洋蔥S型細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因的挖掘及分子標(biāo)記開發(fā).pdf

園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 503 510. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0785； http： /www. ahs. ac. cn                                                  503 收稿日期 ： 2018 01 09； 修回日期 ： 2018 03 01 基金項(xiàng)目 ： 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 31301786， 31672165） ；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（ CARS-24-A-10） ；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（ 2017GNC10110） ；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目（ 2015YQN33）  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： ty_7163.com； wutta2014163.com）  洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因的挖掘及分子標(biāo)記開發(fā)  陳  立1,2，楊亞會1,2，霍雨猛2，劉冰江2，孫雨晴2,3，楊建平1，吳  雄2,*，楊妍妍2,*（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安  271018；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，濟(jì)南  250100；3吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長春  130118）  摘  要： 以洋蔥（ Allium cepa L.） S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系材料為試材，對洋蔥線粒體全基因組中的 58 個開放閱讀框（ ORF）進(jìn)行差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)了一個表達(dá)差異片段 orf393。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)，利用洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系的根，葉片，花莖以及花粉母細(xì)胞、四分體、單核花粉粒、成熟花粉粒等 4 個發(fā)育時(shí)期的花蕾對 orf393 進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析。結(jié)果表明： orf393 在洋蔥 S型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的根、葉片、花莖和 4 個發(fā)育時(shí)期的花蕾中均有表達(dá)，尤其是在四分體時(shí)期花蕾中表達(dá)量最高，之后恢復(fù)到營養(yǎng)生長時(shí)期的表達(dá)水平，但在保持系中未見其表達(dá)，這表明 orf393 是組成型表達(dá)，可能與洋蔥的花粉發(fā)育存在某種關(guān)聯(lián)。利用 orf393 在 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系之間的序列差異，開發(fā)了一個穩(wěn)定可靠的鑒別洋蔥細(xì)胞質(zhì)類型的 SCAR 分子標(biāo)記 GXX393。  關(guān)鍵詞： 洋蔥；細(xì)胞質(zhì)雄性不育； orf393；基因表達(dá)；分子標(biāo)記  中圖分類號： S 633.2        文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A        文章編號： 0513-353X（ 2018） 03-0503-08 Gene Discovery Related to S-type Male Sterility in Onion and Its Usage for Development of Molecular Marker CHEN Li1,2， YANG Yahui1,2， HUO Yumeng2， LIU Bingjiang2， SUN Yuqing2,3， YANG Jianping1， WU Xiong2,*， and YANG Yanyan2,*（1College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian， Shandong 271018， China；2Institute of Vegetables and Flowers， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China；3College of Horticulture， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）  Abstract： The differential expression of 58 open reading frames（ ORFs） identified in the intergenic sequence of the mitochondrial genome was analyzed using a male sterile line and a maintainer line of onion（ Allium cepa L.） ， through which， a differentially expressed fragment was obtained， designated as orf393. By quantitative real-time PCR， the temporal-spatial expression of orf393 was carried out in different tissues and organs， including roots， leaves， stalks， and the buds of different developmental stages （ pollen mother cells， tetrad， mononuclear， and matured pollen grains） . The results showed that orf393 was  Chen Li， Yang Yahui， Huo Yumeng， Liu Bingjiang， Sun Yuqing， Yang Jianping， Wu Xiong， Yang Yanyan. Gene discovery related to S-type male sterility in onion and its usage for development of molecular marker. 504                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 503 510. only expressed in the samples of the male sterile line； its expression could be detected in all samples of the male sterile line， especially the buds during the tetrad stage， which had the highest expression of orf393. The expression level of orf393 returned to the same level as that during the vegetative stage. Our results suggest that orf393 is constitutively expressed and may associate with the male sterility of onion. Based on the sequence difference of orf393 between the male sterile line and its maintainer line， we developed a reliable molecular marker， namely GXX393， for the identification of cytoplasm types of onion. Keywords： onion； cytoplasmic male-sterility； orf393； gene expression； molecular marker 細(xì)胞質(zhì)雄性不育（ Cytoplasmic male-sterility， CMS）是高等植物中的一種母性遺傳的不能產(chǎn)生有活力花粉的現(xiàn)象。利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育，可保證制種質(zhì)量和種子純度，因此廣泛用于雜交種的生產(chǎn)。洋蔥（ Allium cepa L.）是最早應(yīng)用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行雜交種選育的蔬菜作物，雖然現(xiàn)在已知的細(xì)胞質(zhì)類型有 S、 T 和 N 型 3 種，但是在實(shí)際育種中以 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育為主。 1936 年美國的 Jones 和 Emsweller（ 1936）首次在 Italian Red洋蔥品種群體中發(fā)現(xiàn)了 1 個雄性不育株（ 13-53） ，利用氣生鱗莖繁殖保存并與其他可育材料雜交、回交選育出了洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，不育性由不育的細(xì)胞質(zhì)（ S） 與 1 對隱性基因（ msms）共同控制，因此稱為 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育（ Jones & Clarke，1943） 。由于洋蔥是 2 年生異花授粉蔬菜，自交衰退嚴(yán)重，采用傳統(tǒng)育種方法選育洋蔥雄性不育系一般需要 4 8 年的時(shí)間（ Havey， 1995） ，而利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，可以大大提高洋蔥雄性不育系及其保持系的選擇效率。目前已有一些洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的報(bào)道。de Courcel 等（ 1989）首次開發(fā)出可以區(qū)分洋蔥 S 型與 M 型（ T 型、 N 型）細(xì)胞質(zhì)的 RFLP 標(biāo)記。Sato（ 1998）發(fā)現(xiàn)洋蔥線粒體 cob 基因的起始編碼上游區(qū)域（從 53 到 523）有一段葉綠體基因的插入，利用線粒體 cob 基因設(shè)計(jì)特異引物，通過 PCR 擴(kuò)增可對 S 型、 T 型和 N 型 3 種洋蔥細(xì)胞質(zhì)類型進(jìn)行快速鑒定，并推測其導(dǎo)致了洋蔥的細(xì)胞質(zhì)雄性不育，但是與該嵌合基因有關(guān)的生理生化過程還需要進(jìn)一步研究。 Kim 等（ 2009）在細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料中發(fā)現(xiàn)了 1 個嵌合基因 orf725，其 5端幾乎包含了 cox 基因的全長序列， 3端與細(xì)香蔥的 orfA501 同源，推測該嵌合基因可能是導(dǎo)致洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的候選基因，并利用 orf725 在 3 種洋蔥細(xì)胞質(zhì)類型（ S 型、 T 型、 N 型）中具有不同拷貝數(shù)，開發(fā)了一個能鑒定 3 種細(xì)胞質(zhì)類型的多重 PCR 分子標(biāo)記。李永博等（ 2015）開發(fā)了鑒定洋蔥細(xì)胞質(zhì)基因型的 SCAR 標(biāo)記， 該標(biāo)記可以避免因?yàn)樵囼?yàn)操作失誤和 PCR 的無效擴(kuò)增導(dǎo)致的錯誤分類。  眾多的研究結(jié)果表明植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育與線粒體基因異常有關(guān)（ Kaul， 1988； Hanson & Folkerts， 1992； Dragoeva et al.， 1998） 。本研究中利用已公開的洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系線粒體全基因組序列（ GenBank accession： KU318712） ，通過驗(yàn)證不育系和保持系中不育細(xì)胞質(zhì)線粒體基因組的 58 個 ORF 的表達(dá)差異，深入挖掘洋蔥的細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因，開發(fā)穩(wěn)定高效的鑒定細(xì)胞質(zhì)類型的分子標(biāo)記，豐富洋蔥的分子標(biāo)記輔助育種體系，為揭示洋蔥的細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理奠定基礎(chǔ)。  1  材料與方法  1.1  試驗(yàn)材料  試驗(yàn)材料為本課題組選育的 10 組洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（ CMS-S）及其相應(yīng)的保持系。陳   立，楊亞會，霍雨猛，劉冰江，孫雨晴，楊建平，吳   雄，楊妍妍 . 洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因的挖掘及分子標(biāo)記開發(fā) . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 503 510.                                                                                       505 2015 年 9 月 5 日于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所核心試驗(yàn)區(qū)播種， 10 月 25 日定植，選取四葉一心時(shí)期的葉片用于基因組總 DNA 的提取。 2016 年 5 月 20 日收獲洋蔥球， 10 月 18 日定植于采種棚， 2017 年 5 月下旬田間檢測花粉育性。選取洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 S118 和保持系 N218 的根， 葉片， 花莖以及花粉母細(xì)胞、 四分體、 單核花粉粒、 成熟花粉粒 4 個發(fā)育時(shí)期的花蕾用于總 RNA的提取，花蕾的分級參照吳海濤等（ 2010）的方法。  1.2  洋蔥總 RNA 的提取及 cDNA 的制備  洋蔥總 RNA 的提取參照孫亞玲等（ 2016）的方法，利用 DNase I（寶生物工程大連有限公司）去除基因組 DNA 的污染， 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)檢測 RNA 的濃度和質(zhì)量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser（寶生物工程大連有限公司）的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，利用總 RNA 為模板進(jìn)行 qRT-PCR 來判斷是否存在基因組 DNA 的污染。  1.3  實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分別以等量根、葉片、花莖和 4 個發(fā)育時(shí)期花蕾的 cDNA 為模板，在美國伯樂 CFX96 熒光定量 PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行 qRT-PCR，以 tubulin 作為內(nèi)參基因。 20 L 反應(yīng)體系包括 ddH2O 7 L， SYBRPremix Ex TaqTM（寶生物工程大連有限公司） 10 L，引物各 0.5 L，模板 2 L。反應(yīng)程序采用二步法，退火溫度為 60 。 orf393 的引物根據(jù) DNA 序列設(shè)計(jì)。 orf393-U： 5-ATGAAACGGCAGAATAA ACATCTT-3， orf393-D： 5-AAGCCGCTAAACTAAGCAGTGATG-3。內(nèi)標(biāo)引物參照 Huo 等（ 2012）的文獻(xiàn)， Tub-F： 5-GCCTTGAGCATGGGATTCAG-3， Tub-R： 5-GTGGAGAGGACACTGTTGTATGG-3。每個樣品進(jìn)行 3 次生物學(xué)重復(fù)。根據(jù) 2-CT法（ Bubner & Baldwin， 2004） ，原始數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算后采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以 P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。  1.4  洋蔥總 DNA 提取及 PCR 擴(kuò)增  洋蔥基因組總 DNA 采用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的快捷型植物基因組提取試劑盒提取，方法參照說明書。紫外分光光度計(jì)檢測 DNA 的濃度和質(zhì)量。  根據(jù) orf393 在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系中的差異序列設(shè)計(jì) SCAR 引物。 GXX-F1：5-CCCGAAGGAGTGACTTTTTCTGATTT-3和 GXX-R1： 5-TCTCTGGAGCACCGACTGAAGGG-3。PCR 擴(kuò)增采用 25 L 反應(yīng)體系，包括 ddH2O 9.5 L， 2 Taq PCR Master Mix 12.5 L， DNA 1 L，上述引物各 1 L。反應(yīng)程序?yàn)椋?95 預(yù)變性  5 min； 95 變性 30 s， 60 退火 30 s， 72 延伸 30 s，共 35 個循環(huán)； 72 后延伸 10 min； 4 保存。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。  2  結(jié)果與分析  2.1  洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育候選基因的挖掘  在已公開的洋蔥 CMS-S 線粒體全基因組序列（ GenBank accession： KU318712）中，發(fā)現(xiàn)了 58個新的 ORF。為了進(jìn)一步挖掘洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育候選基因，以洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 S118及其相應(yīng)保持系 N218 的 cDNA 為模板， 根據(jù) 58 個 ORF 的序列分別設(shè)計(jì)了 58 對引物進(jìn)行差異表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 58 個 ORF 中，有 52 個在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系中都表達(dá)且沒有明顯的差異， 5 個在不育系和保持系中均不表達(dá)，只有 1 個，即第 4 個 ORF 在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系的表達(dá)上存在明顯的差異（圖 1， S4、 N4） 。該 ORF 全長序列 1 179 bp，編碼 393 個氨Chen Li， Yang Yahui， Huo Yumeng， Liu Bingjiang， Sun Yuqing， Yang Jianping， Wu Xiong， Yang Yanyan. Gene discovery related to S-type male sterility in onion and its usage for development of molecular marker. 506                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 503 510. 基酸，命名為 orf393。由 圖 1 可以看出， orf393 只在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中擴(kuò)增出大小為 397 bp 的條帶，而保持系無此擴(kuò)增片段。  圖 1  58 個 ORF（ 1 58）在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 S118（ S）和保持系 N218（ N）中的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果  Fig. 1  Amplified product of 58 ORFs（ 1 58） in onion CMS-S S118（ S） and its maintainer line N218（ N）  M： DNA marker. 2.2  orf393 在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系中的時(shí)空表達(dá)分析  由圖 2 可以看出， orf393 在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的根、葉片、花莖和 4 個發(fā)育時(shí)期花蕾  中均有表達(dá)，只是在根和葉片中表達(dá)量較低，而在四分體時(shí)期的花蕾中表達(dá)量最高，之后恢復(fù)到營養(yǎng)生長時(shí)期的表達(dá)水平；在保持系中未見其表達(dá)。這表明 orf393 在不育系中是組成型表達(dá)，在保持系中不表達(dá)或表達(dá)量極低。  圖 2  orf393 在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 S118（ S）和保持系 N218 不同器官和花粉發(fā)育不同時(shí)期的相對表達(dá)  保持系 N218 不表達(dá) 。  Fig. 2  Relative expression quantity of orf393 in different organs and pollen development  stages of onion CMS-S S118（ S） and its maintainer line N218 Maintainer line N218 did not express. 陳   立，楊亞會，霍雨猛，劉冰江，孫雨晴，楊建平，吳   雄，楊妍妍 . 洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因的挖掘及分子標(biāo)記開發(fā) . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 503 510.                                                                                       507 圖 3  orf393 在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 S118（ S）和保持系N218（ N） DNA 中的擴(kuò)增結(jié)果  Fig. 3  The amplication product of orf393 in onion CMS-S  S118（ S） and its maintainer line N218（ N）  M： DNA marker. 2.3  orf393 在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系中的 DNA 序列分析  利用 orf393 的全長引物對洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 S118 和保持系 N218 的基因組DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果 S118 和 N218 均擴(kuò)增出大約 1 200 bp 的片段（圖 3） 。經(jīng)過測序和序列比對發(fā)現(xiàn)， orf393 在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中的擴(kuò)增片段大小為 1 179 bp，在保持系中的擴(kuò)增片段大小為 1 143 bp，一致性為 94.23%。與不育系相比， orf393 在保持系中缺失了 36 個堿基，并且有 29 個 SNP（圖 4） ，而且在保持系中的第 11 個 SNP 造成第 92 個氨基酸發(fā)生改變（ 274C T） ，并導(dǎo)致翻譯提前終止。  圖 4  洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 S118（ S）和保持系 N218（ N）中 orf393 的序列比對  Fig. 4  Alignment of orf393 sequences between onion CMS-S S118（ S） and its maintainer line N218（ N）  Chen Li， Yang Yahui， Huo Yumeng， Liu Bingjiang， Sun Yuqing， Yang Jianping， Wu Xiong， Yang Yanyan. Gene discovery related to S-type male sterility in onion and its usage for development of molecular marker. 508                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 503 510. 2.4  SCAR 標(biāo)記的開發(fā)  根據(jù) orf393 在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系中的差異序列，開發(fā)出鑒定洋蔥細(xì)胞質(zhì)基因型的 SCAR 標(biāo)記， 其擴(kuò)增引物為 GXX-F1 和 GXX-R1。 應(yīng)用該標(biāo)記對洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 S118及其相應(yīng)的保持系 N218 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果在不育系中擴(kuò)增出大小為 232 bp 的條帶，相應(yīng)的保持系中擴(kuò)增出大小為 196 bp 的片段（圖 5） ，將該標(biāo)記命名為 GXX393。  圖 5  GXX393 標(biāo)記對洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 S118（ S）及其保持系 N218（ N）的 PCR 擴(kuò)增  NTC：無模板對照。  Fig. 5  The PCR amplication product of GXX393 in onion CMS-S S118（ S） and its maintainer line N218（ N）  M： DNA marker； NTC： No template control. 2.5  SCAR 標(biāo)記 GXX393 在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系中的驗(yàn)證  為了驗(yàn)證標(biāo)記 GXX393 在洋蔥分子標(biāo)記輔助育種應(yīng)用中的可行性，利用本課題組選育的具有不同遺傳背景的已知細(xì)胞質(zhì)基因型的 10 個組合材料，每個組合材料取 10 株，進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證。結(jié)果如表 1 所示，所有的不育系中均擴(kuò)增出 232 bp 的條帶，而相應(yīng)的保持系中擴(kuò)增出 196 bp 的片段， PCR擴(kuò)增結(jié)果與田間判斷結(jié)果完全吻合。此結(jié)果表明該標(biāo)記可以應(yīng)用于洋蔥的細(xì)胞質(zhì)基因型的鑒別。  表 1  GXX393 標(biāo)記在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系中的單株驗(yàn)證結(jié)果  Table 1  Identification of GXX393 in individual plants of onion CMS-S and maintainer lines 材料類型  Material type 材料編號  Material code 細(xì)胞質(zhì)類型  Cytoplasm type GXX393 標(biāo)記 /bp Molecular marker 吻合率 /% Coincidence rate 黃皮 Yellow S226 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系  CMS-S 232 100 N227 保持系  Maintainer 196 100 S228 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系  CMS-S 232 100 N229 保持系  Maintainer 196 100 S230 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系  CMS-S 232 100 N231 保持系  Maintainer 196 100 S232 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系  CMS-S 232 100 N233 保持系  Maintainer 196 100 紅皮  Red S210 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系  CMS-S 232 100 N211 保持系  Maintainer 196 100 S212 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系  CMS-S 232 100 N213 保持系 Maintainer 196 100 S214 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系  CMS-S 232 100 N215 保持系  Maintainer 196 100 S216 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系  CMS-S 232 100 N217 保持系  Maintainer 196 100 S118 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系  CMS-S 232 100 N218 保持系  Maintainer 196 100 白皮  White S11 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系  CMS-S 232 100 N12 保持系  Maintainer 196 100 陳   立，楊亞會，霍雨猛，劉冰江，孫雨晴，楊建平，吳   雄，楊妍妍 . 洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因的挖掘及分子標(biāo)記開發(fā) . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 503 510.                                                                                       509 3  討論  在高等植物中，細(xì)胞質(zhì)雄性不育是一種普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象。迄今為止，已在近 47 個屬 140個種的物種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育現(xiàn)象（ Laser & Lersten， 1972） 。 Levings 和 Pring（ 1976）首次提出了線粒體 DNA（ mtDNA）是 CMS 有關(guān)基因的載體。 Kim 等（ 2009）在細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料中獲得了1 個命名為 orf725 的嵌合基因，其 5端幾乎包含了 cox 基因的全長序列， 3端與細(xì)香蔥的 orfA501同源，研究表明該基因在不育細(xì)胞質(zhì)（ S 型和 T 型）中表達(dá)，而在 N 型細(xì)胞質(zhì)中不表達(dá)，推測 orf725為洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育重要的候選基因。本試驗(yàn)的 RT-PCR 結(jié)果顯示，在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中， orf393 在花粉發(fā)育第 2 個時(shí)期即四分體時(shí)期的表達(dá)量最高，顯著高于花粉發(fā)育的其他 3 個時(shí)期和營養(yǎng)生長時(shí)期的表達(dá)水平，這說明四分體時(shí)期是小孢子敗育的關(guān)鍵時(shí)期，可能與洋蔥的 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育存在某種關(guān)聯(lián)。 orf393 是 1 個新的洋蔥特有的基因，而且在四分體時(shí)期的表達(dá)量顯著提高，這表明 orf393 也可能是洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的重要相關(guān)基因。有必要將 orf393 與 orf725 作為重要的洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育候選基因進(jìn)一步深入研究，通過遺傳互補(bǔ)試驗(yàn)等手段確定與洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的關(guān)系。  CMS 相關(guān)基因在不育植株中的表達(dá)有組織特異性表達(dá)，如菜豆的 orf239（ Abad et al.， 1995；Sarria et al.， 1999） ，還有組成型表達(dá)，如玉米的 urf13（ Von Allmen et al.， 1991） 。在洋蔥 S 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中， orf393 在根、葉片、花莖和花粉發(fā)育的 4 個時(shí)期均有表達(dá)，這表明 orf393 是組成型表達(dá)。之所以其作用的表型只存在于生殖器官表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)雄性不育， 而對營養(yǎng)器官沒有產(chǎn)生影響，一種原因可能是有未知的物質(zhì)存在于花粉的細(xì)胞器（線粒體或者葉綠體）中，這種物質(zhì)與orf393 相互作用改變細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)后產(chǎn)生細(xì)胞毒素，引起細(xì)胞死亡從而導(dǎo)致了細(xì)胞質(zhì)雄性不育。這一作用機(jī)制與玉米 T 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因 urf13 類似（ Flavell， 1974） ；另一原因可能是 orf393相關(guān)的蛋白被營養(yǎng)器官中的蛋白酶所降解，類似的作用機(jī)制在菜豆的細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orf239 的研究中已有報(bào)道（ Sarria et al.， 1999） 。關(guān)于 orf393 具體的作用機(jī)制，還需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行深入研究。  與洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系相比， orf393 在其保持系中缺失了 36 個堿基，利用該缺失開發(fā)了 1個穩(wěn)定可靠的鑒別洋蔥細(xì)胞質(zhì)類型的分子標(biāo)記 GXX393。通過簡單提取洋蔥的 DNA，經(jīng)過 PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖電泳后，得到 232 bp 片段的為 S 型細(xì)胞質(zhì)，擴(kuò)增出 196 bp 的為 N 型細(xì)胞質(zhì)。與大多數(shù)顯性標(biāo)記相比，該標(biāo)記可以有效地避免因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作失誤和 PCR 的無效擴(kuò)增而導(dǎo)致錯誤分類情況，使得鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠有效，在實(shí)際育種中具有重要的意義。  References Abad A R， Mehrtens B J， Mackenzie S A. 1995. Specific expression in reproductive tissues and fate of a mitochondrial sterility-associated protein in cytoplasmic male-sterile bean. Plant Cell， 7 (3)： 271 285. Bubner B， Baldwin I T. 2004. Use of real-time PCR for determining copy number and zygosity in transgenic plants. Plant Cell Reports， 23 (5)：263 271. de Courcel A G L， Ved el F， Boussac J M. 1989. DNA polymorphism in Allium cepa cytoplasms and its implications concerning the origin of onions. Theoretical and Applied Genetics， 77 (6)： 793 798. Dragoeva A， Atanassov I， Atanassov A. 1998. CMS due to tapetal failure in cybrids between Nicotiana tabacum and Petunia hybrida. Plant Cell Tissue and Organ Culture， 55 (1)： 67 70. Flavell R. 1974. A model for the mechanism of cytoplasmic male sterility in plants， with special reference to maize. Plant Science Letters， 3 (4)：Chen Li， Yang Yahui， Huo Yumeng， Liu Bingjiang， Sun Yuqing， Yang Jianping， Wu Xiong， Yang Yanyan. Gene discovery related to S-type male sterility in onion and its usage for development of molecular marker. 510                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 503 510. 259 263. Hanson M R， Folkerts O. 1992. Structure and function of the higher plant mitochondrial genome. International Review of Cytology， 141 (8)：129 172. Havey M J. 1995. Identification of cytoplasm using the polymerase chain reaction to aid in the extraction of maintainer lines from open-pollinated populations of onion. Theoretical and Applied Genetics， 90 (2)： 263 268. Huo Y， Miao J， Liu B， Yang Y， Zhang Y， Tahara Y， Meng Q， He Q， Kitano H， Wu X. 2012. The expression of pectin methylesterase in onion flower buds is associated with the dominant male-fertility restoration allele. Plant Breeding， 131 (1)： 211 216. Jones H A， Clarke A E. 1943. Inheritance of male sterility in the onion and the production of hybrid seed. Proceedings of American Society for Horticultural Science， 43： 189 194. Jones H A， Emsweller S L. 1936. A male sterile onion. Proceedings of American Society for Horticultural Science， 34： 582 585. Kaul M L H. 1988. Male sterility in higher plants. Berlin， Heidelberg： Springer-Verlag： 3 13. Kim S， Lee E T， Dong Y C， Han T， Bang H， Patil B S， Ahn Y K， Yoon M K. 2009. Identification of a novel chimeric gene， orf725， and its use in development of a molecular marker for distinguishing among three cytoplasm types in onion（ Allium cepa L.） . Theoretical and Applied Genetics， 118 (3)： 433 441. Laser R D， Lersten N R. 1972. Anatomy and cytology of microsporogenesis in cytoplasmic male sterile angiosperms. Botanical Review， 38 (3)：425 454. Levings C S， Pring D R. 1976. Restriction endonuclease analysis of mitochondrial DNA from normal and Texas cytoplasmic male-sterile maize. Science， 193 (4248)： 158 160. Li Yong-bo， Liu Bing-jiang， Huo Yu-meng， Miao Jun， Yang Jian-ping， Wu X