牡丹SERK2基因的克隆和花芽休眠進(jìn)程中細(xì)胞分裂頻率分析.pdf

園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 511 518. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0387； http： /www. ahs. ac. cn                                                  511 收稿日期 ： 2017 09 07； 修回日期 ： 2018 02 28 基金項(xiàng)目 ： 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ 31471908， 31372104）  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： spgaiqau.edu.cn）  牡丹 SERK2 基因的克隆和花芽休眠進(jìn)程中細(xì)胞分裂頻率分析  高學(xué)凱，張玉喜，劉春英，竇寶磊，蓋樹鵬*（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島  266109）  摘  要： 根據(jù)牡丹休眠相關(guān)的差減文庫(kù)中篩選得到的類體細(xì)胞胚胎發(fā)生受體蛋白激酶基因 SERK2 的部分 cDNA 片段，采用 RACE 技術(shù)擴(kuò)增到 5和 3 cDNA 片段，通過(guò)拼接得到 PsSERK2 基因 2 374 bp 的全長(zhǎng) cDNA 序列，其中 5非編碼區(qū)（ UTR）為 158 bp， 3UTR 為 341 bp， ORF 為 1 875 bp，編碼 625 個(gè)氨基酸。同源性分析得出其與葡萄 VvSERK2 蛋白同源性最高，為 92.95%。 PsSERK2 在初花期（大風(fēng)鈴期）莖中表達(dá)量最高，葉片中最低。 Northern 雜交和定量 PCR 結(jié)果均表明 PsSERK2 在低溫解除牡丹花芽休眠前期上調(diào)表達(dá)，而后降低。低溫累積過(guò)程中，花芽?jī)?nèi)各個(gè)組織細(xì)胞分裂頻率逐漸增加。推測(cè) PsSERK2 上調(diào)表達(dá)促進(jìn)了休眠花芽的發(fā)育，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)休眠的解除。  關(guān)鍵詞： 牡丹； PsSERK2； RACE；基因表達(dá)；分裂頻率  中圖分類號(hào)： S 685.11        文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A         文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 03-0511-08 Cloning of Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase Gene PsSERK2 and Cell Division Rate Analysis During Dormancy Release in Tree Peony （ Paeonia suffruticosa）  GAO Xuekai， ZHANG Yuxi， LIU Chunying， DOU Baolei， and GAI Shupeng*（ College of Life Sciences， Qingdao Agricultural University， Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province， Qingdao， Shandong 266109， China）  Abstract： According to the partial sequences of potential SERK2 gene screened from suppression subtractive hybridization library， two specific primers were designed and used for 5 and 3 RACE amplification in this experiment. A 2 374 bp full length cDNA sequence was obtained with 158 bp 5 untranslated region（ UTR） ， 341 bp 3 UTR， and contained a complete ORF with 1 875 bp encoding 625 amino acids. The highest homology with PsSERK2 was VvSERK2 in Vitis vinifera with 92.95% similarity. The results of real-time PCR indicated that the highest expression level of PsSERK2 was detected in the elongating stem and the lowest in expanded leaf at the big bell-like flower-bud of tree peony， the early stage of flowering. Northern blot and fluorescence real-time PCR analysis revealed PsSERK2 was up-regulated during early chilling treatment and then declined after dormancy release. Histological observation showed that the cell division rate increased and the number of cells increased gradually during  Gao Xuekai， Zhang Yuxi， Liu Chunying， Dou Baolei， Gai Shupeng. Cloning of somatic embryogenesis receptor-like kinase gene PsSERK2 and cell division rate analysis during dormancy release in tree peony（ Paeonia suffruticosa） . 512                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 511 518. the dormancy of tree peony. Our results indicated that PsSERK2 might promote the postdevelopment of flower organ， and subsequently induce the dormancy release. Keywords： Paeonia suffruticosa； PsSERK2； RACE； gene expression； division frequency 富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶（ leucine-rich repeat receptor-like protein kinase， LRR-RLK）是最大的一類具有典型的胞外結(jié)合域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶域結(jié)構(gòu)的植物類受體蛋白激酶（ receptor- like protein kinase， RLK） ，能獨(dú)立完成信號(hào)的接收、跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)及向胞內(nèi)傳遞，在植物生命活動(dòng)中起多種作用（ Becraft， 1998； Zhang， 1998） 。 LRR-RLK 被劃分成 13 個(gè)亞類，其中體細(xì)胞胚胎發(fā)生受體蛋白激酶 SERK（ somatic embryogenesis receptor-like kinase）屬于第 2 亞類，參與植物發(fā)育、激素感應(yīng)和病理反應(yīng)等（ Becraft， 2002） 。到目前為止，相繼在多種植物如擬南芥（ Hecht et al.， 2001） 、玉米（ Baudino et al.， 2001） 、苜蓿（ Nolan et al.， 2003）等，克隆得到了 SERK 基因。  牡丹（ Paeonia suffruticosa Andr.）的花期調(diào)控是其研究和生產(chǎn)中的主要內(nèi)容之一，但傳統(tǒng)方法常有效果不佳甚至失敗的情況發(fā)生（劉波  等， 2004） 。牡丹花芽的休眠是典型的內(nèi)休眠，解除休眠是花期調(diào)控成功的關(guān)鍵（ Bonhomme et al.， 2000） ，因而解析休眠解除機(jī)理具有重要的科學(xué)意義。Huang 等（ 2008）以牡丹為材料，通過(guò)差減雜交的方法分離到花芽休眠解除相關(guān)的基因 SERK2 的部分片段。本研究在此基礎(chǔ)上克隆 PsSERK2 全長(zhǎng) cDNA 序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，檢測(cè)其在休眠解除進(jìn)程中和初花期（大風(fēng)鈴期）牡丹不同組織中的表達(dá)情況，并分析了休眠解除過(guò)程中花芽?jī)?nèi)的細(xì)胞分裂速率變化， 研究結(jié)果可為進(jìn)一步探討 PsSERK2 在牡丹花芽休眠解除調(diào)控中的分子機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。  1  材料與方法  1.1  試驗(yàn)材料   2015 年 10 月，以 4 5 年生魯菏紅牡丹（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)品種圃）健壯植株為試驗(yàn)材料。待日平均氣溫降到 10 左右，將盆栽植株放入于 0 4 冷庫(kù)中，每 7 d 將 30 株轉(zhuǎn)移至 18 22 的溫室中（ 3 次重復(fù)，每重復(fù) 10 株） ，共 5 個(gè)低溫處理時(shí)間（即低溫處理 0、 7、 14、 21 和 28 d） 。取頂花芽用于基因表達(dá)和組織細(xì)胞學(xué)觀察分析。取初花期（大風(fēng)鈴期）的不同組織（根、莖、葉、萼片、苞片、花瓣、雄蕊、心皮）的樣品于 80 保存，用于基因組織表達(dá)分析。  1.2  RNA 提取、 cDNA 合成和 RACE 擴(kuò)增   采用原平皓（天津）生物技術(shù)有限公司的 EASYspin 植物 RNA 快速提取試劑盒提取總 RNA， 80 保存。按照 SMART RACE cDNA synthesis Kit 說(shuō)明書進(jìn)行 5 和 3 RACE-ready-cDNA 的合成。根據(jù)反應(yīng)中對(duì) PCR 引物的要求和類 SERK2 的部分 cDNA 序列（ EU072923） ，設(shè)計(jì)特異性引物PsSERK2 5（ 5-CGAAGAAAACGCAGCCTTGTCAGC-3） 和 PsSERK2 3（ 5-GCTGTTGTAGGTGAC TTTGGGTTGGC-3）用于擴(kuò)增 5和 3端的 cDNA 序列。將擴(kuò)增得到的目的片段連接 pMD 18-T 載體過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定后送上海桑尼生物公司測(cè)序。  1.3  生物信息學(xué)分析  測(cè)序結(jié)果用 DNAMAN 進(jìn)行序列拼接、分析開放閱讀框及編碼氨基酸序列；利用 http： /expasy. 高學(xué)凱，張玉喜，劉春英，竇寶磊，蓋樹鵬  牡丹 SERK2 基因的克隆和花芽休眠進(jìn)程中細(xì)胞分裂頻率分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 511 518.                                                                                       513 org/tools/protparam 預(yù)測(cè) PsSERK2 的分子量和等電點(diǎn)；利用 http： /www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html 預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用 http： /www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 進(jìn)行信號(hào)肽分析；利用 Clustal W 軟件進(jìn)行同源性比較，利用 MEGA6.06 構(gòu)建 UPGMA 系統(tǒng)進(jìn)化樹。  1.4  Northern-blot 與實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析  提取低溫處理 0、 7、 14、 21 和 28 d 的牡丹花芽的 RNA，分別取 10 g RNA 樣品進(jìn)行 1.0%的甲醛變性電泳并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與設(shè)計(jì)的相應(yīng)特異性探針進(jìn)行雜交（引物 S 和 N 擴(kuò)增標(biāo)記，引物S： 5-TGTAGGTGACTTTGGGTTGG-3，引物 N： 5-CTAGGACCGGACAATTCGA-3） 。用 Northern- blot 試劑盒（ TotalBLOTTMNORTHERN KIT WITHOUT MEMBRANE， Ameresco）進(jìn)行免疫檢測(cè)，檢測(cè) PsSERK2 基因在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式。  實(shí)時(shí)定量 PCR 按照 TaKaRa 公司的 SYBRPremix DimerEraserTM（ Perfect Real Time）試劑盒說(shuō)明書操作。目的基因引物為 PsSERK2 F（ 5-GATGTCATGCTTCTCGATTGGG-3）和 PsSERK2 R（ 5-CTGACAACCTCCACCTTCTGC-3） 。以管家基因 Actin（ Actin F： 5-GAGAGATTCCGTTGC CCTGA-3； Actin R： 5-CTCAGGAGGAGCAACCACC-3）作為內(nèi)參。反應(yīng)程序?yàn)椋?95 變性 30 s，57 退火 30 s， 72 延伸 30 s， 40 個(gè)循環(huán)。 25 L 反應(yīng)體系： 2 SYBR Premix Ex Taq 12.5 L，上、下游引物（ 10 mol L-1）各 1.0 L， 2 L cDNA 模板，無(wú)菌水配齊。每個(gè)樣品 3 次技術(shù)重復(fù)。  1.5  牡丹花芽的組織細(xì)胞學(xué)觀察  取不同低溫處理期的牡丹花芽經(jīng) FAA 固定后，經(jīng)脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，進(jìn)行蘇木精染色，在 Novel N-108M 顯微鏡下觀察并拍照。統(tǒng)計(jì)花芽萼片、花瓣和雄蕊原基細(xì)胞分裂頻率。細(xì)胞分裂數(shù)是在切片中觀察到的處于有絲分裂前期、中期、后期及末期的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞分裂頻率（ %） = 細(xì)胞分裂數(shù) /細(xì)胞總數(shù)   100。  2  結(jié)果與分析  2.1  PsSERK2 全長(zhǎng) cDNA 序列的獲得及其生物信息學(xué)分析  以 RACE-ready-cDNA 為模板，進(jìn)行 5RACE 和 3RACE 擴(kuò)增，分別得到約 900 bp 和 2 000 bp片段（圖 1） 。  圖 1  PsSERK2 基因的 5RACE 和 3RACE 擴(kuò)增產(chǎn)物  Fig. 1  5RACE and 3RACE PCR products of PsSERK2 用 DNAMAN 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果和已知的序列進(jìn)行拼接，得到 2 374 bp 全長(zhǎng) cDNA 序列（圖 2） 。  Gao Xuekai， Zhang Yuxi， Liu Chunying， Dou Baolei， Gai Shupeng. Cloning of somatic embryogenesis receptor-like kinase gene PsSERK2 and cell division rate analysis during dormancy release in tree peony（ Paeonia suffruticosa） . 514                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 511 518. 圖 2  PsSERK2 全長(zhǎng) cDNA 序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列  起始密碼子和終止密碼子用黑體并下劃線標(biāo)示。  Fig. 2  Full length cDNA sequence of PsSERK2 and the putative amino acid sequence The initiation and termination codons were marked by bold font and underlined. 高學(xué)凱，張玉喜，劉春英，竇寶磊，蓋樹鵬  牡丹 SERK2 基因的克隆和花芽休眠進(jìn)程中細(xì)胞分裂頻率分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 511 518.                                                                                       515 5非編碼區(qū)（ UTR）為 158 bp， 3UTR 為 341 bp，開放閱讀框（ open reading frame， ORF）為 1 875 bp，編碼 625 個(gè)氨基酸。 ProtParam 分析其分子式為 C3080H4880N846O903S21，分子量為 78.883 kD，理論等電點(diǎn) pI 為 5.88； 不穩(wěn)定指數(shù)為 40.27， 推測(cè)該蛋白不穩(wěn)定。 親水性評(píng)估 Grand average of hydropathicity（ GRAVY） ： 0.204，表明其為親水性蛋白。該蛋白具有 1 個(gè)信號(hào)肽（ 1 25 aa） 、 3 個(gè) Leucine Rich repeats（ LRR， 25 65、 93 139 和 140 177 aa） 、 2 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（ 4 26 和 239 261 aa） 、 1 個(gè)SPP（ Ser-Pro-Pro， 216 218 aa）和胞內(nèi)激酶 Serine/Threonine Kinase 活性結(jié)構(gòu)域（ STK， 301 574 aa）等 SERK 的典型特征。由于其與 SERK2 相似性最高，故其并命名為 PsSERK2（ Genbank accession number： KY200849） 。  2.2  同源性分析和進(jìn)化樹構(gòu)建  利用 Clustal W 將 PsSERK2 編碼的氨基酸序列與已知其他的植物 SERK 蛋白進(jìn)行同源序列比對(duì)。PsSERK2 與葡萄 VvSERK2 蛋白同源性最高，為 92.95%，與山茶 CnSERK2 次之，為 90.06%，與擬南芥 AtSERK1 的最低，為 86.01%。  利用 MEGA6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 （圖 3） ， PsSERK2 蛋白與 SERK2 類蛋白聚為一支， SERK1類聚為另外一支。其中 PsSERK2 先與葡萄的并為同一分支，相似性最高，結(jié)果與同源性比對(duì)結(jié)果一致。  圖 3  PsSERK2 與已知其他植物的 SERK 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析  Fig. 3  Phylogenetic tree of PsSERK2 and the known SERKs proteins in other plants 2.3  PsSERK2 表達(dá)模式分析  實(shí)時(shí)定量 PCR 分析了 PsSERK2 在牡丹初花期（大風(fēng)鈴期）營(yíng)養(yǎng)器官根、莖（花梗） 、葉及花器官萼片、苞片、花瓣、雄蕊和心皮的表達(dá)量，結(jié)果（圖 4）表明 PsSERK2 在各器官中均有表達(dá)，但在莖中表達(dá)量最高，其次為心皮和雄蕊，根中也有較高的表達(dá)量，在萼片、苞片和花瓣中表達(dá)量相對(duì)較低，葉片中最低，在莖中的表達(dá)量約是葉片中的 70.9 倍。  牡丹在花初期葉片的生長(zhǎng)基本完成，花梗還會(huì)繼續(xù)伸長(zhǎng)，雄蕊和雌蕊繼續(xù)發(fā)育，并會(huì)萌發(fā)部分新根，這些生長(zhǎng)較旺盛的部位恰恰檢測(cè)較高的 PsSERK2 表達(dá)量，推測(cè) PsSERK2 具有促進(jìn)牡丹生長(zhǎng)發(fā)育的功能。  Gao Xuekai， Zhang Yuxi， Liu Chunying， Dou Baolei， Gai Shupeng. Cloning of somatic embryogenesis receptor-like kinase gene PsSERK2 and cell division rate analysis during dormancy release in tree peony（ Paeonia suffruticosa） . 516                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 511 518. 圖 4  PsSERK2 在牡丹初花期各組織中的表達(dá)量  Fig. 4  The relative expression level of PsSERK2 in different tissues at  the early stage of flowering 實(shí)時(shí)定量檢測(cè)了 PsSERK2 是否參與牡丹休眠解除進(jìn)程，結(jié)果（圖 5）表明，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)， PsSERK2 的表達(dá)量逐漸增高，低溫處理 14 d 后表達(dá)量達(dá)到最大值，之后逐漸降低，但與低溫 0 d 相比仍有所提高（ P < 0.05） 。  Northern-blot 檢測(cè)結(jié)果（圖 6）與熒光定量結(jié)果基本一致。  2.4  花芽休眠解除過(guò)程中萼片、花瓣和雄蕊原基細(xì)胞分裂頻率分析  統(tǒng)計(jì)了牡丹花芽在低溫解除休眠進(jìn)程中萼片原基、花瓣原基及雄蕊原基細(xì)胞分裂頻率的變化（圖 7） 。  隨著低溫累積量的增加，花芽?jī)?nèi)各原基細(xì)胞分裂頻率逐漸增高，處理之間差異顯著（ P < 0.05） 。其中萼片原基細(xì)胞分裂始終處于較低水平，可能與萼片分化程度高有關(guān)，雄蕊原基的分裂最旺盛。  圖 5  PsSERK2 在牡丹花芽休眠進(jìn)程中的表達(dá)分析  Fig. 5  Expression analysis of PsSERK2 during  dormancy release 圖 6  PsSERK2 在牡丹花芽休眠進(jìn)程中的 Northern-blot 分析  Fig. 6  Northern-blot of PsSERK2 during  dormancy release 高學(xué)凱，張玉喜，劉春英，竇寶磊，蓋樹鵬  牡丹 SERK2 基因的克隆和花芽休眠進(jìn)程中細(xì)胞分裂頻率分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 511 518.                                                                                       517 圖 7  牡丹花芽?jī)?nèi)原基細(xì)胞分裂頻率  Fig. 7  Cell division frequency of tree peony flower bud primordia 3  討論  植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生受體蛋白激酶（ SERK） ，參與調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育、抗性反應(yīng)等過(guò)程，被看作體胚發(fā)生的 Marker 基因（ Nolan et al.， 2011； Fan et al.， 2016） 。 SERK 結(jié)構(gòu)保守，具 LRR 結(jié)構(gòu)域、富含絲氨酸 -脯氨酸結(jié)構(gòu)域（ SPP） 、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶活性結(jié)構(gòu)域（ Aan den Toorn et al.， 2015） 。本研究中從休眠牡丹花芽中克隆了 SERK2 全長(zhǎng) cDNA， 生物信息學(xué)分析表明其具有完整的 SERK 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，因而能獨(dú)立完成信號(hào)的接收、跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)和胞內(nèi)傳遞，將其命名為 PsSERK2。  研究表明 SERK 具有表達(dá)的非特異性和分布的廣泛性，說(shuō)明 SERK 基因功能也是非特異的（ Ito et al.， 2005； Chen et al.， 2014； Shi et al.， 2014） 。在擬南芥胚性細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到 AtSERK1 大量表達(dá)（ Hecht et al.， 2001） ，而在水稻體細(xì)胞胚中并未檢測(cè)到 OsSERK1，意味著 OsSERK1 可能在非胚性組織內(nèi)起作用 （ Ito et al.， 2005） 。 Du 等 （ 2012） 發(fā)現(xiàn) AtSERK1 在擬南芥根維管組織高水平表達(dá)， serk1突變體導(dǎo)致根縮短，推測(cè)具有促進(jìn)根生長(zhǎng)和發(fā)育的功能。鴨茅 SERK 在莖頂端分生組織、胚根鞘和質(zhì)片的分生區(qū)域有較高的表達(dá)水平（ Somleva et al.， 2000） 。 Albrecht 等（ 2005）在擬南芥花藥中檢測(cè)到了 AtSERK1 高水平表達(dá)，推測(cè)其具有促進(jìn)花粉發(fā)育的功能。本研究結(jié)果表明牡丹 PsSERK2 在莖、心皮、雄蕊和根中具有較高的表達(dá)水平，與上述報(bào)道基本一致。這些部位是牡丹初花期（大風(fēng)鈴期）生長(zhǎng)較旺盛的部位，結(jié)合功能預(yù)測(cè)，推測(cè) PsSERK2 具有促進(jìn)細(xì)胞分裂生長(zhǎng)的功能。 Ma 等（ 2016）報(bào)道在鳳梨非胚性愈傷組織中， SERK1 可以被 24 h， 4 低溫誘導(dǎo)。本研究中通過(guò) Northern blotting 和 Real-time PCR 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，低溫累積可誘導(dǎo) PsSERK2 的表達(dá)。在休眠解除前隨著低溫累積的增加 PsSERK2 的表達(dá)量逐漸增加，休眠解除后（低溫 21 d）表達(dá)水平有所降低，因而， PsSERK2 在休眠解除中起正調(diào)控作用。 PsSERK2 具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)的作用。本研究的結(jié)果證明，低溫累積過(guò)程中，伴隨著 PsSERK2 表達(dá)量的增加，萼片、花瓣、雄蕊原基的細(xì)胞分裂頻率逐漸增加，推測(cè)低溫促進(jìn)了 PsSERK2 的表達(dá)而加速了休眠花芽的后發(fā)育，最終導(dǎo)致休眠解除。 References Aan den Toorn M， Albrecht C， Vries S D. 2015. 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