甘薯褪綠矮化病毒RNaSe3蛋白的原核表達及抗血清制備.pdf

 2 0 1 8 , 4 4 （ 3 ） ： 1 3 8 1 4 1 PlantProtection 研 究 簡 報 ReSearchNoteS 收 稿 日 期 ：2017 08 08    修 訂 日 期 ：2017 10 09 基 金 項 目 ：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)甘薯產(chǎn)業(yè)技術體系 （ CARS-10-B13 ） ； 河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目 （豫財貿 2015 131-06 ） ；河南省農(nóng)業(yè)科學 院優(yōu)秀青年基金 （ 2016YQ14 ） ； 河南省自然科學基金 （ 162300410160 ） ； 河南省重點實驗室項目 （ 132300413220 ） * 通信作者 E-mail ： zhangzhenchen 126. com 甘 薯 褪 綠 矮 化 病 毒 RNaSe3 蛋 白 的 原 核 表 達 及 抗 血 清 制 備 秦 艷 紅 ，喬奇 ，王爽 ，張 德 勝 ，王 永 江 ，田 雨 婷 ，張 振 臣 * （河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 ，河南省農(nóng)作物病蟲害防治重點實驗室 ， 農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點實驗室 ，鄭州450002 ） 摘 要以 本 實 驗 室 保 存 的 重 組 質 粒 為 模 板 ， 利 用 PCR 方 法 擴 增 獲 得 了 甘 薯 褪 綠 矮 化 病 毒 SPCSV 的 RNase3 基 因 ， RNase3 基 因 由 690 個 核 苷 酸 組 成 ， 編 碼 229 個 氨 基 酸 。 將 RNase3 基 因 克 隆 到 原 核 表 達 載 體 pET-28a （ + ） ， 轉 化 大 腸 桿 菌 BL21 （ DE3 ） ， 經(jīng) IPTG 誘 導 ， 對 誘 導 產(chǎn) 物 進 行 SDS-PAGE 分 析 。 結 果 表 明 ， RNase3 在 大 腸 桿 菌 中 能 高 效 表 達 ， 融 合 蛋 白 分 子 量 約 為 26. 5kD 。 以 表 達 的 融 合 蛋 白 為 抗 原 ， 免 疫 家 兔 ， 制 備 了 SPCSV-RNase3 的 特 異 性 抗 血 清 。 ACP-ELISA 檢 測 結 果 表 明 ， 制 備 的 抗 血 清 對 RNase3 融 合 蛋 白 的 效 價 達 10 萬 倍 。 關 鍵 詞甘 薯 褪 綠 矮 化 病 毒 ；RNase3 基 因 ；原 核 表 達 ；抗 血 清 中 圖 分 類 號 ：S432. 41   文 獻 標 識 碼 ：A  DOI ：10. 16688 j. zwbh. 2017298 Prokar y oticex p ressionofRNase3ofSweet p otato chlorotic stunt virus and p re p arationofitsantiserum QINYanhong ，QIAOQi ，WANGShuang ，ZHANGDesheng ， WANGYongjiang ，TIANYuting ，ZHANGZhenchen （ InstituteofPlantProtestion ， HenanAsademyofAgrisulturalSsienses ， HenanKeyLaboratoryof CropPestControl ， KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonCropsinSouthernPartof NorthChina ， MinistryofAgrisulture ， Zhengzhou 450002 ， China ） Abstract Withtherecombinantplasmidstoredinourlaboratoryastemplate ， RNase3geneofSweetpotatoshlo- rotisstuntvirus （ SPCSV ） wasamplifiedbyPCR.Thefull-lengthRNase3geneconsistsof690ntandencodes229 aminoacidresidues.TheRNase3genewasclonedintoexpressionvectorpET-28a （ + ） forover-expressioninpro- karyoticcells.TherecombinantplasmidpET-RNase3wastransformedintoEssherishiasoli strainBL21 （ DE3 ） competentcells.SDS-PAGEresultshowedthatspecificfusionproteinwiththemolecularweightofabout26. 5kD wasproducedafterinductionbyIPTG ， indicatingthattheRNase3fusionproteinwashighlyexpressedinprokary- oticcells.TheexpressedproteinwaspurifiedfromSDS-PAGEandtheantiserumagainstRNase3 proteinwas raisedinrabbit.ACP-ELISAdetectionindicatedthatthetiterofRNase3antiserumwasover1100000against RNase3fusionprotein. Keywords Sweetpotatoshlorotisstuntvirus ；RNase3gene ；prokaryoticexpression ；antiserum甘薯是重要的糧食作物 、食品加工原料和新型 能源作物 。我國甘薯種植面積位居世界第一 1 。病 毒病對甘薯產(chǎn)業(yè)造成很大影響 。研究表明 ，我國甘 薯上至少存在甘薯褪綠矮化病毒 Sweetpotatochlo- roticstuntvirus （ SPCSV ）和甘薯羽狀斑駁病毒 Sweetpotatofeatherymottlevirus （ SPFMV ）等 20 余種病毒 2 6 。 SPCSV 與 SPFMV 共同侵染可引起 甘薯復合病毒病 （ Sweetpotatovirusdisease ， SPVD ） ， 44 卷第 3 期 秦艷紅等 ：甘薯褪綠矮化病毒 RNase3 蛋白的原核表達及抗血清制備 該病可使甘薯減產(chǎn) 50% 98% ，甚至絕收 7 。 2010 年 ， Qiao 等首次報道了 SPCSV 在我國發(fā)生 8 。 2012 年 ，張振臣等首次證明我國甘薯上已發(fā)生 SPVD 9 。近年來 ， SPCSV 在我國的發(fā)生面積逐漸 擴大 ，在全國范圍內迅速蔓延 ，對甘薯的危害日趨嚴 重 ，是甘薯上危害最嚴重的病毒之一 。 SPCSV 隸屬長線形病毒科 Closteroviridae 毛 形病毒屬 Crinivirus ，基因組為兩條單鏈正義 RNA ， RNA1 編碼蛋白主要參與病毒的復制 ， RNA2 編碼蛋 白主要負責病毒的包裝和運輸 。 RNA1 上編碼的 RNase3 蛋白是其基因沉默抑制子 ， RNase3 蛋白包含 一個核糖核酸內切酶結構域和一個雙鏈 RNA 結合結 構域 ， RNase3 可以抑制由正義 RNA 介導的 RNA 干 擾 （ RNAi ） ， 在體外 ， RNase3 可以將 21 、 22 和 24nt 的 siRNA 切割成 14nt ， RNase3 的核糖核酸內切酶活性 對其沉默抑制活性是必需的 11 。 RNase3 蛋白還能夠 增強 p22 蛋白的沉默抑制活性 12 ，研究表明 ， RNase3 單獨即可介導 SPCSV 與 SPFMV 等其他病毒的協(xié)生 作用 11 。目前 ， 對 SPVD 致病機理方面的研究還較薄 弱 ， 關于 SPCSV 與 SPFMV 等病毒協(xié)生作用的分子 機理還不十分清楚 ， 因此 ，本研究針對 SPCSV 編碼的 RNase3 這一重要蛋白 ，利用原核表達的策略 ，在大腸 桿菌中表達了 RNase3 的融合蛋白 ，制備了 SPCSV RNase3 的多克隆抗體 。 1  材 料 與 方 法 1. 1  材 料 大腸桿菌 JM109 和 BL21 （ DE3 ）菌株 ，含 RNase3 基因的重組質粒 SPCSV-RNA1-4410-8637-T 10 和 原核表達載體 pET-28a （ + ）均由本實驗室保存 ； UNIQ-10 柱式 DNA 膠回收試劑盒購自 Axygen 公 司 ；氨芐青霉素 （ Amp ） 、卡那霉素 （ Kan ） 、 IPTG 和 SDS 等購自上海生工生物工程有限公司 ； 質粒小量抽 提試劑盒購自 Omega 生物科技公司 ； ExTaq DNA 聚 合酶 、 限制性內切酶 、 T4DNA 連接酶 、 DNA 分子量標 準和蛋白質分子量標準等購自寶生物工程 （大連 ）有 限公司 ； 其他常用試劑為國產(chǎn)分析純 。 根據(jù)本實驗室測定的重組質粒序列 10 ，設計擴 增 RNase3 基因的引物 ，正向引物 RNase3-BamH - 5F 的序列為 5 -CGTGGATCCATGATTCCGATC- TTTTCTGAT-3 ） ，與 RNase3 基因的 1-21nt 位 置對應并引入 BamH 酶切位點 ，反向引物 RNase3- Hind -3R 的序列為 5 -GGCAAGCTTTCAAT- TCAAATTTAGAGCTTCGAC-3 ，與 RNase3 的終 止密碼子附近序列互補并引入了 Hind 酶切位點 ， 引物由上海生工生物工程技術有限公司合成 。 1. 2  方 法 1. 2. 1 SPCSVRNase3 基 因 的 PCR 擴 增 以重組質粒 SPCSV-RNA1-4410-8637-T 為模 板 ，以 RNase3-BamH -5F 和 RNase3-Hind -3R 為引物進行 PCR 擴增 。 PCR 反應體系為 ：正 、反向 引物各 1 L ， 2. 5mmol L 的 dNTP 混合物 4 L ， 10 ExTaqbuffer5 L ， ExTaqDNA 聚合酶 0.5 L ， 重組質粒 1 L ， ddH2O37.5 L 。 PCR 反應程序 為 ： 94 預變性 5min ； 94 變性 30s ， 58 退火 30s ， 72 延伸 40 s ，共 30 個循環(huán) ； 72 延伸 10 min 。 PCR 產(chǎn)物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 ，按照 Axygen 公司 UNIQ-10 柱式 DNA 膠回收試劑盒的說明書 回收目的片段 。 1. 2. 2 SPCSVRNase3 基 因 原 核 表 達 載 體 的 構 建 及 序 列 測 定將 1.2.1 中的膠回收產(chǎn)物用 BamH 和 Hind 酶切后與相應酶切的 pET-28a （ + ）載體連接 。將 連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌 JM109 ，提取質粒 ，經(jīng) PCR 擴增和酶切篩選出重組質粒 ，將重組質粒 pET-RNase3 送上海生工生物工程技術有限公司測 序以驗證閱讀框架的正確性 。 1. 2.3 SPCSVRNase3 蛋 白 的 誘 導 表 達 及 SDS- PAGE 分 析將讀框正確的重組質粒 pET-RNase3 及空載體 pET-28a （ + ）轉化大腸桿菌 BL21 （ DE3 ） ，挑取單菌 落于 2mLLB 培養(yǎng)液中 （含 100 g mLKan ） ， 37 振蕩培養(yǎng)過夜 ，將過夜培養(yǎng)的菌液按 1100 稀釋到 新鮮的 LB 培養(yǎng)液中 （含 100 g mLKan ） ，振蕩培 養(yǎng)至 OD600 達到 0.6 以上 ，加入 IPTG 至終濃度為 1mmol L ， 于 37 繼續(xù)誘導 6 8h 。取 1.5mL 培 養(yǎng)液 ， 經(jīng) 10000r min 離心 1min 收集菌體 ，用 50 L 滅菌 ddH2O 懸浮 ，加入 50 L2 的樣品緩沖液 （ 40mmol LTris-HCl ， 10% 甘油 ， 2%SDS ， 5% 巰基 乙醇 ， 0.1% 溴酚藍 ， pH 6.8 ） ，顛倒混勻后 ，煮沸 10min ，用 12. 5% 的膠進行 SDS-PAGE 分析 。 1. 2. 4 SPCSVRNase3 抗 血 清 的 制 備 和 效 價 測 定 1. 2. 3 中的原核表達產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE 電泳后 ， 將凝膠用預冷的染色液 （ 0. 25mol LKCl ， 1mmol L 9 3 1 2018 DTT ） 染色至條帶清晰 ，切下所需的蛋白條帶 ，加入等 體積 0. 85% 的生理鹽水 ， 于冰浴中研磨 。 12000r min 離心 5min ，收集上清即為回收到的蛋白 。利用回收 的蛋白免疫家兔 ，經(jīng)過 6 次免疫后 ，獲得抗血清 。利 用 ACP-ELISA 對抗血清進行效價測定 。免疫家兔 等工作由鄭州博賽生物技術公司協(xié)助完成 。 2  結 果 與 分 析 2. 1 SPCSVRNaSe3 基 因 原 核 表 達 載 體 構 建 及 表 達 產(chǎn) 物 SDS-PAGE 分 析利用 PCR 擴增獲得大小約為 690bp 目的條 帶 ，將目的片段割膠回收 ，將膠回收產(chǎn)物和 pET-28a （ + ）質粒分別利用 BamH 和 Hind 酶切后進行 連接 ，轉化大腸桿菌 JM109 ，菌液 PCR 驗證為陽性 的樣品 ，提取質粒后再進行酶切鑒定 （圖 1a ） ，并送 上海生工生物工程有限公司測序 ，證明閱讀框架正 確 ，表明原核表達載體 pET-RNase3 構建成功 。 將 pET-RNase3 和 pET-28a （ + ）分別轉化至大 腸桿菌 BL21 （ DE3 ）中 ，利用 IPTG 誘導表達 ，分別 以未誘導的 pET-RNase3 和誘導的 pET-28a （ + ）為 對照 。經(jīng)過 SDS-PAGE 分析表明 ，含有重組質粒的 工程菌誘導后可產(chǎn)生大小約為 26.5kD 的目的蛋 白 ，而對照沒有相應條帶 （圖 1b ） ，表明 RNase3 在大 腸桿菌中得到了表達 。 圖 1 pET-RNaSe3 重 組 質 粒 的 酶 切 鑒 定 及 表 達 產(chǎn) 物 的 SDS-PAGE 電 泳 分 析 Fig. 1 EnzymedigeStionofrecombinantplaSmidpET- RNaSe3andSDS-PAGEanalySiSofexpreSSionproductS 2. 2 SPCSVRNaSe3 抗 血 清 的 制 備 和 效 價 測 定 以純化的重組蛋白作為抗原免疫家兔 ，經(jīng)過 6 次免疫后獲得了 SPCSV-RNase3 的抗血清 ，以 RNase3 的融合蛋白為抗原 ，利用 ACP-ELISA 對抗血 清的效價進行測定 ， 結果表明 ， 抗血清稀釋 100000 倍 后仍能與抗原發(fā)生陽性反應 （表 1 ） 。 表 1 ACP-ELISA 測 定 抗 血 清 的 效 價 1 ） Table1 ThetiterofantiSerumteStedbyACP-ELISA 樣品稀釋倍數(shù) Dilutionmultiple ofsample OD405 重復 1 Repeat1 重復 2 Repeat2 平均 Average I H 檢測結果 Detection result 1000 1. 552 1. 274 1. 413 1333 陽性 3000 1.173 1.140 1.157 1076 陽性 5000 1. 028 0. 958 0. 993 913 陽性 10000 0. 925 0. 765 0. 845 765 陽性 30000 0. 791 0. 718 0. 755 674. 5 陽性 50000 0. 645 0. 618 0. 632 551. 5 陽性 100000 0. 606 0. 380 0. 494 413. 5 陽性 陽性對照 Positivecontrol 0. 569 0. 507 0. 538 458 陽性 陰性對照 Negativecontrol 0. 082 0. 080 0. 081 1 陰性 空白對照 Blankcontrol 0. 080 0. 080 0. 080 - -1 ） OD405= 在 405nm 的光吸收值 ； I H= （ 樣品平均吸光值 - 空白對 照平均吸光值 ） （ 健康對照平均吸光值 - 空白對照平均吸光值 ） 。 OD405=Absorptionvalueat405nmwavelength ； I H= （ aver- ageabsorptionvalueofsample-averageabsorptionvalueof blankcontrol ） （ averageabsorptionvalueofhealthycontrol- averageabsorptionvalueofblankcontrol ） . 3  討 論 研究表明 ， SPCSV 可以與多種甘薯病毒發(fā)生協(xié) 生作用 ，使甘薯的癥狀加重 ，其他病毒的含量增 加 13 16 ， RNase3 介導了這一過程 。表達植物病毒 蛋白最常見的就是大腸桿菌表達體系 ，它具有產(chǎn)量 高 、成本低 、生產(chǎn)周期短 、表達穩(wěn)定等優(yōu)點 ，本研究利 用原核表達的方法制備了 SPCSV-RNase3 蛋白的 抗血清 ，該抗血清對 RNase3 融合蛋白的效價可達 100000 以上 ，可以用于 RNase3 融合蛋白的檢測 。 利用純化的重組蛋白制備多克隆抗體 ，是目前 抗體研究中普遍采用的一種方法 ，制備的抗體可以 用于內源蛋白的表達水平分析 、蛋白質的體外互作 分析 、免疫膠體金定位分析等試驗 17 。因此 ，下一 步可以通過 Westernblot 技術利用制備的特異性抗 體對 RNase3 在甘薯不同部位的分布和表達量的差 異開展研究 ；另外 ，還可以通過酵母雙雜交技術篩選 與 SPCSV-RNase3 互作的其他協(xié)生病毒蛋白或寄 主因子 ，將表達的融合蛋白應用于 RNase3 蛋白與 其他蛋白的體外互作驗證 。本研究為后續(xù) SPCSV 0 4 1 44 卷第 3 期 秦艷紅等 ：甘薯褪綠矮化病毒 RNase3 蛋白的原核表達及抗血清制備 的致病機理研究提供了材料 ，為探索新的抗病毒策 略奠定基礎 。 參 考 文 獻 1 MAD ， LIHM ， TANGJ ， etal.Currentstatusandfuturepros- pectsofdevelopmentofsweetpotatoindustryinChina C Sweet PotatoinFoodandEnergySecurity ： ProceedingsofChinaXuzhou 4thInternationalSweetPotatoSymposium4thChina-Japan-Ko- reaSweetPotatoWorkshop.Xuzhou ， China ， 2010 ： 3 10. 2 喬奇 ，張振臣 ，張德勝 ，等 . 中國甘薯病毒種類的血清學和分子 檢測 J . 植物病理學報 ， 2012 ， 42 （ 1 ） ： 10 16. 3 QINYH ， LIXC ， ZHANGZC ， etal.Firstreportofsweetpo- tatobadnavirusAinChina J . 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