病毒在對(duì)應(yīng)位置都有編碼蛋白 有些病毒雖然 在對(duì)應(yīng)位置有編碼蛋白 如萵苣褪綠病毒 lettuce chlorosis virus LCV 在 RdRp 與 P23 之間編碼 P8 蛋白 Kiss et al 2013 Navas Castillo et al 2014 但其與 CCYV 編碼的 P6 之間同源性極低 同時(shí) P6 序列比對(duì)分析結(jié)果也顯示其與目前報(bào)道過的病毒蛋白之間的同源性都非常低 因此 P6 極有 可能是 CCYV 特有的 1 個(gè)蛋白 在病毒與寄主的互作過程中發(fā)揮重要作用 為解析 CCYV 編碼的 P6 蛋白功能 選擇 CCYV 山東分離物作為研究對(duì)象 對(duì)其 P6 基因進(jìn)行 克隆和分析 并構(gòu)建了帶有熒光標(biāo)簽的瞬時(shí)表達(dá)載體 P6 YFP 和異源病毒表達(dá)載體 PVX P6 浸潤(rùn)接 涂麗琴 干射香 吳淑華 任春梅 程兆榜 章松柏 朱月林 周益軍 季英華 瓜類褪綠黃化病毒編碼的 P6 蛋白亞細(xì)胞定位及致病特征分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1531 1540 1533 種本氏煙后 分別通過共聚焦顯微鏡觀察及表型觀察研究了 P6 的亞細(xì)胞定位及致病特征 為后續(xù) 深入解析 P6 功能及其在 CCYV 與寄主互作中的作用機(jī)理奠定理論基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料 供試病樣為 2016 年采自山東壽光的發(fā)病黃瓜葉片 干射香 等 2019 熒光表達(dá)載體 35S YFP 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陶小榮教授提供 農(nóng)桿菌 GV3101 PVX 異源病毒載體 PGR107 和植物材料本氏 煙種子由本課題組實(shí)驗(yàn)室保存 1 2 P6 基因克隆及其序列分析 利用 RNAiso Plus 寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司 TaKaRa 參照吳淑華等 2015 使用 TRIzol 法提取黃瓜病樣總 RNA 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript TM 1st strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行 cDNA 合成 根據(jù)在 National Center for Biotechnology Information NCBI 上已發(fā)布的 CCYV 基因組序列 NC 018173 設(shè)計(jì) P6 全長(zhǎng)擴(kuò)增引物 表 1 以上述 cDNA 為模板 反應(yīng)體系 10 PCR 緩沖液 Mg 2 plus 2 5 L dNTPs mix 0 5 L Ex Taq 0 5 L TaKaRa P6 bF 10 mol L 1 和 P6 bR 10 mol L 1 各 1 L cDNA 1 L ddH 2 O 18 5 L 總 體 系 25 L 擴(kuò)增條件 95 預(yù)變性 3 min 95 變性 30 s 50 退火 30 s 72 延伸 30 s 30 個(gè)循環(huán) 最后 72 充分延伸 10 min PCR 產(chǎn) 物經(jīng) 1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 回收目的條帶 連接 pMD18 T 載體 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 TOP10 菌液 PCR 篩選陽性克隆 經(jīng)酶切驗(yàn)證后陽性克隆送南京金斯瑞公司進(jìn)行序列測(cè)定 將獲得的 P6 序列與已公開的 CCYV 不同分離物的 P6 序列進(jìn)行分析 序列多重比對(duì) 同源性分 析使用 ClustalX DNAstar 及 BLAST 程序 http www ncbi nlm nih gov BLAST 完成 跨膜區(qū)預(yù) 測(cè)使用 TMHMM 服務(wù)器 http www cbs dtu dk services TMHMM 在線完成 表 1 引物信息 Table 1 Primers used in this research 引物長(zhǎng)度 bp Length 引物名稱 Name 序列 5 3 Sequence 退火溫度 T m 159 P6 bF CGggatccATGTATTTTACAACAATATTTTACCTC 48 9 P6 bR CGggatccAGCTATTTCTATATTCCTGTGG 49 4 159 P6 ClF CCatcgatATGTATTTTACAACAATATTTTACCTC 48 9 P6 SlR GCgtcgacTCAAGCTATTTCTATATTCCTGT 49 5 注 ggatcc 代表 BamH 酶切位點(diǎn) atcgat 代表 Cla 酶切位點(diǎn) gtcgac 代表 Sal 酶切位點(diǎn) Note ggatcc stands for BamH restriction site atcgat stands for Cla restriction site gtcgac stands for Sal restriction site 1 3 P6 YFP 載體構(gòu)建 選取測(cè)序驗(yàn)證無誤且讀碼框正確的陽性克隆提取質(zhì)粒 使用限制性內(nèi)切酶 BamH 進(jìn)行單酶切 后經(jīng)膠回收試劑盒回收目的片段 使用 T4 連接酶連接目的片段和經(jīng) BamH 酶切并利用堿性磷酸酶 TaKaRa 處理后的 35S YFP 連接體系 T4 DNA 連接酶 1 L 10 T4 DNA 連接酶緩沖液 1 L 線性化 35S YFP 載體 1 L 回收的目的片段 7 L 16 過夜連接 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) Tu Liqin Gan Shexiang Wu Shuhua Ren Chunmei Cheng Zhaobang Zhang Songbai Zhu Yuelin Zhou Yijun Ji Yinghua Characterization of the subcellular localization and pathogenicity of P6 encoded by cucurbit chlorotic yellows virus 1534 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1531 1540 細(xì)胞 TOP10 北京全式金生物 于含卡那霉素的 LB 平板倒置培養(yǎng) 菌落 PCR 篩選陽性克隆后委 托南京金斯瑞生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定 測(cè)序驗(yàn)證無誤后獲得 P6 YFP 重組表達(dá)質(zhì)粒 1 4 P6 亞細(xì)胞定位觀察 將 P6 YFP 重組表達(dá)質(zhì)粒和 YFP 空載質(zhì)粒采用凍融法分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101 涂布于含有卡 那霉素 50 mg L 1 和利福平 25 mg L 1 的抗性平板上 28 倒置培養(yǎng) 48 h 至菌落長(zhǎng)出 菌 落 PCR 篩選陽性克隆 檢測(cè)無誤后轉(zhuǎn)至同樣抗性的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁培養(yǎng)至 OD 600 為 0 8 1 2 8 000 r min 1 3 min 收集菌體 配置浸潤(rùn)液 10 mmol L 1 MgCl 2 10 mmol L 1 MES 100 mol L 1 乙酰丁香酮 重懸菌體至 OD 600 0 5 置于 28 靜置復(fù)蘇 2 h 選取 3 5 葉齡本氏煙 用去除針 頭的 1 mL 注射器在葉片背面做浸潤(rùn)處理 40 48 h 后 hours post infiltration hpi 取浸潤(rùn)區(qū)葉片制 作玻片在激光共聚焦顯微鏡 蔡司 德國(guó) 下觀察亞細(xì)胞定位 H2B mCherry 組蛋白 H2B 示意 細(xì)胞核 生物學(xué)試驗(yàn)重復(fù) 3 次 1 5 P6 YFP 檢測(cè) 取適量本氏煙葉片農(nóng)桿菌浸潤(rùn)部位的組織于液氮冷凍后進(jìn)行研磨 用 TRIzol 法提取總 RNA 使用去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser TaKaRa 合成 cDNA 將 cDNA 作為模板 選擇 P6 bF 和 P6 bR 進(jìn)行 RT PCR 檢測(cè) 參照涂麗琴等 2020 的報(bào)道進(jìn)行 P6 YFP 的 Western blot 檢測(cè) 1 6 PVX P6 載體構(gòu)建 將引物 P6 ClF 和 P6 SlR 表 1 擴(kuò)增獲得的 P6 片段經(jīng)純化回收后連接 pMD18 T 載體 獲得 pMD18T P6 陽性克隆 pMD18T P6 提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切 酶切體系 1 L Cla 限制性內(nèi)切酶 1 L Sal 限制性內(nèi)切酶 4 L 10 上樣緩沖液 20 L pMD18T P6 質(zhì)粒 14 L ddH 2 O 總體積 40 L 37 酶切 4 h 回收目的片段通過 T4 連接酶連接同樣經(jīng) Sal 和 Cla 雙酶切處理的 PVX 異源病 毒載體 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 菌落 PCR 篩選陽性克隆 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無誤后獲得重組 表達(dá)質(zhì)粒 PVX P6 1 7 PVX P6 致病性分析與 RT PCR 檢測(cè) 將 PVX 異源表達(dá)空載體和重組質(zhì)粒 PVX P6 通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101 Soup 19 北京 莊盟生物 涂布于含有卡那霉素 50 mg L 1 和利福平 25 mg L 1 抗性的平板 28 倒置培 養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出 挑取單菌落進(jìn)行菌落 PCR 鑒定 鑒定無誤后在含有卡那霉素和利福平的液體培養(yǎng)基 中過夜擴(kuò)繁培養(yǎng)至 OD 600 值為 0 8 1 2 浸潤(rùn)接種 3 4 齡本氏煙 浸潤(rùn)處理 7 和 13 d 后進(jìn)行拍照記 錄癥狀并取樣檢測(cè) 取接種 PVX 及 PVX P6 本氏煙植株的上部新葉 非浸潤(rùn)葉 于液氮冷凍后充分研磨 提取樣品 總 RNA 利 用 PrimeScript TM RT reagent with gDNA Eraser 合成 cDNA 作為模板 P6 采用引物 P6 ClF 和 P6 SlR 進(jìn)行 RT PCR 檢測(cè) PVX 選擇使用引物 PVX F 和 PVX R 姚玉榮 等 2013 進(jìn)行 RT PCR 檢測(cè) 涂麗琴 干射香 吳淑華 任春梅 程兆榜 章松柏 朱月林 周益軍 季英華 瓜類褪綠黃化病毒編碼的 P6 蛋白亞細(xì)胞定位及致病特征分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1531 1540 1535 2 結(jié)果與分析 2 1 CCYV P6 序列分析 以感染 CCYV 黃瓜葉片樣品 RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA 產(chǎn)物為模板 使用設(shè)計(jì)的 CCYV 編碼的 P6 蛋白特異性引物 表 1 進(jìn)行擴(kuò)增 凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增到 1 條約 160 bp 的特異性條帶 與目 標(biāo)基因 159 bp 大小相近 目的條帶經(jīng)純化回收后 與 pMD18 T 載體連接 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 篩選 陽性克隆后經(jīng)酶切 測(cè)序驗(yàn)證確定了該條帶為擴(kuò)增的 P6 基因目的條帶 CCYV 山東分離物 同時(shí) 獲得重組載體 pMD18T P6 將獲得的 P6 基因序列進(jìn)行分析 發(fā)現(xiàn)其全長(zhǎng) 159 bp 編碼 1 個(gè)約 6 1 kD 的蛋白 使用 ClustalX 軟件對(duì) P6 蛋白序列與之前報(bào)道 CCYV 其他分離物序列進(jìn)行比對(duì)分析 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 CCYV 不同分離 物之間 P6 蛋白序列比較保守 本研究中的山東分離物 P6 序列除了與 2 個(gè)分離物 AB523788 和 KU507601 存在 1 個(gè)氨基酸差異外 與其余分離物的序列完全一致 同時(shí)在使用 TMHMM 對(duì)獲得 的 P6 序列進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn) P6 蛋白存在 1 個(gè)跨膜區(qū) 圖 1 圖 1 CCYV 編碼的 P6 氨基酸序列比對(duì) A 和跨膜區(qū)分析 B Fig 1 Amino acid sequence alignment of P6 encoded by CCYV A and transmembrane domain prediction B 2 2 P6 亞細(xì)胞定位特征分析 P6 YFP 和 YFP 圖 2 A 分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101 后浸潤(rùn)接種本氏煙 48 h 后于激光共聚焦 顯微鏡下觀察 浸潤(rùn) P6 YFP 的本氏煙葉片表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光 信號(hào) 同時(shí) P6 YFP 與 H2B mCherry 細(xì)胞核 共浸潤(rùn)時(shí)二者激發(fā)的熒光在細(xì)胞核區(qū)域存在重疊 圖 2 B 說明 P6 YFP 具有細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核分布的特征 Tu Liqin Gan Shexiang Wu Shuhua Ren Chunmei Cheng Zhaobang Zhang Songbai Zhu Yuelin Zhou Yijun Ji Yinghua Characterization of the subcellular localization and pathogenicity of P6 encoded by cucurbit chlorotic yellows virus 1536 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1531 1540 圖 2 P6 蛋白亞細(xì)胞定位 A P6 YFP 構(gòu)建示意圖 B P6 YFP 亞細(xì)胞定位 C P6 YFP 的 Western blot 及 RT PCR 檢測(cè) Fig 2 Subcellular localization of P6 YFP A Diagram of P6 YFP construction B Subcellular localization of P6 YFP the distribution of P6 in the nucleus was indicated by H2B in the right small picture C Detection of P6 YFP by RT PCR and western blot RT PCR 結(jié)果顯示 以浸潤(rùn) P6 YFP 的本氏煙葉片作為模板進(jìn)行 RT PCR 擴(kuò)增 凝膠電泳結(jié)果顯 示擴(kuò)增到 1 條大小約 160 bp 的特異條帶 與目標(biāo)基因大小一致 而對(duì)照組 YFP 無擴(kuò)增條帶 圖 2 C Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示 浸潤(rùn) YFP 的樣品中檢測(cè)到 1 條大小約 27 kD 條帶 與 YFP 大小相 近 圖 2 C 而浸潤(rùn) P6 YFP 的葉片檢測(cè)到 1 條稍大于 YFP 約 33 kD 的特異性條帶 與目的條 帶大小相近 這說明融合蛋白 P6 YFP 在本氏煙葉片中正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá) 同時(shí)也證實(shí)了在激光共聚 焦顯微鏡下觀察到熒光信號(hào)是由 P6 YFP 在煙草葉片中表達(dá)產(chǎn)生的 2 3 P6 致病特征分析 PVX 異源表達(dá)空載體和重組質(zhì)粒 PVX P6 分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后接種本氏煙 接種 PVX P6 7 d 后 本氏煙上部葉片出現(xiàn)花葉 皺縮等癥狀 而接種 PVX 的本氏煙僅出現(xiàn)輕微花葉癥狀 接種 13 d 后 發(fā)現(xiàn)接種 PVX P6 的植株新葉伴有明顯花葉 皺縮等癥狀 同時(shí)葉片上沿葉脈出現(xiàn)壞死癥狀 而接 種 PVX 的本氏煙并無明顯變化 圖 3 A B 對(duì)接種植株體內(nèi)的異源病毒載體 PVX 和 P6 進(jìn)行了 檢測(cè) 所有接種植株體內(nèi)均能檢測(cè)到 PVX 而在接種 PVX P6 的植株中能檢測(cè)到 P6 在接種 PVX 的植株中未檢到 P6 圖 3 C 這些結(jié)果說明 P6 能顯著增強(qiáng) PVX 的致病性 暗示了在異源病毒 PVX 侵染中 P6 可能是 1 個(gè)參與癥狀形成的致病相關(guān)因子 涂麗琴 干射香 吳淑華 任春梅 程兆榜 章松柏 朱月林 周益軍 季英華 瓜類褪綠黃化病毒編碼的 P6 蛋白亞細(xì)胞定位及致病特征分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1531 1540 1537 圖 3 PVX P6 的煙草葉片致病特征 A B PVX P6 誘導(dǎo)的癥狀 C PVX 和 P6 的 RT PCR 檢測(cè) Fig 3 Symptoms induced by PVX PVX P6 in Nicotiana benthamiana leaves A B Systemic symptoms induced by PVX P6 C Detection of PVX and P6 by RT PCR 3 討論 瓜類褪綠黃化病毒是近些年來傳入中國(guó)的一種粉虱傳植物病毒 目前在多地已有發(fā)生危害的報(bào) 道 給西瓜 黃瓜 甜瓜等多種葫蘆科作物生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失 本研究中選擇 CCYV 山東 黃瓜分離物作為研究對(duì)象 對(duì)其 RNA1 編碼的 P6 蛋白進(jìn)行了研究 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯 示帶有 YFP 標(biāo)簽的 P6 P6 YFP 在本氏煙葉片細(xì)胞中主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核 致病性測(cè)定結(jié) 果顯示異源病毒載體過量表達(dá) P6 PVX P6 會(huì)誘導(dǎo)寄主植株出現(xiàn)更嚴(yán)重的癥狀 表明 P6 能顯著增 強(qiáng) PVX 的致病性 暗示了 P6 可能參與了病毒的致病相關(guān)進(jìn)程 同時(shí)這也是 CCYV RNA1 組分編碼 的 P6 蛋白定位及致病特征的首次報(bào)道 為后續(xù)深入解析 P6 蛋白功能及其在病毒與寄主互作過程中 的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ) P6 是 1 個(gè)分子量只有 6 kD 的蛋白 在長(zhǎng)線形病毒科 很多成員都會(huì)編碼類似小分子量蛋白 如 P4 9 P6 P8 等 雖然目前這些小分子量蛋白功能大多不明確 但已有研究結(jié)果顯示這些蛋白在 病毒與寄主的互作過程中同樣也發(fā)揮著重要的作用 Alzhanova 等 2000 在研究甜菜黃化病毒 beet yellows virus BYV 時(shí)發(fā)現(xiàn)其編碼的 1 個(gè) 6 kD 蛋白突變后會(huì)導(dǎo)致病毒擴(kuò)散受限 說明 P6 參與了 病毒的運(yùn)動(dòng) 后續(xù)研究揭示其與 HSP70h P64 CP 和 CPm 協(xié)同參與了病毒運(yùn)動(dòng) Peremyslov et al 2004 Qiao et al 2017 Qiao 等 2018 在研究萵苣侵染性黃化病毒 lettuce infectious yellows virus LIYV 時(shí)發(fā)現(xiàn)其編碼的 P9 蛋白突變會(huì)導(dǎo)致病毒在寄主體內(nèi)積累量下降 影響病毒的侵染效率 暗 示了 P9 在病毒的侵染過程中起重要作用 Wei 等 2019 在研究 CCYV 編碼的 P4 9 時(shí)發(fā)現(xiàn)其具有 協(xié)助蛋白在細(xì)胞間擴(kuò)散的功能 可能參與了病毒的運(yùn)動(dòng) 本研究中對(duì) CCYV RNA1 組分編碼的 P6 研究結(jié)果顯示其可以增強(qiáng) PVX 的致病性 誘發(fā)更嚴(yán)重的癥狀 暗示了 P6 也可能在 CCYV 與寄主互 作的過程中發(fā)揮重要作用 Tu Liqin Gan Shexiang Wu Shuhua Ren Chunmei Cheng Zhaobang Zhang Songbai Zhu Yuelin Zhou Yijun Ji Yinghua Characterization of the subcellular localization and pathogenicity of P6 encoded by cucurbit chlorotic yellows virus 1538 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1531 1540 除 CCYV 外 也有毛形病毒屬 Crinivirus 其他一些成員編碼 6 kD 蛋白的報(bào)道 但這些蛋白 在編碼位置及同源性上都與本研究中的 P6 存在較大的差異 而目前針對(duì)該 P6 尚未見相關(guān)功能報(bào)道 本研究在利用 PVX 研究 P6 致病性時(shí)發(fā)現(xiàn) P6 除導(dǎo)致植物出現(xiàn)褪綠黃化等癥狀外 還能誘導(dǎo)植物出 現(xiàn)壞死癥狀 在同屬成員中 已有報(bào)道多個(gè)蛋白會(huì)誘導(dǎo)寄主植株出現(xiàn)壞死癥狀 同時(shí)在病毒侵染擴(kuò) 散及致病等方面都起著重要作用 如 Landeo Rios 等 2017 在研究番茄褪綠病毒時(shí) 發(fā)現(xiàn)使用 PVX 病毒載體過量表達(dá) P22 也會(huì)引起植株壞死 而 P22 是病毒重要的基因沉默抑制子 在病毒侵染過程 中發(fā)揮重要作用 Canizares et al 2008 Qiao 等 2018 在研究 LIYV 時(shí)也發(fā)現(xiàn)使用煙草花葉病 毒載體過量表達(dá) P5 時(shí)會(huì)引起壞死等癥狀 而 P5 蛋白突變后會(huì)明顯的延遲出現(xiàn)病毒癥狀 這些結(jié)果 暗示 P6 可能同樣在病毒與寄主互作的過程中發(fā)揮重要作用 但具體的功能及其作用方式還有待于 進(jìn)一步的研究 References Abrahamian P E Sobh H Abou jawdah Y 2012 First report of cucurbit chlorotic yellows virus on cucumber in Lebanon Plant Disease 96 11 1704 1705 Alzhanova D V Hagiwara Y Peremyslov V V Dolja V V 2000 Genetic analysis of the cell to cell movement of beet yellows closterovirus Virology 268 192 200 Amer M A 2015 Serological and molecular characterization of cucurbit chlorotic yellows virus affecting cucumber plants in Egypt International Journal of Virology 11 1 1 11 Bananej K Menzel W Kianfar N Vahdat A Winter S 2013 First report of cucurbit chlorotic yellows virus infecting cucumber melon and squash in Iran Plant Disease 97 7 1005 1005 Canizares M C Navas Castillo J Moriones E 2008 Multiple suppressors of RNA silencing encoded by both genomic RNAs of 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