高溫脅迫下茄子qRT-PCR 內參基因篩選及穩(wěn)定性分析

園藝學報， 2017， 44 (3)： 475 486. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0831； http： /www. ahs. ac. cn                                                  475 收稿日期 ： 2017 01 09； 修回日期 ： 2017 03 07 基金項目 ： 國家自然科學基金項目 （ 31501755） ； 廣東省自然科學基金項目 （ 2015A030313568） ； 廣東省科技計劃項目 （ 2016B070701010） ；廣州市科技計劃項目（ 2014J4100094， 201510010075）  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： sunbaojuanhotmail.com； sungw1968scau.edu.cn）  高溫脅迫下茄子 qRT-PCR 內參基因篩選及穩(wěn)定性分析  龐強強1,2,3，李植良1，羅少波1，陳日遠2，金慶敏1，黎振興1，李德明3，孫保娟1,*，孫光聞2,*（1廣東省農業(yè)科學院蔬菜研究所，廣州  510640；2華南農業(yè)大學園藝學院，廣州  510642；3海南省農業(yè)科學院蔬菜研究所，?？? 570100）  摘  要： 為篩選茄子 （ Solanum melongena L.）高溫脅迫下穩(wěn)定表達的內參基因，以不同茄子品系（種）為研究對象， 利用實時熒光定量 PCR 技術對來自茄子高溫脅迫轉錄組數據庫 8 個候選內參基因 （ SmEF1a、SmEF2、 Sm40sRPS29、 Sm60sRPL24、 SmTRX、 SmCK I、 SmDAHPS I、 SmUCP）和 SmActin 在不同試驗情況下進行表達檢測，并結合 GeNorm、 NormFinder、 BestKeeper 和 ReFinder 軟件綜合評價 9 個內參基因的表達穩(wěn)定性。結果表明，在茄子熱敏品系 05-1 和耐熱品系 05-4 經高溫處理不同時間的樣品和不同組織樣品以及 10 個耐熱性不同的茄子品系（種）中， 9 個內參基因的表達豐度及穩(wěn)定性存在差異；茄子熱敏品系 05-1 和耐熱品系 05-4 高溫脅迫處理不同時間樣品中表達穩(wěn)定性最好的是 SmEF1a 和 SmUCP；其不同組織中表達水平最穩(wěn)定的是 SmEF1a 和 SmTRX；高溫脅迫下不同茄子品系（種）中以 SmTRX 和 SmEF2的表達穩(wěn)定性最好。綜合來看， SmEF1a 和 SmTRX 在所有茄子試驗樣品中的表達穩(wěn)定性最好，而 SmActin和 SmCK I 的表達穩(wěn)定性較差。  關鍵詞： 茄子；高溫脅迫；內參基因；表達穩(wěn)定性；實時熒光定量 PCR 中圖分類號： S 641.1       文獻標志碼： A        文章編號： 0513-353X（ 2017） 03-0475-12 Selection and Stability Analysis of Reference Gene for qRT-PCR in Eggplant Under High Temperature Stress PANG Qiangqiang1,2,3， LI Zhiliang1， LUO Shaobo1， CHEN Riyuan2， JIN Qingmin1， LI Zhenxing1，LI Deming3， SUN Baojuan1,*， and SUN Guangwen2,*（1Vegetable Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640， China；2Horticultural College， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China；3Vegetable Research Institute， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 570100， China）  Abstract： The present study aimed at selecting the stable reference genes to ensure the reliability and accuracy in gene expression analysis of eggplant（ Solanum melongena L.）  under high temperature stress. By real-time fluorescence quantitative RT-PCR technology， we investigated the expression stability of eight candidate reference genes（ SmEF1a， SmEF2， Sm40sRPS29， Sm60sRPL24， SmTRX， SmCK ，  Pang Qiangqiang， Li Zhiliang， Luo Shaobo， Chen Riyuan， Jin Qingmin， Li Zhenxing， Li Deming， Sun Baojuan， Sun Guangwen. Selection and stability analysis of reference gene for qRT-PCR in eggplant under high temperature stress. 476                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 (3)： 475 486. SmDAHPS ， SmUCP） from RNA-Seq database under high temperature stress and SmActin， and the stability of expression of nine reference genes were evaluated by GeNorm， NormFinder， BestKeeper and ReFinder， respectively. The results showed that， at different periods， different tissues and different lines of eggplant under high temperature， the expression abundance and stability of these nine reference genes are different. When analyzing the gene expression of thermo-sensitive line 05-1 and thermo-resistant line 05-4 under high temperature stress， SmEF1a and SmUCP were the best reference genes for different periods ，and SmEF1a and SmTRX could be used as best reference genes for different tissues. Meanwhile， SmTRX and SmEF2 could be used as best reference genes in lines or varieties with different thermo-tolerance. On the whole， SmEF1a and SmTRX exhibited the most stable expression among all of the tested samples，while SmActin and SmCK exhibited the least stable expression under most of the experimental conditions. It was found to be feasible and efficient to identify stably expressed genes from transcriptome database under high temperature stress as candidate reference genes， which will be helpful for the study of expression of genes response to high temperature and the mechanisms of thermo-tolerance in eggplant. Keywords： Solanum melongena； high temperature stress； reference gene； expression stability；real-time fluorescence quantitative PCR 茄子 （ Solanum melongena L.） 喜溫但不耐熱， 高溫是限制其生長發(fā)育的重要因素之一 （趙雪  等，2014） ，耐熱資源篩選和基因挖掘是茄子育種的重要任務之一。在基于 RNA-Seq 比較基因表達差異以篩選耐熱相關基因的研究過程中，較多地涉及到應用實時熒光定量 PCR（ Real-time fluorescence quantitative PCR， qRT-PCR）技術驗證和分析基因表達模式和水平。 qRT-PCR 的相對定量分析中需要利用表達穩(wěn)定的內參基因進行校正和標準化（ Artico et al.， 2010；萬紅建  等， 2012； Fu et al.，2013） 。一個理想的內參基因應該是組成型表達的基因，其表達不受生長發(fā)育階段和試驗條件的影響（胡瑞波  等， 2009） 。然而，大量的研究表明，任何一種看家基因所謂的恒定表達都只是在一定類型組織或試驗下有范圍的恒定，沒有表達絕對穩(wěn)定的基因（ Huggett et al.， 2005； Zhang et al.， 2007） 。篩選茄子高溫脅迫條件下可用于基因表達分析的穩(wěn)定內參基因對 qRT-PCR 結果可靠性具有關鍵作用。  目前，在茄科作物上常用的有肌動蛋白（ Actin） 、轉錄延伸因子 1（ EF1） 、 18S 核糖體 RNA（ 18S rRNA） 、 3磷酸甘油醛脫氫酶 （ GAPDH） 、 親環(huán)蛋白基因 （ CYP） 、 1,5二磷酸核酮糖羧化酶 （ RuBP） 、腺嘌呤磷酸核糖轉移酶（ APRT）和 微管蛋白基因（ TUA）等內參基因（ Exposito-Rodriguez et al.，2008； Wan et al.， 2011； Wang et al.， 2012； Gantasala et al.， 2013； Lopez-Pardo et al.， 2013） 。在茄子上， Gantasala 等（ 2013）通過對茄子 6 個常用內參基因（ 18sRNA、 APRT、 GAPDH、 CYP、 ACTIN、RuBP）的檢測發(fā)現(xiàn)， 18sRNA、 CYP 和 APRT 在茄子不同組織中的表達穩(wěn)定性最好。周曉慧等（ 2014）在茄子近緣野生種喀西茄（ Solanum aculeatissimum）的研究中發(fā)現(xiàn)， TUA 和 18sRNA 在不同組織中表達穩(wěn)定性最好， 18sRNA 和 ACTIN 在不同植物生長調節(jié)劑處理條件下表達水平最穩(wěn)定， EF1 和GAPDH 在干旱和鹽條件下表達穩(wěn)定性最好， TUA 和 EF1 在所有測試樣品中表達穩(wěn)定性最高。前期作者在采用 qRT-PCR 驗證茄子熱敏品系和耐熱品系高溫脅迫前后基因表達水平時發(fā)現(xiàn)， Actin 作為內參基因易受高溫脅迫的影響，導致試驗結果誤差較大。因此，本研究基于熱敏和耐熱茄子樣本的RNA-Seq 數據，從中挖掘穩(wěn)定表達的基因作為候選內參，并利用 GeNorm、 NormFinder、 BestKeeper和 ReFinder 等 4 種軟件分析候選內參基因在不同材料中的表達穩(wěn)定性，以期篩選出高溫脅迫下茄子中穩(wěn)定表達的內參基因，為后續(xù)的耐熱性相關基因表達研究奠定基礎。  龐強強，李植良，羅少波，陳日遠，金慶敏，黎振興，李德明，孫保娟，孫光聞 . 高溫脅迫下茄子 qRT-PCR 內參基因篩選及穩(wěn)定性分析 . 園藝學報， 2017， 44 (3)： 475 486.                                                                                      477 1  材料與方法  1.1  材料與處理  試驗在廣東省農業(yè)科學院蔬菜新技術研究重點實驗室進行。試驗材料為廣東省農業(yè)科學科院蔬菜研究所經過多年多代自交純化或創(chuàng)制的穩(wěn)定遺傳的材料（孫保娟  等， 2012） 。采用穴盤育苗，當幼苗具有 4 片真葉時移至 27 ， 16 h/8 h（晝 /夜）光照培養(yǎng)箱預培養(yǎng) 3 d，之后開始處理。  試驗共分 3 組，第 1 組為熱敏品系 05-1 和耐熱品系 05-4 用 42 處理 0、 0.5、 1、 2、 4、 6、 12和 24 h，分別取其第 2 片真葉；第 2 組為熱敏品系 05-1 和耐熱品系 05-4 用 42 分別處理 0 和 6 h，分別取其根、莖、葉；第 3 組為熱敏感品系 05-1、 T10、 T18、 T20 和 T22 與耐熱品系 05-4、 T5、T24、 T38 和農夫長茄，用 42 處理 0、 6 和 12 h，取第 2 片真葉。每個處理設 3 次生物學重復。以未進行任何高溫處理的材料作為對照。樣品用液氮速凍，以備 RNA 提取。  1.2  RNA-Seq 數據庫建立  根據前期試驗結果，將熱敏品系 05-1 和耐熱品系 05-4 未經高溫脅迫處理的對照樣品和 42 高溫脅迫處理 6 h 的樣品委托廣州基迪奧生物科技有限公司進行測序分析。 每個樣品測序量約為 2 Gb。通過 oligo（ dT）磁珠法提取 mRNA 序列，建立測序文庫。構建好的文庫使用 Illumina Hiseq 2000TM進行測序。測序的結果（ reads）使用 Trinity 軟件組裝得到 Unigenes，并將組裝結果在數據庫中進行了注釋。以轉錄組序列作為參考，對各樣本進行表達譜分析。將各樣品的測序結果比對到參考序列上，得到了不同樣品中各 Unigene 的表達量信息。  1.3  總 RNA 提取和 cDNA 合成  采用 TransZol Plant 試劑盒 （北京全式金生物技術有限公司） 提取樣品總 RNA， 以各樣品的 1 g總 RNA 為模板，利用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（ Perfect Real Time）試劑盒（寶生物工程有限公司， TaKaRa）去除基因組 DNA 并反轉錄合成 cDNA 第一鏈，于 20 儲藏備用。  1.4  內參基因目的片段的 PCR 擴增檢測  擴增體系 20 L： ddH2O 12.8 L， 10 PCR buffer（含 Mg2+） 2 L， dNTP Mixture（各 2.5 mmol L-1）2 L，正向引物與反向引物（ 10 mol L-1）各 1 L，  cDNA 模板 1 L， TaKaRa Taq（ 5 U） 0.2 L。PCR 反應程序為： 94 預變性 3 min； 94 變性 30 s， 57 退火 10 s， 72 延伸 1 min，循環(huán) 35次； 72 再延伸 7 min。反應結束后，分別取 20 L 產物在 1.2%瓊脂糖上電泳， Goldview 染色后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。  1.5  內參基因熒光定量 PCR 擴增  反應程序按照寶生物公司的 SYBRPremix Ex TaqTM（ Tli RNaseH Plus） 試劑盒說明書要求進行，反應在 CFX96TMReal-Time PCR Detection System（ Bio-Rad）擴增儀上完成，反應條件為： 95 預變性 30 s； 95 變性 5 s， 60 退火 15 s， 72 延伸 15 s， 39 個循環(huán)。熔解曲線程序： 65 加熱至90 ， 5 s。通過熔解曲線分析確定擴增產物的特異性。  1.6  引物設計  從茄子 RNA-Seq 表達譜數據庫中挑選 8 個表達相對穩(wěn)定的基因， 包括轉錄延伸因子 1（ elongation factor 1a， EF1a） 、轉錄延伸因子 2（ elongation factor 2， EF2） 、蛋白激酶 （ casein kinase ， CK ） 、Pang Qiangqiang， Li Zhiliang， Luo Shaobo， Chen Riyuan， Jin Qingmin， Li Zhenxing， Li Deming， Sun Baojuan， Sun Guangwen. Selection and stability analysis of reference gene for qRT-PCR in eggplant under high temperature stress. 478                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 (3)： 475 486. 硫氧還蛋白（ thioredoxin， TRX） 、 40s 核糖體蛋白（ 40s ribosomal protein S29， 40sRPS29） 、 60s 核糖體蛋白（ 60s ribosomal protein L24， 60sRPL24） 、磷酸二羥丙酮合酶 （ phospho-2-dehydro-3- deoxyheptonate aldolase ， DAHPS ）和一個未知功能的（ uncharacterized protein， UCP）基因作為候選內參基因，以肌動蛋白（ Actin）作為對照內參。根據候選內參基因的核苷酸序列和 qRT-PCR設計原則，運用 Primer5.0 軟件設計 9 對特異性引物（表 1） ，由上海生工生物公司合成。  表 1  選取的內參基因引物及擴增長度  Table 1  List of primers and amplified lengths of reference genes under investigation  引物   Primer Unigene/bp 引物序列（ 5 3-）  Primers sequence 長度 /bp  Length SmActin JX524155（ 333）  F： TTACTCATTCACCACCACAGC； R： ACCATCGGGAAGCTCATAGC 145 SmEF1a Unigene 0033899（ 876）  F： CCACACTTCTCATATTGCTGTCA； R： ACCAGCATCACCATTCTTCAAAA 145 SmEF2 Unigene 0032941（ 3 457）  F： TCATGGGTGGTGCTGAGATTATA； R： CTAGCTTCCATGTACAAACGGTT 130 SmCK  Unigene 0033027（ 1 758）  F： CAGGAAGTAGATGGGCAATTGTT； R： CCTCCTATGGATCCCTTCACTAG 101 SmTRX Unigene 0035968（ 857）  F： TATCTTTCAAGTTTTCTCGGCGG； R： GCTTGGAGGAGTTGAAATGAAGT 133 Sm40sRPS29 Unigene 0052057（ 840）  F： CTCTTCTGCCTTGTGAAAGATGG； R： CTGCAGCACATGAGTCCATAC 138 Sm60sRPL24 Unigene 0027788（ 781）  F： GAACTTTGTCGTTTTAGTGGTGC； R： TGTTGTGGAAGTAGTGTTTGCAT 118 SmDAHPS  Unigene 0008432（ 2 031）  F： CAGGGCAAAATGTAACTGAATGC； R： TCGGCTACAATGAAGGAAAGTTC 136 SmUCP Unigene 0048390（ 748）  F： CAACATCAGAAAATTCCAGCAGC； R： TGTTCTTTTGGGTTGGTCAGAAG 108 1.7  數據分析  實時熒光定量 PCR 后，儀器自動得出各樣品 Ct 值，用 GeNorm、 NormFinder 和 BestKeeper 軟件進行各內參基因穩(wěn)定性分析，結合分析結果運用 ReFinder 計算出候選內參基因穩(wěn)定性綜合排名。  2  結果與分析  2.1  候選內參基因在 RNA-Seq 結果中的相對表達量  從 4 個樣本的轉錄組測序結果來看， 8 個（ SmActin 未檢測到）候選內參基因在高溫脅迫前后的表達量相當且具有一定表達豐度，可用于進一步分析（表 2） 。  表 2  候選內參基因對應的 Unigene 及其在 RNA-Seq 表達譜中相對表達量（ RPKM 值）  Table 2  Corresponding Unigenes of candidate reference genes and their RPKM values in samples by RNA-Seq 05-1（熱敏  thermo-sensitive）  05-4（耐熱  thermo-resistant）  候選內參基因  Candidate reference gene Unigene 序列號  Unigene accession 對照  Control 42  6 h 對照  Control 42  6 h SmEF1a Unigene 0033899 243.84 246.75 254.33 243.27 SmEF2 Unigene 0032941 262.76 291.02 268.28 274.45 SmCK  Unigene 0033027 32.12 32.18 34.34 32.66 SmTRX Unigene 0035968 65.64 64.73 64.93 62.42 Sm40sRPS29 Unigene 0052057 333.27 333.92 335.37 336.15 Sm60sRPL24 Unigene 0027788 74.52 72.66 78.45 76.78 SmDAHPS  Unigene 0008432 314.64 312.43 311.21 301.99 SmUCP Unigene 0048390 233.83 240.15 226.74 224.44 SmActin None        2.2  茄子內參基因的 PCR 檢測  由圖 1 可以看出， 9 個候選內參基因的 PCR 結果均可見與預期大小相同的產物，且條帶單一，說明不存在引物二聚體和非特異性擴增，可用于后續(xù) qRT-PCR 分析。  龐強強，李植良，羅少波，陳日遠，金慶敏，黎振興，李德明，孫保娟，孫光聞 . 高溫脅迫下茄子 qRT-PCR 內參基因篩選及穩(wěn)定性分析 . 園藝學報， 2017， 44 (3)： 475 486.                                                                                      479 圖 1  茄子 9 個候選內參基因的 RT-PCR 擴增結果  Fig. 1  Specificity of 9 candidate reference genes for RT-PCR amplification 2.3  茄子內參基因的熒光定量 PCR 分析  以茄子 cDNA 為模板，進行熒光定量 PCR 分析，結果表明， 9 個候選內參基因在不同試驗條件下的熔解曲線都只有單一主峰，沒有其他雜峰出現(xiàn)，重復樣品之間擴增曲線重復性高（圖 2） 。  圖 2  9 個候選內參基因 qRT-PCR 熔解曲線  Fig. 2  Melting curves of 9 candidate reference genes for qRT-PCR amplification 內參基因 Ct 值在不同樣品中表達穩(wěn)定性是選擇內參的重要標準。通過分析發(fā)現(xiàn)，每個內參基因在不同處理樣品中的表達豐度均存在差異?；虻?Ct 值越小，其表達豐度越高，反之越低。在試驗所涉及到的所有茄子樣品中，候選內參基因的平均 Ct 值在 19.15 28.35。  在熱敏品系 05-1 和耐熱品系 05-4 中， 候選內參基因在熱處理不同時間段的 Ct 值在 19.33 28.04之間 （圖 3） ， 其中 SmCK 的 Ct 值最大， 表達豐度最低， 這與 RNA-seq 表達譜中相對表達量 （ RPKM值）結果（表 2）相符。  Pang Qiangqiang， Li Zhiliang， Luo Shaobo， Chen Riyuan， Jin Qingmin， Li Zhenxing， Li Deming， Sun Baojuan， Sun Guangwen. Selection and stability analysis of reference gene for qRT-PCR in eggplant under high temperature stress. 480                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 (3)： 475 486. 圖 3  候選內參基因在茄子熱敏品系 05-1 和耐熱品系 05-4 高溫處理不同時間中的 Ct 平均值  Fig. 3  The average Ct values of thermo-sensitive line 05-1 and thermo-resistant line 05-4 at  different period of high temperature treatment 如圖 4 所示， 內參基因在高溫處理 0 和 6 h 在熱敏品系 05-1 和耐熱品系 05-4 不同組織 （根、 莖、葉）中的 Ct 介于 19.15 28.35 之間，其中以 Sm40sRPS29 的 Ct 值最小，表達豐度最大。  圖 4  候選內參基因在茄子熱敏品系 05-1 和耐熱品系 05-4 高溫處理 0 和 6 h 不同組織中的 Ct 平均值  Fig. 4  The average Ct values of different tissues of thermo-sensitive line 05-1 and thermo-resistant line 05-4  treated with high temperature for 0 and 6 h 如圖 5 所示， 10 個茄子品系 （種） 中候選內參基因在高溫處理不同時間的 Ct 值介于 19.56 27.26之間，其中 SmCK 最大，表達豐度最小。此外還發(fā)現(xiàn)，這些內參基因在這 3 組處理樣品中的表達變化并沒有一定的規(guī)律性。  圖 5  候選內參基因在 10 個茄子品系（種）高溫處理 0、 6 和 12 h 的 Ct 平均值  Fig. 5  The average Ct values of ten eggplant lines（ varieties） treated with high temperature for 0， 6 and 12 h 龐強強，李植良，羅少波，陳日遠，金慶敏，黎振興，李德明，孫保娟，孫光聞 . 高溫脅迫下茄子 qRT-PCR 內參基因篩選及穩(wěn)定性分析 . 園藝學報， 2017， 44 (3)： 475 486.                                                                                      481 2.4  內參基因的表達穩(wěn)定性評價  2.4.1  GenNorm 軟件分析  GenNorm 是常用的內參分析軟件， 根據計算出的候選內參基因在不同樣品中的表達穩(wěn)定性 （ M）來確定最穩(wěn)定的內參基因， M 值越大，表明穩(wěn)定性越低； M 值越小，穩(wěn)定性越高，其中 M = 1.5 是上限（ Vandesompele et al.， 2002） 。  如表 3 所示， 9 個內參在不同的茄子樣品中穩(wěn)定性存在差異。熱敏品系 05-1 和耐熱品系 05-4在 42 高溫處理不同時間段，表達最為穩(wěn)定的內參基因是 SmEF1a 和 SmUCP；在其高溫處理 0 和6 h 的根、莖和葉中，表達最穩(wěn)定的是 SmCK 和 SmEF1a；在 10 個不同品系（種）高溫處理 0、 6和 12 h 中表達穩(wěn)定性最好的是 SmEF2 和 SmTRX。在所有試驗條件下，內參基因 SmActin 的表達穩(wěn)定性較差。  表 3  GeNorm 軟件分析 9 個候選內參基因在茄子不同試驗條件下的表達穩(wěn)定性  Fig. 3  GeNorm ranking of the 9 candidate reference genes with respect to their expression stability  under different experimental conditions 不同時間 Different periods  不同組織 Different tissues  不同品系（種） Different lines（ varieties）內參基因  Reference gene M 排序  Rank  M 排序  Rank  M 排序  Rank SmActin 1.345 9 1.339 4 0.959 9 SmEF1a 0.664 1 1.140 2 0.719 6 SmEF2 0.760 6 1.774 7 0.650 1 SmCK  0.789 8 1.127 1 0.871 8 SmTRX 0.768 7 1.961 8 0.651 2 Sm40sRPS29 0.733 4 1.370 6 0.698 4 Sm60sRPL24 0.725 3 1.266 3 0.716 5 SmDAHPS  0.733 4 1.360 5 0.742 7 SmUCP 0.697 2 2.814 8 0.655 3 2.4.2  NormFinder 軟件分析  NormFinder 軟件是結合組內方差與組間方差計算候選內參基因的穩(wěn)定值來對其進行評價，穩(wěn)定值越小，內參基因表達就越穩(wěn)定；反之則越不穩(wěn)定（ Andersen et al.， 2004） 。  如表 4 所示，在熱脅迫處理不同時間段，表達最為穩(wěn)定的內參基因是 SmEF1a，其 次 是 SmUCP；不同組織中， SmEF1a 的穩(wěn)定性最好，其次是 Sm60sRPL24；不同品系（種）中表達穩(wěn)定性最好的是SmTRX 和 SmUCP。  表 4  NormFinder 軟件分析 9 個候選內參基因在茄子不同試驗條件下的表達穩(wěn)定性  Fig. 4  NormFinder ranking of the 9 candidate reference genes with respect to their expression stability  under different experimental conditions 不同時間 Different periods 不同組織 Different tissues 不同品系 （種） Different lines（ varieties）內參基因  Reference gene M 排序  Rank M 排序  Rank M 排序  Rank SmActin 0.880 9 1.872 9 0.036 9 SmEF1a 0.197 1 0.123 1 0.025 7 SmEF2 0.379 8 0.965 7 0.016 2 SmCK  0.363 7 0.542 6 0.029 8 SmTRX 0.360 5 1.195 8 0.015 1 Sm40sRPS29 0.360 5 0.489 4 0.021 4 Sm60sRPL24 0.331 4 0.123 2 0.022 5 SmDAHPS  0.308 3 0.275 3 0.024 6 SmUCP 0.263 2 0.541 5 0.016 2 Pang Qiangqiang， Li Zhiliang， Luo Shaobo， Chen Riyuan， Jin Qingmin， Li Zhenxing， Li Deming， Sun Baojuan， Sun Guangwen. Selection and stability analysis of reference gene for qRT-PCR in eggplant under high temperature stress. 482                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 (3)： 475 486. 2.4.3  BestKeeper 軟件分析  BestKeeper 可通過計算標準偏差（ SD）和變異系數（ CV）來篩選最穩(wěn)定的內參基因，其中標準差和變異系數越小，穩(wěn)定性越好；反之，穩(wěn)定性越差（ Pfaffl et al.， 2004） 。  如表 5 所示，不同時間條件下候選內參基因 SmActin、不同組織條件下的 SmActin、 SmEF2 和SmTRX 的標準差都大于 1，根據 BestKeeper 的選擇標準，這些基因的表達都不穩(wěn)定。在不同時間段表達最為穩(wěn)定的候選內參基因是 SmTRX， 其次是 SmEF2； 在不同組織中 SmEF1a 的表達穩(wěn)定性最好，其次是 Sm60sRPL24；不同品系（種）中表達穩(wěn)定性最好的是 SmTRX 和 SmEF2。  表 5  BestKeeper 軟件分析 9 個候選內參基因在茄子不同試驗條件下的表達穩(wěn)定性  Fig. 5 BestKeeper ranking of the 9 candidate reference genes with respect to their expression stability  under different experimental conditions 不同時間段  Different